全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#$*"%*"&
&修改稿收到日期$
!"#$*"$*#!
基金项目$国家自然科学基金"
%#!)!+#
!
%")!#%1
#&教育部高等学校博士学科点专项科研基金"
!"#!++"+##""##
#
作者简介$唐
!
然"
#11(
#!男!在读博士研究生!主要从事牧草生物技术研究
2*34.5
$
640
7
840
!
/69,/:49,;<9,:0
"
通信作者$解新明!博士!教授!博士生导师!主要从事牧草生物技术及遗传资源研究
2*34.5
$
=.;=3>/
!
/:49,;<9,:0
华南象草
1
2
3!4
基因的亚细胞定位
及其在转基因烟草中的异源表达
唐
!
然!张博雅!彭小群!张向前!江
!
院!解新明"
"华南农业大学 林学与风景园林学院草业科学系!广东省草业工程技术研究中心!广州
$#"&+!
#
摘
!
要$该研究根据已克隆的华南象草"
!"##$%"&(
)
*
)
*"(:?,@94040
#肉桂醇脱氢酶"
ABC
#基因
!
)
+,-
的
:CDB
序列!构建亚细胞定位载体
E
BD$1"*!
)
+,-
!用
F2G
介导法转化象草原生质体!以探究
F
E
ABC
蛋白在细
胞内的定位&同时构建植物过表达载体
E
HB""!*!
)
+,-
!通过农杆菌介导法在烟草中异源表达!以研究
!
)
+,-
基
因与植物木质素合成的关系结果显示$"
#
#
F
E
ABC
定位在象草原生质体的细胞质内&"
!
#过表达载体
E
HB""!*
!
)
+,-
转化烟草后获得
!)
株转基因烟草!其中
!$
株
FAI
鉴定为阳性&"
%
#半定量
IJ*FAI
检测
&
株转基因烟草
后发现!
!
)
+,-
基因在不同植株的表达量存在差异!通过
KL96M;80
杂交检测后发现该差异与目的基因插入的拷
贝数有关&"
+
#
&
株转基因烟草和野生型烟草表型上没有明显差异!除目的基因多拷贝插入的植株
N2A&
外!木质素
含量有不同程度的提高!最高比野生型提高了
$&,$"O
研究表明!
F
E
ABC
是一个细胞质蛋白!在烟草中过表达
!
)
+,-
能够提高植株木质素含量!表明
!
)
+,-
基因参与了植物的木质素合成!可用于象草的木质素调控研究
关键词$华南象草&木质素&
!
)
+,-
&亚细胞定位&遗传转化&烟草
中图分类号$
P)1$
&
P)1
文献标志码$
B
$%&()%)*+,"*)#-*.#"/"01
2
3!40+"12)(
3
4*/.5+*66
"
1)//-5)#67
2
6(
2
6()67789%*/*/
#
*/!:.6
9(.(+")"
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3
+(66#"/#/=+*/6
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R
4
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F2DGS.4L
T
90
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Q@BDGS.40
7T
.40
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UVBDGW940
!
SV2S.03.0
7
"
"
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7
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R
40E
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!
KL96MAM.04B
7
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R
!
G940
7
7
20
7
.0;;8.0
7
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G940
7
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!
AM.04
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E
8;/;06/69<
R
!
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E
BD$1"*!
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9;0:;
LX!
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7
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E
M406
7
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"
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*
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E
M406
7
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E
8L6L
E
54/6/>
R
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!
466;3
E
6.0
7
6LX.
7
98;L966M;/9>:;595485L:45.\46.L0LXF
E
ABC
E
8L6;.0,B66M;/43;6.3;
!
6M;/;0/;?;:6L8
E
HB""!*!
)
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8;//;<.06L>4::L
>
R
,
.
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!
4.3.0
7
6L/69<
R
6M;8;546.L0/M.
E
>;6];;0!
)
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E
54065.
7
0.0>.L*
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R
06M;/./,JM;8;/956//ML];<6M46
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#
#
F
E
ABC]4/5L:46;<.06M;:
R
6L
E
54/3LX;5;
E
M406
7
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E
8L6L
E
54/6/,
"
!
#
!)6840/
7
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E
5406/];8;L>64.0;<4X6;86840/XL83;<].6ML?;8;=
E
8;//.L0?;:6L8
E
HB""!*!
)
3
+,-
!
LX]M.:M
!
$
E
5406/];8;.<;06.X.;<
E
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R
FAI,
"
%
#
JM;;=
E
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7
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E
5406/
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T
9406.646.?;IJ*FAI,JM;KL96M;80>5L6.0<.:46;<6M;;=
E
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7
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7
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"
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E
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)
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E
8;//;<
E
5406/40<].5<6
RE
;
!
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7
0.0:L06;06/];8;.0:8;4/;<.0?48
R
.0
7
<;*
7
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7
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7
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E
5406/;=:;
E
6N2A&,AL3
E
48;<].6M].5<6
RE
;
!
6M;34=.9343
E
5.X.:46.L0846;LX
5.
7
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R
<;3L0/646;<6M46F
E
ABC]4/4:
R
6L
E
54/3.:
E
8L6;.0,N?;8;=
E
8;/*
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)
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7
0.0:L06;06
!
]M.:M.0<.:46;<6M46!
)
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?L5?;.0
E
54065.
7
0.0>.L/
R
06M;/./40<.6:L95<>;4?4.54>5;XL88;
7
9546.L0LX;5;
E
M406
7
84//5.
7
0.0>.L/
R
06M;*
/./,
?(
@
A"+!6
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5.
7
0.0
&
!
)
+,-
&
/9>:;595485L:45.\46.L0
&
7
;0.6.:6840/XL8346.L0
&
6L>4::L
!!
木质素是一种复杂的三维高分子化合物!由松
柏醇(芥子醇和香豆醇
%
种单体聚合而成!与植物的
生长发育密切相关)#*!*!在维持植株机械强度!保证
水分和营养运输!提高生物与非生物胁迫方面起到
重要的作用)%*+*但是!由于木质素主要沉积于导管
细胞和维管束间的纤维细胞中!且结构复杂!难于降
解!在造纸工业中会造成大量的能源浪费和环境污
染)$*同时!木质素的存在还制约着木质纤维生物
质乙醇的转化!并且降低牧草的干物质消化率)&*)*
所以!植物木质素的调控研究成为热点
肉桂醇脱氢酶"
ABC
!
2A#,#,#,#$
#是木质素
合成代谢途径中的关键酶!催化木质素单体形成的
最后一步!并将醛类化合物转化为相应的醇类)1**
+,-
基因在植物体内以多基因家族的形式存在!通
常将控制木质素合成的
+,-
基因称为
HL04*X.<;
+,-
!而将其同系物称为
+,-*5.^;
基因)*#"*如水
稻"
5*
6
71%1&$81
#的
+,-
基因家族中有
#!
个成
员!而
HL04*X.<;+,-
基因只有
#
个!即
5%+,-!

5%+,-)
与水稻植株的茎秆强度有关!是唯一验证
了功能的水稻
+,-*5.^;
基因!而大多数
+,-*5.^;
基因的功能未知)##*#!*所以!在对
+,-
基因进行
调控的研究前!必须对其进行功能验证!这也是培育
木质化改良新品系的必经之路如今!在一些物种
中已经进行了
HL04*X.<;+,-
的调控研究!如下调
杨树"
!/
)
9%&*"(91_!/
)
9%1901
#的
+,-
基
因提高了木质素高聚物中醛基单元的组分!简化了
预处理条件!降低了造纸成本)#%*&沉默柳枝稷
"
!1#$2(8$*
.
1&(
#
+,-
基因降低了植株木质素
含量!改变了木质素组分!并提高了糖化效率)#+*&而
作为牧草的紫花苜蓿"
:";$21
.
/%1&$81
#在
+,-
基
因下调后干物质消化率明显提高)#$*降低植物木
质素含量的转基因研究一直在进行中!但是关于
+,-
基因调控的研究却很少!特别是在单子叶植
物中)#&*#)*
象草"
!"##$%"&(
)
*
)
*"(
#是一种优良的
A
+
禾本科牧草!广泛种植于热带与亚热带地区)#1*
由于其具有较好的适口性和营养品质!已成为中国
华南地区的重要牧草之一)#*除此之外!因其产量
高(生物量大(抗逆性强(热值高等特点!也常被用作
造纸原料和能源作物)!"*!#*所以!木质素的含量及
组分成为制约象草开发与利用的重要因素如今!
控制华南象草"
!<
)
*
)
*"(:?,@94040
#木质素
合成的
!
)
+,-
基因)*(
!
)
++=
"
+*
香豆酰辅酶
B
连接酶#基因)!!*和
!
)
++>
"肉桂酰辅酶
B
还原酶#
基因)!%*已成功克隆并经过了生物信息学分析!但都
缺乏体内及体外的表达分析研究
本研究构建
!
)
+,-
基因亚细胞定位载体和植
物表达载体!分别以华南象草原生质体和烟草
"
?$2/&$1#1&1012(
#作为转化媒介!研究
F
E
ABC
蛋白在细胞内的分布!以及
!
)
+,-
基因在烟草中
异源表达后植株木质素含量的变化!以验证
!
)
3
+,-
与木质素合成的关系!为象草的木质化改良研
究奠定基础
#
!
材料和方法
B,B
!
材
!
料
供试材料为华南象草"
!<
)
*
)
*"(:?,@94*
040
#!种植于华南农业大学牧草引种园烟草
"
?$2/&$1#1&1012(
#组培苗
%`!&
(根癌农杆菌
"
,
.
*/012&"*$(&("
@
12$"#%
#
2@B#"$
(大肠杆菌
"
A%2B"*$2B$12/9$
#
JL
E
#"
(植物表达载体
E
HB""!*%
_@B
(亚 细 胞 定 位 载 体
E
BD$1"
和
E
[JZ!*
3AM;88
R
由本实验室保存其中!
E
HB""!*%_@B
的植物筛选标记为
C1*
基因
E
BD$1"
和
E
[JZ!*
3AM;88
R
分别带有增强型绿色荧光蛋白"
;0M40:;<
7
8;;0X59L8;/:;06
E
8L6;.0
!
2GYF
#报告基因和红色
荧光蛋白"
3AM;88
R
#报告基因
B8C
!
总
DE>
提取与
FE>
合成
采用
J840/QL5[
E
Ja试剂盒"北京全式金生物科
技有限公司#提取华南象草幼叶总
IDB
!通过
#O
"
D
%
E
#琼脂糖凝胶电泳检测
IDB
完整性!并用微
量紫外分光光度计检测
IDB
纯度与浓度参照
J840/K:8.
E
6Y.8/6*/6840<:CDB K
R
06M;/./K9
E
;8
aVS
"北京全式金生物科技有限公司#使用说明书!
")"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
将提取的总
IDB
反转录为
:CDB
第一链
B,G
!
载体构建
根据已克隆的华南象草
!
)
+,-
基因
:CDB
序列"
G;0;H40^
登录号为
@P1+")"$
#
)

*
!设计
!
对
特异性引物
F
E
*K
E
;*Y
与
F
E
*K34*I
(
F
E
*S>4*Y
与
F
E
*H43*I
!分别带有
F
)
"
"
%
F(1
"
和
G01
"
%
C1(@
"
两组限制性酶切位点"引物序列见表
#
!下
同#以
J
%
B
克隆载体
E
aC#*J*!
)
+,-
为模版!
进行
FAI
扩增
F
E
*K
E
;*Y
与
F
E
*K34*I
引物组的
扩增产物纯化后!与亚细胞定位载体
E
BD$1"
经
F
)
"
"
和
F(1
"
双酶切后连接&
F
E
*S>4*Y
与
F
E
*
H43*I
引物组的扩增产物纯化后!与植物表达载体
E
HB""!*%_@B
经
G01
"
和
C1(@
"
双酶切后连
接
!
组连接产物经热激法转化大肠杆菌
JL
E
#"
!
挑选单菌落进行
FAI
和双酶切鉴定!挑选阳性菌落
扩繁后提取质粒并送测序
!
个载体的表达均由烟
草花叶病毒启动子"
A4ab%$K
#启动构建的表达
载体分别命名为
E
BD$1"*!
)
+,-
和
E
HB""!*!
)
3
+,-

B8H
!
华南象草
I
3
J>F
基因的亚细胞定位
B,H,B
!
原生质体的分离与纯化
!
华南象草原生质
体的分离与纯化参照水稻原生质体分离与纯化方
法)!+*并有改良取生长
#!<
的华南象草幼苗!在
+
c
条件下避光处理
#&M
!以幼苗第
#
片叶鞘上(下
$
:3
的幼嫩部位作为原生质体分离材料称取
",$
7
叶鞘!用手术刀片切成
",$33
细段并转入
",&
3L5
%
Z
甘露醇中浸泡
%"3.0
&将材料移入
#"3Z
酶
解液中!在
!1c
(遮光条件下
$"8
%
3.0
震荡酶解
+
M
酶解液组分为$
#,$O
"
D
%
E
#纤维素酶
I*#"
"
W4^956
!
U4
E
40
#(
",)$O
离析酶"
D
%
E
#
I*#"
"
W4^956
!
U4
E
40
#(
",$3L5
%
Z
甘露醇(
#"33L5
%
Za2K
)
!*
"
D*
吗啉#乙磺酸"
E
@$,1
#*(
#"33L5
%
ZA4A5
!
和
",#O
牛血清蛋白"
>L?.0;/;89345>93.0
!
HKB
#酶解结
束后用
!""
目不锈钢滤网过滤酶解产物混合液!残
渣用
#"3Z
预冷的
d$
溶液"
#$+33L5
%
ZD4A5
!
#!$ 33L5
%
Z A4A5
!
!
$ 33L5
%
Z A`5
!
! 33L5
%
Z
a2K
!
E
@$,)
#冲洗后进行第
!
次过滤&滤液于
%""
8
%
3.0
离心
$3.0
后吸出上清!加入
!3Z
预冷的
d$
溶液!轻悬沉淀!
#$"8
%
3.0
离心
!3.0
!移去上
清后再用
!3Z
预冷的
d$
溶液重复洗涤
!
#
%
次&
洗好的沉淀用
$""
$
Zd$
溶液悬浮!得到纯化的原
生质体
B,H,C
!
原生质体的转化
!
原生质体转化采用
F2G
介导法
#$"8
%
3.0
离心
!3.0
收集纯化好的原生
质体 后 用
aa
7
溶 液 "
",$ 3L5
%
Z
甘 露 醇!
#$
33L5
%
Za
7
A5
!
!
33L5
%
Za2K
!
E
@$,)
#重悬!使
原生质体终浓度达
!_#"
& 个%
3Z
取
!"
$
Z
构建
好的
E
BD$1"*F
E
ABC
重组质粒"
#"0
7
#加入
#""
$
Z
原生质体细胞中!混匀后加入
#"
$
Z
新鲜制备的
F2G
"
E
L5
R
;6M
R
5;0;
7
5
R
:L5
!
F2G
#溶液)
+"O
"
D
%
E
#
F2G +"""
!
",! 3L5
%
Z
甘 露 醇!
#"" 33L5
%
Z
A4A5
!
*!轻弹混匀!
1c
黑暗孵育
#$3.0
同时!为
了增加实验结果准确性!以空载体
E
[JZ!*3AM;88
R
为对照!将其与重组质粒
E
BD$1"*!
)
+,-
共转化
象草原生质体在共转化实验中!将
!
个质粒等质
量混合"总浓度
#"
#
#$0
7
#!并加入到
#""
$
Z
原生
质体细胞中孵育完成后!加入
#3Zd$
溶液!小
心颠倒混匀以终止反应
#$"8
%
3.0
离心
$3.0
后
移去上清!用
#3ZdV
溶液"
,$3L5
%
Z
甘露醇!
"
33L5
%
Z A`5
!
+33L5
%
Za2K
!
E
@$,)
#重悬!
1c
表
B
!
IJD
所用引物
J4>5;#
!
FAI
E
8.3;8/
名称
D43;
引物序列
F8.3;8/;
T
9;0:;
"
$e
#
%e
# 备注
I;348^
F
E
*K
E
;*Y GBAJBGJBJGGGABGAAJGGAGJA
构建载体
E
BD$1"*!
)
+,-
的上游引物
JM;XL8]48<
E
8.3;89/;E
BD$1"*!
)
+,-:L0*
/689:6.L0
F
E
*K34*I JAAAAAGGGGJJGAJAGGAGAAJAAGA
构建载体
E
BD$1"*!
)
+,-
的下游引物
JM;8;?;8/;
E
8.3;89/;E
BD$1"*!
)
+,-:L0*
/689:6.L0
F
E
*S>4*Y GAJAJBGBBJGGGABGAAJGGAGJAGGB
构建载体
E
HB""!*!
)
+,-
的上游引物
JM;XL8]48<
E
8.3;89/;E
HB""!*!
)
+,-:L0*
/689:6.L0
F
E
*H43*I AGGGBJAAABJGJJGAJAGGAGAAJAAG
构建载体
E
HB""!*!
)
+,-
的下游引物
JM;8;?;8/;
E
8.3;89/;E
HB""!*!
)
+,-:L0*
/689:6.L0
FHB*Y BJGAAJAJGAAGBABGJGGJ
E
HB""!*!
)
+,-
重组子检测上游引物
JM;XL8]48<
E
8.3;89/;.0406<;6;:6.L0
FHB*I GGGBBBJJAGBGAJABAJBG
E
HB""!*!
)
+,-
重组子检测下游引物
JM;8;?;8/;
E
8.3;89/;.0406<;6;:6.L0
HBI*Y AGBAJGAABGBBBAAABAGJ C1*
基因检测上游引物
JM;XL8]48<
E
8.3;89/;7
;0;<;6;:6.L0
HBI*I AJGABAABJAGJABBAABAJ C1*
基因检测下游引物
JM;8;?;8/;
E
8.3;89/;7
;0;<;6;:6.L0
B:6.0*Y GAJGJJJJJAAJBGJBJJGJJGGJA ,2&$#
基因检测上游引物
JM;XL8]48<
E
8.3;89/;7
;0;<;6;:6.L0
B:6.0*I BBJBAAJGJJGJBAGGAABAJG ,2&$#
基因检测上游引物
JM;8;?;8/;
E
8.3;89/;7
;0;<;6;:6.L0
#)"#
&
期
!!!!!!!
唐
!
然!等$华南象草
!
)
+,-
基因的亚细胞定位及其在转基因烟草中的异源表达
黑暗中静置培养过夜"
#!
#
#&M
#孵育完成后!
%""
8
%
3.0
离心
$3.0
收集细胞!用约
$"
$
ZdV
溶液重
悬后进行显微观察
B,H,G
!
显微拍照
!
2GYF
和
3AM;88
R
的激发波长
"最大吸收峰#分别为
+11
和
$1)03
!发射波长"最
大发射峰#分别为
$##
和
&#"03
转化后的原生质
体使用蔡司激光扫描共聚焦显微镜
)C[N
"
Q;.//
ZKAa)1"f)Z.?;
#进行观察和拍照!并用
Q;0
!"#!
软件进行进行图片处理
B8K
!
华南象草
1
2
3!4
基因在烟草中的异源表达
B8K8B
!
农杆菌转化
!
利用冻融法!将含有
!
)
+,-
基因的植物表达载体
E
HB""!*!
)
+,-
转化农杆菌
2@B#"$
感受态!铺板后挑单菌落进行
FAI
鉴定
选择阳性单菌落扩繁作为农杆菌侵染的种质液
B,K,C
!
烟草遗传转化
!
根据改良的叶盘法进行烟
草的遗传转化选择健康的烟草组培苗!无菌条件
下剪取叶片!剔除叶脉后切成
",$:3_",$:3
小
块!并接种于预培养培养基
aK*F
"
aKg",$3
7
%
Z
&*HBg",#3
7
%
ZDBB
#中预培养
%<
将含有
E
HB""!*!
)
+,-
载 体 的
2@B#"$
种 质 液!以
#h#""
比例扩繁至
NC
&""
为
",+
#
",$
!
$"""8
%
3.0
离心
$3.0
!收集菌体后用不含蔗糖的
#
%
!aK
培养
基重悬!使
NC
&""
为
",#
#
",!
烟草叶片结束预培
养后将其浸没于重悬液中!每
$3.0
晃动
#
次!
#$
3.0
后取出叶片!吸干多余菌液!于
aK*F
培养基中
黑暗下共培养
+1M
将共培养后的叶盘转入无菌
水中清洗
$3.0
!再转入含
$""3
7
%
ZA;X
的无菌水
中清洗
#"3.0
!再用无菌水清洗叶盘
%
#
+
次!尽可
能去除叶盘表面农杆菌用无菌滤纸吸干叶盘表面
水分!转入
aK*K
培养基"
aKg",$3
7
%
Z&*HBg
",#3
7
%
ZDBBg$3
7
%
ZH4/64g!""3
7
%
ZA;Xg
!""3
7
%
ZA48
#中进行筛选及分化培养每
!
周用
aK*K
培养基继代
#
次!待分化后的烟草无菌苗生
长至
%:3
时!转入
aK*I
"
aKg",!3
7
%
ZDBBg
#""3
7
%
ZJ.3;6.0
#培养基进行生根培养待根系
长成后移栽至温室!种植土壤为植物营养土!购自广
州市荣丰园艺公司!种植前将营养土(蛭石(河沙以
1h#h#
比例混合!并以
$""
7
%盆进行分配分化(
生根及移栽后的植物培养条件均为
!$c
(
#&M
光%
1M
暗培养
B8K8G
!
IJD
扩增和
$"%.4(+/
杂交
!
采用新型植物
基因组
CDB
试剂盒"康为世纪#提取烟草成熟叶片
CDB
!并用位于载体插入位点两端序列的引物
FHB*Y
和
FHB*I
进行
FAI
扩增!野生型植株为阴
性对照!含有目的片段的质粒作为阳性对照!反应体
系为$
!_H1
I
a4/6;8a.=
"康为世纪#
#"
$
Z
!
#"
$
3L5
%
Z
引物
FHB*Y
%
FHB*I
各
",$
$
Z
!
CDB
模板
#
$
Z
!
<<@
!
N1
$
Z
反应程序为$
$ c
预变性
$
3.0
&
$c
变性
%"/
!
$$c
退火
%"/
!
)!c
延伸
!
3.0
!
%"
个循环&
)!c
孵育
#"3.0
转基因烟草成
熟叶片总
IDB
提取和反转录方法同
#,!
!
IJ*FAI
以
:CDB
为模板!采用载体上的
C1*
基因进行引物
HBI*Y
%
HBI*I
检测!并以看家基因
,2&$#
引物
B:*
6.0*Y
%
B:6.0*I
扩增作为内参
FAI
反应体系中各
组分用量以及
FAI
反应程序与上述相同
KL96M*
;80
杂交通过地高辛标记检测试剂盒
%
"
IL:M;
#进
行!大量提取转基因烟草基因组
CDB
!用限制性内
切酶
J$#<
&
酶切
!+M
!
CDB
模板量为
#$
$
7
!并以
+"0
7
质粒
E
HB""!*!
)
+,-
经
G01
"
酶切后作为
对照用
C1*
基因标记探针!
KL96M;80
杂交中!探
针的标记(电泳(转膜(预杂交(杂交与显影等步骤均
按照说明书的步骤进行
B,K,H
!
木质素含量测定
!
待转基因烟草移栽
%
个
月后!利用溴乙酰法)!$*测定茎杆木质素总含量称
取
#
7
新鲜样品!用
$3Z$O
乙醇研磨粉碎!
$"""
8
%
3.0
离心
%"3.0
去除上清!用
$O
乙醇清洗沉
淀
%
次!再用乙醇
h
正己烷"
#h!
#清洗沉淀
%
次
将清洗后的沉淀置于烘箱中烘干至恒重取
%3
7
烘干样品放入小锥形瓶中!加入
$3Z!$O
"
E
%
E
#
B:H8
"溶于冰醋酸中#提取液于恒温水浴锅中!用玻
璃片盖住瓶口!
)"c
振动孵育
%"3.0
将液体"约
+3Z
#转入
#"3Z
容量瓶!依次加入
",3Z!3L5
%
ZD4N@
(
$3Z
冰醋酸(
",#3Z),$3L5
%
Z
盐酸羟
胺!定容至
#"3Z

!"""8
%
3.0
离心
)3.0
!吸取上
清测定
NC
!1"
值根据样品的
NC
!1"
!利用木质素标
准曲线回归方程求得样品木质素的浓度"
3
7
%
Z
#!并
计算样品木质素重量木质素总含量
i
木质素重
量%干燥样品重量"
O
#!实验结果重复
%
次数据利
用
2=:;5!"#%
软件进行统计整理!并用
KFKK#),"
进行邓肯式新复极差法"
CaIJ
#多重比较
!
!
结果与分析
C,B
!
载体构建与鉴定
以
E
aC#*J*!
)
+,-
为模板!经引物组
F
E
*
K
E
;*Y
与
F
E
*K34*I
扩增!得到含有起始密码子和终
止密码子的
!
)
+,-
片段!大小约
#,# >^
"图
#
#
该目的片段经过
F
)
"
"
和
F(1
"
双酶切后!与亚细
胞定位载体
E
BD$1"
连接!得到重组质粒
E
BD$1"*
!)"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
!)
+,-
!经酶切验证!
!
)
+,-
片段成功连接到载
体"图
#
#同样!以
E
aC#*J*!
)
+,-
为模板!经
引物组
F
E
*S>4*Y
与
F
E
*H43*I
扩增后得到约
#,#
>^
产物!与植物表达载体
E
HB""!*%_@B
相连"图
#
#!用
G01
"
和
C1(@
"
对重组质粒
E
HB""!*!
)
3
+,-
进行双酶切!能够切出约
#,# >^
目的片段"图
#
#最终经测序验证!得到含有目的片段
!
)
+,-
的
!
个载体
C8C
!
1
2
3!4
基因亚细胞定位
以
F2G
介导法将含有
2GYF
绿色荧光蛋白报
告基因的
E
BD$1"*!
)
+,-
转化到华南象草原生质
体中!通过激光共聚焦显微镜观察!叶绿体自发荧光
为参照!发现原生质体细胞质中有绿色荧光信号"图
!
!
B
#!表明
F
E
ABC
蛋白可能定位在细胞质中为
进一步验证结果!将带有红色荧光蛋白
3AM;88
R
的
E
[JZ!*3AM;88
R
空载体和
E
BD$1"*!
)
+,-
同时
图
#
!
目的片段
!
)
+,-
的克隆与载体构建后的双酶切鉴定
a,CZ!"""
&
#,
含有酶切位点
F
)
"
"
和
F(1
"
的
!
)
+,-
基因目的片段&
!,
含有酶切位点
G01
"
和
C1(@
"
的
!
)
+,-
基因目的片段&
%,
E
BD$1"*!
)
+,-
双酶切鉴定&
+,
E
HB""!*!
)
+,-
双酶切鉴定
Y.
7
,#
!
A5L0.0
7
LX648
7
;6X84
7
3;06!
)
+,-40<;0R
3;<.
7
;/6.L0.<;06.X.:46.L04X6;8?;:6L8:L0/689:6.L0
a,CZ!"""
&
#,J48
7
;6X84
7
3;06LX!
)
+,-M48>L8.0
7
F
)
"
"
40"
8;/68.:6.L0/.6;/
&
!,J48
7
;6X84
7
3;06LX!
)
+,-M48>L8.0
7
G01
"
40"
8;/68.:6.L0/.6;/
&
%,I;/68.:6.L0
<.
7
;/6.L0LX
E
BD$1"*!
)
+,-
&
+,I;/68.:6.L0<.
7
;/6.L0LX
E
HB""!*!
)
+,-
图
!
!
F
E
ABC
蛋白的亚细胞定位
B,
E
BD$1"*!
)
+,-
在象草原生质体的瞬时表达&
H,
E
BD$1"*!
)
+,-
和
E
[JZ!*3AM;88
R
在象草原生质体的共转化&
GYF,
绿色荧光蛋白信号&
AM5L8L
E
M
R
5,
叶绿体自发荧光&
3AM;88
R
,
红色荧光蛋白信号&
H8.
7
M6,
明场&
a;8
7
;<,
左边所有图片的叠加
Y.
7
,!
!
K9>:;595485L:45.\46.L0LXF
E
ABC
E
8L6;.0
B,J840/.;06;=
E
8;//.L0LX
E
BD$1"*!
)
+,-.0!<
)
*
)
*"(
E
8L6L
E
54/6/
&
H,AL*;=
E
8;//.L0LX
E
BD$1"*!
)
+,-
40<
E
[JZ!*3AM;88
R
.0!<
)
*
)
*"(
E
8L6L
E
54/6/
&
GYF,K.
7
045LX
7
8;;0X59L8;/:;06
E
8L6;.0
&
AM5L8L
E
M
R
5,AM5L8L
E
M
R
5496L*
X59L8;/:;0:;
&
3AM;88
R
,K.
7
045LX8;E
8L6;.0
&
H8.
7
M6,H8.
7
M6X.;5<
&
a;8
7
;<,N?;854
EE
.0
7
LX455;X6
E
ML6L/
%)"#
&
期
!!!!!!!
唐
!
然!等$华南象草
!
)
+,-
基因的亚细胞定位及其在转基因烟草中的异源表达
图
%
!
转基因烟草植株的
FAI
检测
a,CZ!"""
&
N2A#
#
N2A!),
转基因烟草植株
#
#
!)
&
dJ,
野生型植株"阴性对照#&
A`
g
,
E
HB""!*!
)
+,-
质粒"阳性对照#&下同
Y.
7
,%
!
FAI4//4
R
/LX?<&1012(6840/
7
;0.:
E
5406/
a,CZ!"""
&
N2A#(N2A!),?<&1012(6840/
7
;0.:
E
5406/DL,#(!)
&
dJ,d.5<6
RE
;
"
D;
7
46.?;:L068L5
#&
A`
g
,F54/3.E
HB""!*!
)
+,-
"
FL/.6.?;:L068L5
#&
JM;/43;4/>;5L]
转化到华南象草原生质体中!在共转化后的细胞中
检测到大面积红色荧光信号!但是绿色荧光信号只
在除了细胞膜和叶绿体的部分检测到"图
!
!
H
#!说
明
F
E
ABC
是细胞质蛋白
C8G
!
1
2
3!4
基因在烟草中的过表达
C8G8B
!
转基因烟草的
IJD
检测
!
本研究共得到
!)
株转基因烟草植株!移栽
+
周后!提取成熟叶片
CDB
!并用位于载体插入位点两端引物
FHB*Y
和
FHB*I
进行
FAI
扩增结果表明"图
%
#!
!)
株转
基因烟草中除了
N2A1
和
N2A!#
外!其余
!$
株都
能扩增出与对照大小相同的片段!但是
N2A#
(
N2A!
(
N2A%
(
N2A#+
(
N2A#)
(
N2A!+
和
N2A!)
的
扩增条带丰度较低!可能是由于含有目的基因的农
杆菌以内生菌的形式存在于烟草植株内造成的假阳
性现象!也可能是因为
CDB
模板浓度较低造成
除此之外的
#1
个转基因烟草
CDB
都能扩增出期
望大小的目的条带!而野生型
dJ
不能扩增出条
带!证明
!
)
+,-
基因整合到了烟草基因组中
C8G8C
!
转基因烟草
D=LIJD
和
$"%.4(+/
杂交检测
!
挑选
&
个
FAI
阳性植株
N2A+
(
N2A&
(
N2A#!
(
N2A#$
(
N2A#&
和
N2A!$
进行
IJ*FAI
检测!在转
录水平上检测转基因烟草中目的基因的表达量!并
以看家基因
,2&$#
作为内参!分析目的基因在不同
转基因植株之间表达水平的差异
IJ*FAI
鉴定结
果"图
+
!
B
#显示!
N2A&
反转录不能扩增出目的条
带!而
N2A#!
条带丰度最高!说明该植株的目的基
因表达水平最高同理!
N2A!$
表达水平最低!而
N2A+
(
N2A#$
(
N2A#&
都有目的基因的表达!但表
达水平略低于
N2A#!
用
C1*
基因探针对该
&
个
植株进行
KL96M;80
杂交后发现"图
+
!
H
#!所有烟草
植株都能杂交出目的条带!进一步证明目的基因存
在于转基因烟草中其中!
N2A+
(
N2A#!
(
N2A#$
和
N2A#&
只有
#
条杂交带!说明目的基因以单拷贝
图
+
!
转基因烟草植株
IJ*FAI
"
B
#和
KL96M;80
杂交检测"
H
#
B,
转基因植株
IJ*FAI
检测&
H,
转基因植株
KL96M;80
杂交$
4
#-
,KL96M;80
杂交条带
Y.
7
,+
!
IJ*FAI4//4
R
/
"
B
#
405L6
"
H
#
LX?<&1012(6840/
7
;0.:
E
5406/
B,IJ*FAI4//4
R
/LX6840/
7
;0.:
E
5406/
&
H,KL96M;80>5L6LX6840/
7
;0.:
E
5406/
$
4
#-
,@
R
>8.<.\46.L0X84
7
3;06/LXKL96M;80>5L66.0
7
的形式整合进烟草基因组中&而
N2A&
有
+
个杂交
带!
N2A!$
有
!
个杂交带!说明目的基因在这
!
个
烟草植株中以多拷贝的形式存在结合
IJ*FAI
结果!
N2A&
没有目的基因表达和
N2A!$
表达量低
的原因可能是由于目的基因的多拷贝插入
C,G,G
!
转基因烟草木质素含量测定
!
&
个转基因
烟草植株的形态与对照相比没有明显差异"图
$
!
B
#!说明在烟草中过表达
!
)
+,-
不影响植株表
型测定该
&
个植株茎秆木质素含量"图
$
!
H
#!
N2A#$
木质素含量最高!占样品干重
%#,#)O
!比野
生型植株木质素含量"
#,#O
#提高了
$),$"O
!且
差异显著"
!
$
","$
#&
N2A+
(
N2A#!
(
N2A#&
和
N2A!$
木质素含量与对照相比也有不同程度的提
+)"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
转基因烟草表型"
B
#与木质素含量测定"
H
#
B,
转基因烟草表型&
H,
溴乙酰法木质素含量测定!数据为木质素含量平均值
j
标准误&数值后
不同小写字母表示材料间差异达显著水平"
!
$
","$
#
Y.
7
,$
!
FM;0L6
RE
;/LX?<&1012(6840/
7
;0.:
E
5406/
"
B
#
40<<;6;83.046.L0LX5.
7
0.0:L06;06
"
H
#
B,FML6L/LX?<&1012(6840/
7
;0.:
E
5406/
&
H,Z.
7
0.0:L06;06<;6;83.0;<>
R
4:;6
R
5>8L3.<;3;6ML<
&
B5<464];8;6M;3;40?459;/LX5.
7
0.0:L06;06j/640<48<;88L8
&
C.XX;8;065;66;8/4X6;8
6M;093>;8/<;0L6;6M466M;<.XX;8;0:;.//.
7
0.X.:40:;43L0
7
346;8.45/
"
!
$
","$
#
高!分别提高了
+$,%!O
(
!1,%+O
(
%$,)O
和
+$,")O
但是!
N2A&
木质素含量只占样品干重
#1,)O
!与对照相比差异不显著结合
IJ*FAI
和
KL96M;80
杂交结果!推断可能是
N2A&
中
!
)
3
+,-
基因的多拷贝抑制表达而造成的以上结果
表明!
!
)
+,-
基因在烟草中的过量表达会在一定
程度上提高植株木质素含量!也表明了
!
)
+,-
基
因参与了植物木质素的合成
%
!
讨
!
论
G8B
!
I
3
J>F
蛋白定位于细胞质
通过原生质体为受体的瞬时表达系统!能够快
速高效分析基因在植物细胞水平的表达特性!对蛋
白质定位(蛋白质互作以及蛋白质动态变化分析有
十分重要的意义)!+*蛋白质的亚细胞定位是理解
植物的形态建成和生长发育的主要手段之一!同时
也是功能基因组学的重要内容)!&*在本研究中!
F
E
ABC
蛋白与
GYF
组成的融合蛋白定位在原生质
体细胞质中!说明
F
E
ABC
是一个细胞质蛋白通
常情况下!植物基因的定位信息存在于自身编码的
某段氨基酸序列中!蛋白合成后再由精确的导向机
制定位到细胞的特定位置)!)*
F
E
ABC
蛋白通过分
子生物学预测后推断是一个没有定向序列的非分泌
蛋白!而且预测定位于细胞质中)*!与本研究实际定
位结果一致但在孝顺竹"
C1(0%1(9&$
)
9"K
#的
亚细胞定位研究中却发现
ABC
蛋白只定位于洋葱
表皮细胞的细胞核中)!1*!这可能是因物种差异造成
的同时!孝顺竹的
ABC
蛋白在洋葱表皮细胞表
达!属于异源表达!而
F
E
ABC
蛋白的转化受体就是
象草的原生质体!这可能也是造成定位差异的原因
G8C
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1
2
3!4
基因在烟草中过表达提高了植株木质
素含量
在烟草的遗传转化研究中!共得到了
!)
株转基
因烟草!其中
!$
株为
FAI
鉴定的含有目的片段
!
)
+,-
的阳性植株!并选
&
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行后续实验半定量
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检测发现该
&
个植
株
!
)
+,-
基因在叶片中的表达量有明显差异!
KL96M;80
杂交检测发现目的基因为多拷贝插入时
基因几乎不表达"如
N2A&
#而当插入片段为单拷
贝时!目的基因表达量较高"如
N2A#!
#!这也进一
步证实了在转基因研究中基因多拷贝插入造成的沉
默现象)!*一般认为!转基因植株中目的基因的插
入拷贝数和基因表达量呈负相关)%"*!本研究结论与
之相同
在本研究中!
!
)
+,-
基因在烟草中的过表达
没有造成植株的表型变化!这与前人研究结果一
致)%#*通过溴乙酰法测定转基因植株木质素含量
后发现!
IJ*FAI
检测
!
)
+,-
基因表达的植株中!
$)"#
&
期
!!!!!!!
唐
!
然!等$华南象草
!
)
+,-
基因的亚细胞定位及其在转基因烟草中的异源表达
木质素含量有不同程度提高其中!
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植株茎
杆木质素含量最高!比野生型提高了
$),$"O
!最低
的
N2A#!
植株也提高了
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孝顺竹
+,-
基
因在水稻中过表达后发现!所有转基因植株木质素
含量平均增幅达
$"O
)
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*
!与本研究结果类似但
是!腊梅"
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*1"2/K
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+,-
基因在烟草
中过表达后!木质素含量最高只比对照提高了
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)
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*
同样!银合欢"
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+,-
基因转化烟草后!木质素含量最高只提高
了
),+%O
)
%!
*
造成这种差异的原因有很多!首先!
这与木质素的测定方法和测定时期有关)%%*&其次!
木质素合成是一个复杂的过程!植物不同组织(器官
和细胞内存在一个复杂而完善的代谢网络!且代谢
的补偿机制不同)%+*&最后!可能是由于单子叶和双
子叶植物
+,-
基因对木质素合成的贡献差异造成
的)#"*!象草和孝顺竹同属于单子叶植物!而腊梅和
迎合欢属于双子叶植物当然!具体原因需要进一
步实验证实
HL04*X.<;+,-
基因被认为直接参与了木质素
的合成!先前的生物信息学分析推断
!
)
+,-
基因
是一个
HL04*X.<;+,-
基因)*!本研究进一步证明
了
!
)
+,-
确实与植物的木质素合成有关!说明
!
)
+,-
基因可以用于培育象草木质化改良新品种
的研究但是!
+,-
基因家族成员众多!而大部分
+,-*5.^;
基因的功能未知)1!#"*有研究表明部分
+,-*5.^;
基因在
HL04*X.<;+,-
基因缺失后表达
量上调!补偿了木质素合成的功能!说明某些
+,-*
5.^;
基因可能也参与了木质素的合成)%$*所以!在
进行木质素下调研究时!最好能够分析
+,-
基因
家族中各成员的功能与关系!这样才能达到有效调
控木质素合成的目的
参考文献!
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