全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(３): ２９７￣３０６(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０６￣２４ꎻ 修回日期: ２０１５￣０１￣０６
基金项目: 转基因生物新品种培育科技重大专项 ( ２０１３ＺＸ０８００１￣００２ꎻ ２０１３ＺＸ０８００９￣００４)ꎻ高等学校博士学科点专项科研基金
(２０１２３７０２１１００１４)ꎻ国家自然科学基金资助项目(３０９０００５０)ꎻ山东省泰山学者建设工程专项
通讯作者: 储昭辉ꎬ教授ꎬ主要从事病原微生物与植物互作研究ꎻ Ｔｅｌ:０５３８￣８２４９９１３ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｃｈｕ＠ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
丁新华ꎬ教授ꎬ主要从事病原微生物与植物互作研究ꎻ Ｔｅｌ:０５３８￣８２４５５６９ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｘｈｄｉｎｇ＠ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
共同第一作者: 巨延虎ꎬ男ꎬ山东聊城人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事为分子植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｕｙａｎｈｕ＠１６３.ｃｏｍ
杨 旸ꎬ女ꎬ山东聊城人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事为分子植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｋａｔｈｅｒｉｎｅ５２３＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０３.００９
过表达嗜热毛壳菌 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ基因提高
转基因水稻对 ３种病害的抗性
巨延虎＃ꎬ 杨 旸＃ꎬ 孔令广ꎬ 李多川ꎬ 丁新华∗ꎬ 储昭辉∗
(作物生物学国家重点实验室 /山东省农业微生物重点实验室ꎬ山东农业大学植物保护学院ꎬ泰安 ２７１０１８)
摘要:超氧化物歧化酶(Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎬ ＳＯＤꎬ ＥＣ１.１５.１.１)是生物体中清除氧自由基、保护细胞免受氧化损害的关键
保护酶之一ꎬＳＯＤ活性的提高可以增加植物对各种不良环境的适应和耐受能力ꎮ 本研究将一个源自嗜热毛壳菌(Ｃｈａｅｔｏ￣
ｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍꎬ Ｃｔ)的 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ基因 ＣｔＳＯＤ通过农杆菌介导的遗传转化方法转入水稻ꎬ转基因植株的 ＳＯＤ活性均
得到显著提高ꎮ 对转基因植株分别接种水稻白叶枯病、细菌性条斑病以及纹枯病的病原ꎬ发现过量表达 ＣｔＳＯＤ能够显著提
高转基因植株对 ３种病害的抗性ꎮ 这种对多种病害具有抗性的单个基因在植物抗病育种中具有重要应用价值ꎮ
关键词:超氧化物歧化酶ꎻ 细菌性条斑病ꎻ 白叶枯病ꎻ 纹枯病
Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅ￣
ｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｒｅｅ ｍａｊｏｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ　 ＪＵ Ｙａｎ￣ｈｕꎬ ＹＡＮＧ Ｙａｎｇꎬ ＫＯＮＧ
Ｌｉｎｇ￣ｇｕａｎｇꎬ ＬＩ Ｄｕｏ￣ｃｈｕａｎꎬ ＤＩＮＧ Ｘｉｎ￣ｈｕａꎬ ＣＨＵ Ｚｈａｏ￣ｈｕｉ 　 (Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｂｉｏｌｏｇｙ / Ｓｈａｎｄｏｎｇ
Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉａｎ
２７１０１８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅｓ (ＳＯＤ) ｐｌａｙ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓｅｓ. Ｍａｎｙ
ｓｔｕｄｉｅｓ ｈａｖｅ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｍａｎｙ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔｓ. Ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＯＤ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｈａｒｍｆｕｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｉｔ ｗａｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅｉｒ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｍａｊｏｒ ｒｉｃｅ ｄｉｓｅａｓｅｓꎬ
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔꎬ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋ ａｎｄ ｒｉｃｅ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ. Ｔｈｉｓ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖａ￣
ｒｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎻ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋꎻ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔꎻ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ
中图分类号: Ｓ４３２.１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０３￣０２９７￣１０
　 　 水稻(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)是我国最主要的粮食作物
之一ꎬ由 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ(Ｘｏｃ)引
起的细菌性条斑病(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋ)和由 Ｘａｎ￣
ｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ(Ｘｏｏ)引起的白叶枯病
(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ)是水稻上 ２种最主要的细菌性病
害ꎬ在我国的华南、华中和华东地区ꎬ以及东南亚稻
区和非洲稻区均有发生ꎬ适宜条件下这两大病害可
同时大面积发生ꎬ危害严重[１ꎬ ２]ꎮ 由立枯丝核菌
　
植物病理学报 ４５卷
(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋüｈｎ)引起的水稻纹枯病(Ｒｉｃｅ
ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ)是近年来蔓延较快的真菌病害ꎬ其发
病范围和面积已经超越稻瘟病ꎬ成为水稻第一大病
害[３￣６]ꎮ 培育抗病品种是防治水稻病害最经济有效
的途径ꎬ这在白叶枯病的防治上效果显著ꎮ 目前已
经从水稻栽培品种及野生种质中鉴定了 ３７个主效
白叶枯病抗性基因ꎬ并通过杂交的方法将部分基因
以单基因或多基因聚合的形式转移到常规水稻品
种或杂交稻亲本ꎬ在生产上得到广泛应用并取得良
好的防治效果ꎬ水稻白叶枯病已经从高发常发态势
转为零星发生[７ꎬ ８]ꎮ 另一方面ꎬ有关水稻对白叶枯
病数量性状基因的研究以及抗病相关基因的研究
也取得进展ꎬ为基因工程育种防治该病积累了基因
资源[８]ꎮ 相比白叶枯病ꎬ水稻中针对细菌性条斑
病及纹枯病的可利用抗性资源还十分匮乏ꎬ这 ２ 种
病害还主要依赖于化学防治ꎮ 对水稻细菌性条斑
病而言ꎬ目前仅从部分耐病品种中鉴定了 ８个数量
遗传位点与少数抗病相关基因[２ꎬ ９ꎬ １０]ꎬ而主效抗病
基因仅从部分玉米材料中鉴定了一个非寄主抗水
稻细菌性条斑病基因 Ｒｘｏ１[１１]ꎮ 至于对纹枯病的
抗性改良ꎬ尚未发现对该病害免疫的水稻品系ꎬ高
抗的材料也较匮乏ꎬＱＴＬ(ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓꎬ数
量性状基因座)效应较小ꎬ迄今植物来源的抗纹枯
病相关基因也仅报道 ５ 例[１２~１４]ꎮ 通过对 ３ 种病害
抗病相关基因的功能研究ꎬ发现 ３种病害间抗病信
号途径既存在两两间的交叉重叠ꎬ也存在个体差异
性[８ꎬ １３ꎬ １４]ꎮ 单一抗病相关基因对 ３ 种病害同时存
在抗性尚未见报道ꎮ
　 　 超氧化物歧化酶 ( Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎬ
ＳＯＤꎬ ＥＣ１.１５.１.１)是细胞内的重要抗氧化酶ꎬ几乎
参与了生物体中所有对抗各种环境胁迫的生理生
化反应ꎬ其活性与植物抗逆性密切相关[１５]ꎮ ＳＯＤ
通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应ꎬ将其转
变为过氧化氢和氧气ꎬ清除机体代谢过程中产生的
过多自由基ꎬ从而减轻超氧阴离子自由基对膜结构
及其功能的破坏ꎮ 相关研究表明ꎬ植物遭受病原物
侵染时通过活性氧爆发来限制病原菌的增殖ꎬ而
ＳＯＤ则在降低活性氧爆发程度、减轻活性氧对植
物伤害方面具有重要作用[１６]ꎮ ＳＯＤ 按其结合金
属离子的不同可分为 ３ 类 :Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ、Ｍｎ￣ＳＯＤ
和 Ｆｅ￣ＳＯＤꎮ 其中 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ 是活性氧清除系统
中最重要的酶ꎬ研究表明植物体内 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ 活
性的提高可以增强其对逆境胁迫的抵抗能
力[１７ꎬ １８]ꎮ ２０１１年 Ｚｈａｎｇ 等[１９]克隆了嗜热毛壳菌
中的一个 ＣｔＣｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ 基因ꎬ在酵母中表达该基
因增强了酵母对盐、百草枯、甲萘醌等多种非生物
胁迫的抵抗能力ꎬ暗示 ＳＯＤ 基因的持续表达提高
了酵母的抗逆能力ꎬ但其在作物上抵御生物胁迫的
能力尚未见研究报道ꎮ
　 　 本研究将来自 Ｚｈａｎｇ 等[１９]克隆的嗜热毛壳菌
的 ＣｔＣｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ ( 简 称 ＣｔＳＯＤ ) ( ＧｅｎＢａｎｋ:
ＤＱ４９３７６０.１)在水稻中过量表达ꎬ并分析了转基因水
稻对 ３ 种主要病害的抗病性ꎬ证明过量表达外源
Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ基因能够提高水稻抵御生物胁迫能力ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 ＣｔＳＯＤ的扩增与载体构建
　 　 以携带 ＣｔＳＯＤ 基因全长 ｃＤＮＡ 的质粒 ＤＮＡ
为模板ꎬ用添加酶切位点接头的引物 ＣＺ１Ｆ 和
ＣＺ１Ｒ (ＣＺ１Ｆ:５′￣ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＣＴ
ＧＴＴＧＣＴＧＴＣＧＴ￣３′ꎻ ＣＺ１Ｒ: ５′￣ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴ
ＡＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＣＣＡＡＴＡＡＣ￣３′ꎮ 下划线是添加
Ｋｐｎ Ｉ 和 ＢａｍＨ Ｉ 酶切位点)进行高保真 ＰＣＲ 扩
增ꎮ 反应体系: １０ ｎｇ 质粒 ＤＮＡ 模板、１０ μＬ ５×
ＨＦ Ｐｈｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、１ μＬ １０ ｍｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰ、２ μＬ引
物 ( １０ μｍｏｌ / Ｌ )、 １ Ｕｎｉｔ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ 聚合酶
(Ｍ０５３０Ｓꎬ ＮＥＢ)、双蒸水补足体积至 ５０ μＬꎮ ＰＣＲ
反应条件:９８℃预变性 １ ｍｉｎꎻ９８℃ １０ ｓꎬ５５℃ １５ ｓꎬ
７２℃ ３０ ｓꎬ３０个循环ꎻ７２℃终延伸 １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ产
物经琼脂糖凝胶电泳回收 (Ｄ２５００￣０１ꎬ ＯＭＥＧＡ
ｂｉｏ￣ｔｅｋ)后ꎬ用限制性内切酶 Ｋｐｎ Ｉ(Ｄ１０６８ꎬ ＴａＫａ￣
Ｒａ) 和 ＢａｍＨ Ｉ(Ｄ１０１０ꎬ ＴａＫａＲａ)进行双酶切ꎮ 酶
切产物经快速 ＤＮＡ 产物纯化试剂盒(ＣＷ２３０１ꎬ
ＣＷＢＩＯ)纯化后ꎬ连接到经 Ｋｐｎ Ｉ 和 ＢａｍＨ Ｉ 酶切
的载体 ｐＵ１３０１ꎬ即构建完成目标转基因载体ꎮ
１.２　 水稻的遗传转化
　 　 转基因受体材料为粳稻品种中花 １１(Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ｌ.ｃｖ. ｊａｐｏｎｉｃａꎬＺｈｏｎｇｈｕａ １１)ꎬ通过套袋自交
采收种子ꎮ 水稻的遗传转化采用农杆菌介导的遗
传转化方法进行ꎬ具体参照 ２００５ 年 Ｌｉｎ 等[２０]的方
法进行ꎮ 成熟的水稻种子经去壳、表皮消毒后接种
于 Ｎ６培养基ꎬ２６℃黑暗培养约 ３０ ｄ 诱导愈伤ꎬ愈
伤在继代培养基上继代 ２ ~ ３ 次ꎬ经预培养、共培
８９２
　
　 ３期 巨延虎ꎬ等:过表达嗜热毛壳菌 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ基因提高转基因水稻对 ３种病害的抗性
养、抗性筛选、分化、生根等步骤获得转基因苗ꎮ 转
基因苗经炼苗后移栽至温室进行后续检测ꎮ
１.３　 水稻材料的种植
　 　 本实验所用转基因材料 Ｔ０代于温室培养ꎬ
２８℃±２℃ꎬ１６ ｈ 光照 / ８ ｈ 黑暗ꎮ 转基因材料 Ｔ１代
在山东农业大学固定转基因围墙大田中繁殖ꎬ正常
的肥水管理ꎮ
１.４　 转基因植株的阳性检测
　 　 采用 ＰＣＲ和 ＧＵＳ 染色 ２种检测方法ꎬ对 Ｔ０代
转基因植株苗期进行阳性检测ꎮ ＰＣＲ方法分别检测
载体携带的 β￣葡糖醛酸酶基因(Ｇｕｓ 基因)和靶标
基因 ＣｔＳＯＤꎬ采用的引物分别为 ＧＵＳＦ / ＧＵＳＲ
(ＧＵＳＦ: ５′￣ＧＴＧＡＡＴＣＣＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧ￣３′ꎻ ＧＵＳＲ:
５′￣ＡＴＣＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＡＣＡＴＡ￣３′)和 ＣＺ１Ｆ / ＣＺ１Ｒꎮ
ＰＣＲ 反应采用康为世纪的 ２ × Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
(ＣＷ０６８２Ｄꎬ ＣＷＢＩＯ)并参照说明书进行ꎮ ＧＵＳ 组
织化学染色分析采用 Ｘ￣Ｇｌｕｃ(５￣溴￣４￣氯￣３￣吲哚￣β￣
Ｄ￣葡萄糖苷ꎬＭ０１０１ꎬ ＫＡＹＯＮ)作为底物ꎬ ３７℃染色
１２ ｈꎬ然后 ７５％乙醇脱色ꎮ Ｔ１代植株及后续世代的
阳性检测主要用 ＰＣＲ检测靶标基因 ＣｔＳＯＤꎮ
１.５　 ＳＯＤ酶活性测定
　 　 ＳＯＤ的提取和测定按 Ｇｉａｎｎｏｐｏｌｉｔｉｓ等[２１]的方
法ꎮ 取完全伸展的水稻功能叶 ０.５ ｇ 于预冷的研
钵中ꎬ加入 ０.０５ ｍｏｌ / Ｌ 磷酸缓冲液(ｐＨ ＝ ７.８) ２.５
ｍＬ和 ＰＶＰ ０.０５ ｇꎬ在冰浴中研磨成匀浆ꎬ于 ４℃ꎬ
１２ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎꎬ上清即为粗提取的酶
液ꎮ 测定时先在试管中加入 ２.２ ｍＬ 磷酸缓冲液ꎬ
然后加入核黄素(６×１０－５ ｍｏｌ / Ｌ)０.１ ｍＬ、甲硫氨酸
(０.１３ ｍｏｌ / Ｌ) ０.３ ｍＬ、ＥＤＴＡ(３×１０－６ ｍｏｌ / Ｌ) ０.１
ｍＬ、ＮＢＴ(１.１２５×１０－３ ｍｏｌ / Ｌ)０.２ ｍＬ 和提取的酶
液 ０.１ ｍＬꎬ对照不加酶液ꎬ以 ０.１ ｍＬ 磷酸缓冲液
代替ꎬ然后立即在 ４ ０００ ｌｘ光照、２５℃反应 ２５ ｍｉｎꎬ
黑暗终止反应ꎬ测定样品在 ５６０ ｎｍ的吸光度值ꎬ以
抑制 ＮＢＴ光化还原 ５０％为一个酶活性单位ꎮ
　 　 ＮＢＴ光化还原抑制率 ＝ [ＯＤ 值(ＣＫ)－ＯＤ 值
(处理)] / ＯＤ值(ＣＫ)×１００％
　 　 ＳＯＤ活性单位＝ＮＢＴ抑制率 / ５０％
１.６　 转基因植株的抗病性检测
　 　 本研究所用的水稻白叶枯病菌株 ＰＸＯ９９ 为菲
律宾生理小种 ６ 的代表菌株ꎮ 在水稻孕穗期采用
剪叶法进行白叶枯病菌的接种[１４]ꎬ每株水稻接种
５片以上完全伸展的叶子ꎬ接种后 ２ 周调查发病情
况ꎬ以病斑长度与总叶长的比值(约等于病斑面
积)作为评价依据ꎮ 调查数据进行 ｔ检验并进行差
异显著性分析ꎮ 水稻材料进行白叶枯病菌的生长
曲线分析时ꎬ按上述方法接种白叶枯病菌 ＰＸＯ９９ꎬ
分别在接种后第 ０、４、８、１２ ｄ 取样ꎬ其中转基因植
株取样材料均为 ＰＣＲ 鉴定的阳性单株ꎬ同一份材
料取接种不同单株剪口下方约 ６ ｃｍ 长度的 ４ 片
叶ꎬ分别用 ７５％乙醇对叶片进行表面消毒 １ ｍｉｎꎬ
无菌吸水纸吸干后于研钵中加入 １ ｍＬ 无菌水研
磨成匀浆ꎬ用无菌水按 １０倍梯度稀释ꎬ参考前人的
经验值取相应的 ３ 个连续浓度梯度涂布在马铃薯
蔗糖培养基上ꎬ每个浓度梯度设置 ３ 个重复ꎬ２８℃
生长 ３ ｄ后进行细菌菌落数统计ꎮ
　 　 水稻细菌性条斑病菌使用代表菌株 ＲＳ１０５ꎬ采
用活体穿刺法在幼苗期进行接种ꎬ每株水稻接种 ３
片叶ꎬ每片叶接种 ２ ~ ４ 个点ꎬ１０ ｄ 后调查发病情
况[２２]ꎮ
　 　 本研究所用纹枯病菌 ＹＷＫ１９６ 为 ＡＧ１－ＩＡ融
合群高致病力菌株ꎮ 纹枯病菌的接种参照 Ｌｉ
等[１４]的方法ꎬ在水稻孕穗期ꎬ将经接菌培养的长 １
ｃｍ左右的木制短火柴棒嵌入植株的叶鞘内侧ꎬ然
后将水稻叶片喷湿ꎬ保湿控温ꎬ７ ｄ 后调查发病情
况ꎮ
１.７　 荧光定量 ＰＣＲ
　 　 总 ＲＮＡ的提取采用 ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ(Ｔ９４２４ꎬ Ｓｉｇ￣
ｍａꎬ 美国)抽提ꎬ具体的操作流程详见说明书ꎮ 提
取的 ＲＮＡ用于荧光定量 ＰＣＲ 检测转基因植株中
相关基因的表达水平[１４]ꎮ 第一链 ｃＤＮＡ合成采用
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ
(ＲＲ０４７ꎬ ＴａＫａＲａ) ꎬ合成的 ｃＤＮＡ 用 ｄｄＨ２Ｏ 稀释
２０倍ꎬ取 ５ μＬ 作为模板用于定量 ＲＴ￣ＰＣＲꎮ 定量
ＰＣＲ 分析试剂盒为 ＳＹＢＲ® Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ Ｔｌｉ
ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ) (ＤＲＲ４２０Ａꎬ ＴａＫａＲａ)ꎬ荧光定量
ＰＣＲ仪为 ｉＱ５ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ￣Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ(Ｂｉｏ￣ＲＡＤꎬ 美国)ꎬＰＣＲ 反应程序:９５℃预
变性 ３０ ｓꎻ然后 ９５℃变性 ５ ｓꎬ５５℃退火 ２０ ｓꎬ７２℃
延伸 ２０ ｓꎬ４０个循环ꎻ最后进入仪器固定的溶解曲
线分析ꎮ 水稻的持家基因内源肌动蛋白基因 Ａｃｔｉｎ
９９２
　
植物病理学报 ４５卷
的表达量用于对 ＲＮＡ 样品进行均一化评价ꎬ使用
２－△△ＣＴ相对定量的方法对基因表达量进行比较分
析ꎮ 定量 ＲＴ￣ＰＣＲ技术中的 ＰＲ基因特异性引物分
别 为 ＯｓＰＲ１ａＦ / ＯｓＰＲ１ａＲ ( ＯｓＰＲ１ａＦ: ５′￣ＣＧＴＣＴ￣
ＴＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＣ￣３′ꎻＯｓＰＲ１ａＲ:５′￣ＣＡＴ￣
ＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＧＴＡＧＣＡＴＡＧＣＡ￣３′)、 ＯｓＰＲ１ｂＦ /
ＯｓＰＲ１ｂＲ(ＯｓＰＲ１ｂＦ:５′￣ＧＧＣＡＡＣＴＴＣＧＴＣＧＧＡＣＡ￣
ＧＡ￣３′ꎻ ＯｓＰＲ１ｂＲ: ５′￣ＣＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＡＴ
ＴＴＴＣＡ￣３′) 和 ＯｓＰＲ１０Ｆ / ＯｓＰＲ１０Ｒ ( ＯｓＰＲ１０Ｆ: ５′￣
ＣＣＣＴＧＣＣＧＡＡＴＡＣＧＣＣＴＡＡ￣３′ꎻ ＯｓＰＲ１０Ｒ: ５′￣ＣＴ￣
ＣＡＡＡＣＧＣＣＡＣＧＡＧＡＡＴＴＴＧ￣３′)ꎬ内参肌动蛋白基
因的引物 ＯｓＡｃｔｉｎＦ１ / ＯｓＡｃｔｉｎＲ１(ＯｓＡｃｔｉｎＦ１:５′￣ＴＧ￣
ＴＡＴＧＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＡ￣３′ꎻ ＯｓＡｃｔｉｎＲ１: ５′￣
ＣＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＧＡＡ￣３′)ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 过量表达载体 ＰＵｂｉ∷ＣｔＳＯＤ 的构建和转基
因植株获得
　 　 以携带 ＣｔＳＯＤ 基因全长 ｃＤＮＡ 的质粒 ＤＮＡ
为模板ꎬ用特异引物 ＣＺ１Ｆ / ＣＺ１Ｒ 进行扩增ꎬ得到
约 ５００ ｂｐ 的条带(图 １￣Ｂ)ꎬ回收 ＰＣＲ 产物ꎬ进行
Ｋｐｎ Ｉ 和 ＢａｍＨ Ｉ 酶切消化后连接到 ｐＵ１３０１ 载体
上ꎬ转化 Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＨ５αꎬ阳性克隆再进行 Ｋｐｎ Ｉ 和
ＢａｍＨ Ｉ酶切ꎬ结果可得到约 ５００ ｂｐ 左右的目标条
带(图 １￣Ｃ)ꎬ表明过量表达载体 ＰＵｂｉ∷ＣｔＳＯＤ构建
成功ꎮ 载体基本结构如图 １￣Ａ 所示ꎬＣｔＳＯＤ 基因
受玉米泛素启动子驱动表达ꎬ同时左端有抗生素选
择标记基因 Ｈｐｔꎬ 右端携带报告基因 Ｇｕｓꎮ
　 　 上述载体经测序验证无碱基突变后转化农杆
菌 ＥＨＡ１０５ꎬ并利用农杆菌介导的遗传转化法将
ＰＵｂｉ∷ＣｔＳＯＤ 转入水稻愈伤组织ꎮ 最终获得转入
ＰＵｂｉ ∷ ＣｔＳＯＤ 的再生水稻 １０ 株ꎬ分别命名为
ＣＤ１０Ｒ￣１~ＣＤ１０Ｒ￣１０ꎮ
２.２　 转基因植株的 ＰＣＲ阳性鉴定和组织化学染色
　 　 采用 ＣＴＡＢ 法提取转基因水稻和野生型水
稻叶片的基因组 ＤＮＡꎬ用 ＣｔＳＯＤ 基因特异引物
以及Ｇｕｓ 基因特异引物进行 ＰＣＲ 检测ꎬ结果显示
获得的 １０株转基因水稻中有 ８ 株成功转入 ＰＵｂｉ∷
ＣｔＳＯＤ(表 １)ꎮ 为检测相关载体的表达情况ꎬ取
其成熟叶片用 ＧＵＳ 染色液浸润染色ꎬ然后用无水
乙醇脱色ꎬ结果显示阳性的转基因水稻被染上
蓝色ꎬ与 ＰＣＲ检测的阳性结果一致(表 １)ꎬ进一步
证明成功获得了 ８ 个转入 ＰＵｂｉ ∷ＣｔＳＯＤ 的水稻
植株ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ＰＵｂｉ∷ＣｔＳＯＤ
Ａ: Ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ＰＵｂｉ∷ＣｔＳＯＤ ꎬ ＬＢ ａｎｄ ＲＢ: ｌｅｆｔ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ Ｔ￣ＤＮＡ ｂｏｒｄｅｒꎻ
Ｈｐｔ: Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅꎻ ＧＵＳ: β￣ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｓｅ ｇｅｎｅꎻ ３５Ｓ: Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ
Ｕｂｉ: Ｍａｉｚｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ. Ｂ: ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｔＳＯＤꎬ Ｍ: ＤＮＡ ｍａｋｅｒ ＤＬ２０００ꎬ
Ｌａｎｅ １ ａｎｄ ２ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ. Ｃ: Ｐｌａｓｍｉｄ ｉｄｅｎｔｆｉｅｄ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ￣ｅｎｚｙｍｅ ｃｌｅａｖａｇｅꎬ
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｋｅｒ ５００ ｂｐ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅ １ ａｎｄ ２ ａｒｅ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＰＵｂｉ∷ＣｔＳＯＤ.
００３
　
　 ３期 巨延虎ꎬ等:过表达嗜热毛壳菌 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ基因提高转基因水稻对 ３种病害的抗性
２.３　 转基因植株酶活性检测
　 　 为检测 ＣｔＳＯＤ 蛋白是否表达ꎬ以 Ｔ０代成株期
的完全伸展叶片为材料ꎬ检测转基因植株 ＳＯＤ 酶
活性ꎮ 与野生型对照“中花 １１”的酶活性 ２０９.３３±
１３.０５ Ｕ􀅰ｇ－１ ＦＷ相比ꎬ８ 株转基因阳性植株 ＳＯＤ
酶活性在 ２９０.６７~３６１.３３ Ｕ􀅰ｇ－１ ＦＷ 之间ꎬ均有显
著水平的提高(Ｐ<０.０５)ꎬ酶活性提高比率达 ３８％
~７３％ꎮ 而 ２株转基因阴性株系 ＳＯＤ 酶活性与野
生型对照相比差异不明显(表 １)ꎮ 上述结果说明
转入的外源 ＣｔＳＯＤ 基因能提高水稻的 ＳＯＤ 总酶
活性ꎮ
２.４　 超量表达 ＣｔＳＯＤ 显著提高水稻对细菌性条
斑病的抗性
　 　 为了检测超量表达 ＣｔＳＯＤ 是否影响水稻对主
要病害的防御能力ꎬ在幼苗期对 Ｔ０代 １０ 个转基因
株系(包括 ２株阴性植株)接种水稻细菌性条斑病
菌 ＲＳ１０５ꎮ 结果显示ꎬ与野生型“中花 １１”相比ꎬ８
株超量表达 ＣｔＳＯＤ的株系病斑长度缩短了 １.９ ｃｍ
~２.６ ｃｍ(４５％ ~ ６０％)ꎬ均显著增强了水稻对细菌
性条斑病的抗性(Ｐ<０.０５)ꎻ而未转化成功的阴性
植株 ＣＤ１０Ｒ￣５ 和 ＣＤ１０Ｒ￣６ 病斑长度分别为 ４.６２
ｃｍ±０.６７ ｃｍ和 ４.３０ ｃｍ±０.６０ ｃｍꎬ与野生型无显著
差异(图 ２)ꎮ ＲＳ１０５ 接种产生的病斑长度与 ＳＯＤ
酶活性呈显著负相关(ｒ＝－０.９５ꎬｎ＝１１ꎬＰ<０.０１)ꎮ 以
上结果说明转基因株系对细菌性条斑病抗性的提高
与转基因植株中 ＳＯＤ总酶活性的提高密切相关ꎮ
２.５　 超量表达 ＣｔＳＯＤ 显著增加水稻对白叶枯病
的抗性
　 　 转基因水稻 Ｔ０代接种水稻白叶枯病菌 ＰＸＯ９９
菌株后第 １４ ｄ 调查发病情况ꎮ 结果显示ꎬ受白叶
枯病菌侵染后ꎬ超量表达 ＣｔＳＯＤ 的 ８ 个株系所产
生的病斑面积与对照及阴性植株 (ＣＤ１０Ｒ￣５ 和
ＣＤ１０Ｒ￣６)相比均显著降低(表 １)ꎮ ８ 株阳性转基
因株系病斑面积在 ８.９％~１０.６％之间ꎬ而野生型中
花 １１ 病斑面积为 １４. ５％ ±２. １％ꎬ阴性植株对照
ＣＤ１０Ｒ￣５和 ＣＤ１０Ｒ￣６ 病斑面积分别为 １４. ２％ ±
２.３％和 １５.４％±３.５％ꎮ 回归分析结果显示ꎬ转基因
材料接种 ＰＸＯ９９后的病斑面积与其 ＳＯＤ酶活性之
间呈显著负相关(ｒ＝ －０.９５ꎬｎ ＝ １１ꎬＰ<０.０１)ꎬ这说明
抗白叶枯病能力的提高与 ＳＯＤ酶活性增强相关ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ ｃａｕｓｅｄ
ｂｙ Ｘｏｏ ｓｔｒａｉｎ ＰＸＯ９９ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅｓ
Ｒｉｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｕｐｏｎ
ＰＸＯ９９ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ＰＣＲ ｆｏｒ
ＣｔＳＯＤ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ＰＣＲ ｆｏｒ Ｇｕｓ
ＧＵＳ
ｓｔａｉｎｉｎｇ
ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ
/ Ｕ􀅰ｇ－１ ＦＷ
Ｐ ｖａｌｕｅａ
Ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ
/ ％ ｂ
Ｐ ｖａｌｕｅａ
ＣＤ１０Ｒ￣１ ＋ ＋ ＋ ３３１.８３±２１.５１ ０.００４ ９.８±１.４ ０.００２
ＣＤ１０Ｒ￣２ ＋ ＋ ＋ ３１２.５０±８.５３ ０.００１ ９.７±１.２ ０.０００
ＣＤ１０Ｒ￣３ ＋ ＋ ＋ ３６１.３３±１５.１４ ０.０００ ８.９±１.５ ０.００３
ＣＤ１０Ｒ￣４ ＋ ＋ ＋ ３４７.５０±２７.１４ ０.００４ ８.９±１.４ ０.０２２
ＣＤ１０Ｒ￣５ ￣ ￣ ￣ ２１３.１７±２３.５３ ０.８２１ １４.２±２.３ ０.３６７
ＣＤ１０Ｒ￣６ ￣ ￣ ￣ ２１０.８３±１８.７８ ０.９１５ １５.４±３.５ ０.５４３
ＣＤ１０Ｒ￣７ ＋ ＋ ＋ ２９７.６７±１４.８４ ０.００１ １０.１±２.３ ０.０１２
ＣＤ１０Ｒ￣８ ＋ ＋ ＋ ３０６.４６±１７.９３ ０.００２ ９.４±２.６ ０.０４３
ＣＤ１０Ｒ￣９ ＋ ＋ ＋ ３１７.１０±１２.６９ ０.００１ １０.６±１.１ ０.０１１
ＣＤ１０Ｒ￣１０ ＋ ＋ ＋ ２９０.６７±２３.０３ ０.０１３ ９.５±３.３ ０.０４７
ＷＴ ￣ ￣ ￣ ２０９.３３±１３.０５ １４.５±２.１
　 ａ: Ｅａｃｈ Ｐ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ. ｂ: Ａｌｌ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ａｔ ｂｏｏｔｉｎｇ ｓｔａｇｅꎬ ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ ｗａｓ
ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｔ １４ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
１０３
　
植物病理学报 ４５卷
　 　 为进一步验证过量表达 ＣｔＳＯＤ 增强水稻对白
叶枯病的抵御能力ꎬ选取了 ＣＤ１０Ｒ￣１、ＣＤ１０Ｒ￣２和
ＣＤ１０Ｒ￣３等 ３个株系在田间进行了 Ｔ１代的接种试
验ꎮ 在 Ｔ１代植株的孕穗期ꎬ每个株系选取 １０ ~ １２
棵植株ꎬ每棵植株接种 ５ 片以上完全伸展的叶片ꎬ
接种后 １４ ｄ进行调查ꎮ 所有株系接种 ＰＸＯ９９ 后ꎬ
阳性 Ｔ１代植株相比于野生型对照与分离的阴性转
基因植株ꎬ其病斑面积显著降低(Ｐ<０.０５)ꎬ而阴性
单株接种后发病面积与野生型无明显差异 (图
３￣Ａ、表 ２)ꎬ抗性增强与 ＰＣＲ 阳性植株呈共分离ꎬ
进一步说明转基因株系对白叶枯病抗性的提高是
由所转外源基因造成的ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｒｅｄｕｃｅｄ ｌｅｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｕｐｏｎ ＲＳ１０５ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｗａｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣｔＳＯＤ
ＷＴ: Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１ꎻ ＣＤ１０Ｒ￣１－ＣＤ１０Ｒ￣１０: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔ０ ｐｌａｎｔｓ ꎻ
“∗∗”ａｎｄ “∗” ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ<０.０１ ａｎｄ Ｐ<０.０５ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｆｉｇ. ３　 Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣｔＳＯＤ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｉｃｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＰＸＯ９９ꎬ
ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
Ａ: Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ｔ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ＣＤ１０Ｒ￣１ꎬ ＣＤ１０Ｒ￣２ ａｎｄ ＣＤ１０Ｒ￣３ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＸＯ９９ꎻ
ＷＴ: Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１. Ｂ: Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｘｏｏ ｓｔｒａｉｎ ＰＸＯ９９ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ Ｔ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｌｉｎｅｓ ＣＤ１０Ｒ￣１ꎬ ＣＤ１０Ｒ￣２ ａｎｄ ＣＤ１０Ｒ￣３ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣｔＳＯＤ.
２０３
　
　 ３期 巨延虎ꎬ等:过表达嗜热毛壳菌 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ基因提高转基因水稻对 ３种病害的抗性
　 　 为验证转基因植株对 ＰＸＯ９９ 的抗性增强ꎬ调
查了接种转基因株系与野生型接种 ＰＸＯ９９ 后细菌
的增殖情况ꎮ 在接种白叶枯病菌后分别在 ０、４、８、
１２ ｄ取样进行细菌生长数量的统计(图 ３￣Ｂ)ꎬ结果
显示从接种第 ８ ｄ开始ꎬ３个超量表达 ＣｔＳＯＤ株系
的水稻叶片中ꎬＰＸＯ９９ 的菌落数量均显著低于野
生型(Ｐ<０.０５)ꎮ
２.６　 超量表达 ＣｔＳＯＤ增强水稻对纹枯病的抗性
　 　 超量表达 ＣｔＳＯＤ基因增强了水稻对细菌性病
害白叶枯病和条斑病的抗性ꎮ 为分析 ＣｔＳＯＤ基因
是否影响水稻对真菌病害的抗性ꎬ对转基因
ＣＤ１０Ｒ￣１￣１、ＣＤ１０Ｒ￣３￣１、ＣＤ１０Ｒ￣３￣３ 和 ＣＤ１０Ｒ￣２￣１
等 ４ 个单株的 Ｔ２代株系接种强致病力纹枯病菌
ＹＷＫ￣１９６ꎮ 结果显示ꎬ超量表达 ＣｔＳＯＤ 的 ４ 个 Ｔ２
代植株病斑长度相比于野生型中花 １１缩短了 １~３
ｃｍ(图 ４)ꎬ这说明 ＣｔＳＯＤ在水稻中的持续表达ꎬ可
增强对真菌病害纹枯病的防御能力ꎮ
２.７　 超量表达 ＣｔＳＯＤ Ｔ２代水稻的病程相关基因
表达
　 　 为了进一步探索转基因水稻抗性增强的分子
机制ꎬ采用实时荧光定量 ＰＣＲ的方法ꎬ对超量表达
ＣｔＳＯＤ的 Ｔ２代水稻 ＣＤ１０Ｒ￣３￣１中 ３个病程相关基
因(ＰＲ)ＰＲ１ａ、ＰＲ１ｂ和 ＰＲ１０的表达水平进行分析
(图 ５)ꎮ 结果表明:过表达 ＣｔＳＯＤ基因的水稻中 ３
个 ＰＲ基因的表达水平都显著高于野生型水稻ꎬ暗
示 ＣｔＳＯＤ基因在水稻中的表达增强了 ＰＲ 基因的
本底表达水平ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｔ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｕｐｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＸＯ９９
Ｒｉｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ
Ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ
/ ％ ａ
Ｐ ｖａｌｕｅｂ
ＰＣＲ
ａｎａｌｙｓｉｓｃ
Ｒｉｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ
Ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ
/ ％ ａ
Ｐ ｖａｌｕｅｂ
ＰＣＲ
ａｎａｌｙｓｉｓｃ
　 ＣＤ１０Ｒ￣１ ｆａｍｉｌｙ ＣＤ１０Ｒ￣２￣８ １７.１±１.６ ０.７３３ －
ＣＤ１０Ｒ￣１￣１ １０.９±０.６ ０.００３ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣２￣９ １２.３±２.２ ０.０３６ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣１￣２ １５.９±２.４ ０.５８２ － ＣＤ１０Ｒ￣２￣１０ １１.７±１.５ ０.０１２ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣１￣３ １１.６±３.０ ０.０３４ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣２￣１１ １２.１±０.８ ０.０１０ ＋
ＣＤ１０Ｒ－１￣４ １２.５±１.０ ０.０１４ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣２￣１２ １２.５±１.４ ０.０２７ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣１￣５ １１.１±２.０ ０.０２９ ＋ 　 ＣＤ１０Ｒ￣３ ｆａｍｉｌｙ
ＣＤ１０Ｒ￣１￣６ １１.７±２.８ ０.００９ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣１ １２.３±１.９ ０.０１９ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣１￣７ １６.８±２.７ ０.６５４ － ＣＤ１０Ｒ￣３￣２ １７.０±２.０ ０.２４６ －
ＣＤ１０Ｒ￣１￣８ １０.５±１.６ ０.００２ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣３ １２.４±１.６ ０.０１８ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣１￣９ １１.４±１.９ ０.００８ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣４ １２.３±１.９ ０.０２６ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣１￣１０ １０.８±３.１ ０.０２３ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣５ １２.３±１.７ ０.０３２ ＋
　 ＣＤ１０Ｒ￣２ ｆａｍｉｌｙ ＣＤ１０Ｒ￣３￣６ １７.６±３.２ ０.７６７ －
ＣＤ１０Ｒ￣２￣１ １２.４±１.９ ０.００４ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣７ １１.３±１.６ ０.０１１ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣２￣２ １１.２±１.０ ０.２９３ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣８ １６.１±１.３ ０.２５５ －
ＣＤ１０Ｒ￣２￣３ １０.２±１.３ ０.０１２ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣９ １２.２±２.１ ０.０４０ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣２￣４ １０.５±１.２ ０.００３ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣１０ １２.６±１.０ ０.０００ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣２￣５ ９.９±２.７ ０.００９ ＋ ＣＤ１０Ｒ￣３￣１１ １１.９±３.１ ０.０２３ ＋
ＣＤ１０Ｒ￣２￣６ １７.３±２.５ ０.６４５ － ＣＤ１０Ｒ￣３￣１２ １７.５±３.４ ０.５３３ －
ＷＴ １６.６±２.４
　 ａ:Ａｌｌ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ａｔ ｂｏｏｔｉｎｇ ｓｔａｇｅꎬ ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｔ １４ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. ｂ: Ｅａｃｈ Ｐ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｃａｌｃｕ￣
ｌａｔｅｄ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ. ｃ: Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ (＋) ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＣｔＳＯＤ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
３０３
　
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ４　 Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣｔＳＯＤ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ ｉｎ ｒｉｃｅ
Ａ: Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ＣｔＳＯＤ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔ２ ｐｌａｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＹＷＫ￣１９６ ａｆｔｅｒ ７ ｄａｙｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
Ｂ: Ｒｉｃｅ ｌｅｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｒ. ｓｏｌａｎｉ ｉｎ Ｔ２ ｌｉｎｅｓ ａｆｔｅｒ ７ ｄａｙｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
Ｆｉｇ. ５　 Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＲ１ａꎬ ＰＲ１ｂ
ａｎｄ ＰＲ１０ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ＣｔＳＯＤ￣
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅ ＣＤ１０Ｒ￣３￣１
３　 讨论
　 　 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ是活性氧清除系统中重要的酶ꎬ
在植物光诱导发育及抗逆性中起着重要作用ꎮ 在
提高作物非生物胁迫抗性方面ꎬ有报道表明内源或
外源 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ 在烟草、马铃薯、甘薯、李等植物
中过表达可提高相应植物对盐、干旱等不良因子的
耐受性[１７ꎬ ２３~２５]ꎮ 在水稻中ꎬＣｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ 也是豌豆
来源 ＤＥＳＤ￣ｂｏｘ 解旋酶(ＤＥＳＤ￣ｂｏｘ ｈｅｌｉｃａｓｅ)介导
的耐盐与抗氧化功能重要的互作蛋白[２６]ꎮ 但 Ｃｕ /
Ｚｎ￣ＳＯＤ在植物生物胁迫中的作用尚未得到具体
的功能验证ꎬ植物的防御体系是多个因素相互作用
的复杂体系ꎬ其中包括调控木质素合成及沉积相关
的苯丙烷类代谢酶、植保素的诱导合成、病程相关
蛋白 ＰＲｓ等相关因子ꎮ 研究表明ꎬ不同的植物￣病
原物互作中ꎬ植物体内 ＳＯＤ 活性变化并非完全一
致ꎮ 黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)可以诱导黄瓜和西红柿
的抗氧化系统ꎬ引起 ＳＯＤ 酶活性的持续上升[２７]ꎻ
低头黑病菌侵染烟草和黑腐病菌侵染大白菜时ꎬ植
物抗病品种和感病品种的 ＳＯＤ酶活性均表现为先
升高后降低ꎬ在整个侵染阶段抗病品种的酶活性高
于感病品种[２８ꎬ ２９]ꎻ在水稻与病原菌互作中ꎬ相关研
究也表明白叶枯病菌侵染水稻后会引起水稻叶片
细胞内 Ｈ２Ｏ２上升ꎬＳＯＤ、过氧化物酶(ＰＯＤ)的活
性增加ꎬ且 ＰＯＤ活性的增加与木质素类似物的积
累以及过敏反应的起始有关[３０]ꎮ 这暗示超氧化物
歧化酶(ＳＯＤ)是植物与病原识别过程中产生初始
抗性信息的一个关键酶ꎮ 本研究在水稻材料中过
量表达源自嗜热毛壳菌的编码 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ 蛋白
的基因 ＣｔＳＯＤꎬ酶活性测定表明转基因植株的
ＳＯＤ活性显著提高ꎮ 对转基因材料分别接种水稻
白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和纹枯病菌ꎬ结果显
示超量表达 ＣｔＳＯＤ明显增强了水稻对这 ３ 种病害
的抵御能力ꎬ直接证明了 ＣｔＳＯＤ 的活性提高有助
于增强植物对某些病原微生物的抵抗能力ꎮ
　 　 Ｗｕ[３１]等研究发现白叶枯病菌侵染水稻后会
诱导水稻病程相关基因 ＰＲ１ａ、ＰＲ１ｂ 和 ＰＲ１０ 的表
达ꎬ而 ＰＲ(ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄꎬ ＰＲ)蛋白是植物防
４０３
　
　 ３期 巨延虎ꎬ等:过表达嗜热毛壳菌 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ基因提高转基因水稻对 ３种病害的抗性
卫体系的重要组成部分ꎮ 本研究对转基因水稻中
的 ＰＲ基因表达量的检测发现ꎬ过量表达 ＣｔＳＯＤ转
基因水稻的 ＰＲ１ａ、ＰＲ１ｂ 和 ＰＲ１０ 基因在没有生物
胁迫条件下的表达量明显高于野生型水稻ꎬ暗示
ＰＲ基因的表达可能是导致过表达 ＣｔＳＯＤ 提高对
多种病原抗性的分子基础ꎮ
　 　 水稻纹枯病、白叶枯病和细菌性条斑病是水稻
生产上的重要病害ꎮ 尽管已鉴定出多个白叶枯主
效抗病基因[８]ꎬ但存在抗病谱差异的局限性ꎮ 而
水稻细菌性条斑病和纹枯病的抗性改良进展缓慢ꎬ
尚缺乏丰富的植物抗性基因资源ꎮ 尤其是纹枯病ꎬ
已经成为水稻、玉米、小麦等主要粮食作物的重要
病害ꎬ其致病机理研究也有待加速ꎮ 已有的抗病相
关基因研究中ꎬ尚未见单一基因对以上 ３ 种不同病
害产生抗性的报道ꎬ本研究发现过表达外源的 Ｃｔ￣
ＳＯＤ显著提高水稻对这 ３种病害的抵御能力ꎬ具有
较宽的抗病谱ꎬ适合作为抗病基因工程的靶标基因ꎮ
　 　 Ｚｈａｎｇ 等[１９]在克隆 ＣｔＳＯＤ 基因时发现ꎬ该蛋
白在毕赤酵母中表达ꎬ具有优异的热稳定性ꎬ在
６０℃和 ｐＨ ６.５ 条件下具有最高的酶活力ꎮ 研究发
现ꎬ温度影响拟南芥 ＰＴＩ 与 ＥＴＩ 的激活程度ꎬ从而
影响其抗病性[３２]ꎮ ＣｔＳＯＤ基因对作物耐受高温的
能力及高温条件下的抗病能力可能起到重要作用ꎬ
本研究尚未开展相关实验ꎬ后续研究有待完善ꎮ 另
外ꎬＣｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ在植物应对非生物胁迫中起着重
要作用ꎬＺｈａｎｇ 等[１９]发现该基因在酵母中可提高
其对盐的耐受性ꎬ有关转基因水稻耐盐、抗旱性调
查ꎬ还有待进一步加强ꎬ以指导该基因在生产实践
中的应用ꎮ
参考文献
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[Ｊ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ (中国农学
通报)ꎬ ２００６ꎬ ２２(２): ３４３－３４７.
[４] 　 Ｃｈａｎｎａｍａｌｌｉｋａｒｊｕｎａ Ｖꎬ Ｓｏｎａｈ Ｈꎬ Ｐｒａｓａｄ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｑＳＢＲ１１￣１
ｆｏｒ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｒｉｃｅ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｒｅｅｄｉｎｇꎬ ２０１０ꎬ ２５(１): １５５－１６６.
[５] 　 Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ Ｅ Ｅꎬ Ｗａｎｇ Ｑꎬ Ｙａｎｇ Ｙ Ｎ. Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ
ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃ￣
ｔｒｕｍ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｍａｇｎａ￣
ｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１３ꎬ １１: ３３－４２.
[６] 　 Ｊｈａ Ｓꎬ Ｃｈａｔｔｏｏ Ｂ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｉｎ ｉｎ
ｒｉｃｅ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｆｕｎｇａｌ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ [ Ｊ] .
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ２０１０ꎬ １９(３): ３７３－８４.
[７] 　 Ｋｏｕ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｓ. Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｒｉｃｅ
[Ａ] . Ｖａｒｓｈｎｅｙ Ｒꎬ Ｔｕｂｅｒｏｓａ Ｒ. Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍ￣
ｉｃｓ ｆｏｒ Ｃｒｏｐ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ: Ｂｉｏｔｉｃ Ｓｔｒｅｓｓ. ｖ. １ [Ｍ] . Ｈｏｂｏ￣
ｋｅｎ: Ｗｉｌｅｙ￣Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ. ２０１３. １１－３０.
[８] 　 Ｚｈａｎｇ Ｈꎬ Ｗａｎｇ Ｓ. Ｒｉｃｅ ｖｅｒｓｕｓ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ
ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ: ａ ｕｎｉｑｕｅ ｐａｔｈｏｓｙｓｔｅｍ [ Ｊ] . Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ￣
ｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ １６(２): １８８－１９５.
[９] 　 Ｈａｎ Ｑ Ｄꎬ Ｃｈｅｎ Ｚ Ｗꎬ Ｄｕａｎ Ｙ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｅｎｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋ ｉｎ ｒｉｃｅ
ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ (分子植物育种)ꎬ ２００８ꎬ ６(２): ２３９－２４４.
[１０] Ｇｕｏ Ｌꎬ Ｇｕｏ Ｃꎬ Ｌｉ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ＮＲＲＢ
ｅｎｈａｎｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋ ｉｎ ｒｉｃｅ[ Ｊ] .
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓꎬ ２０１４ꎬ４１(４):２１７７－２１８７.
[１１] Ｚｈａｏ Ｂꎬ Ｌｉｎ Ｘꎬ Ｐｏｌａｎｄ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｍａｉｚｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒｅａｋ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｒｉｃｅ
[Ｊ] . Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａꎬ ２００５ꎬ １０２ ( ４３):
１５３８３－１５３８８.
[１２] Ｙｕａｎ Ｘ Ｐꎬ Ｗｅｉ Ｘ Ｈꎬ Ｙｕ Ｈ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｒｉｃｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃａ
Ｓｉｎｉｃａ (作物学报)ꎬ ２００４ꎬ ３０(８): ７６８－７７３.
[１３] Ｍｏｌｌａ Ｋ Ａꎬ Ｋａｒｍａｋａｒ Ｓꎬ Ｃｈａｎｄａ Ｐ Ｋꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｉｃｅ
ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｇｒｅｅｎ ｔｉｓｓｕｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ
(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ) ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ[ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ １４(９): ９１０－９２２.
[１４] Ｌｉ Ｎꎬ Ｋｏｎｇ Ｌꎬ Ｚｈｏｕ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ. Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｏｓ２Ｈ１６ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ
５０３
　
植物病理学报 ４５卷
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｒｉｃｅ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ Ｔｉｓ￣
ｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅꎬ ２０１３ꎬ １１５(３): ４２９－４４１.
[１５] Ｄｏｕ Ｊ Ｈꎬ Ｙｕ Ｓ Ｘꎬ Ｆａｎ Ｓ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. ＳＯＤ ａｎｄ ｐｌａｎｔ
ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ (分子植物育种)ꎬ ２０１０ꎬ ８(２): ３５９－３６４.
[１６] Ｈｕ Ｇ Ｈꎬ Ｙｕ Ｓ Ｘꎬ Ｆａｎ Ｓ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｃｏｐｐｅｒ / ｚｉｎｃ
ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｕｐｌａｎｄ ｃｏｔｔｏｎ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ (中国农业科学)ꎬ
２００７ꎬ ４０(８): １６０２－１６０９.
[１７] Ｔａｎｇ Ｌꎬ Ｔａｎｇ Ｈꎬ Ｋｗａｋ Ｓ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐｏｔａｔｏ
ｐｌａｎｔｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂｙ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓ￣
ｆｅｒ ｂｏｔｈ ｏｆ Ｃｕ / Ｚｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ａｎｄ ａｓｃｏｒｂａｔｅ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｃｈｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
(中国生物工程杂志)ꎬ ２００８ꎬ ２８(３): ２５－３１.
[１８] Ｘｉｅ Ｘ Ｑꎬ Ｗａｎｇ Ｊꎬ Ｈｕａｎｇ Ｂ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｎｅｗ ｍａｎｇａ￣
ｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ
ｂａｓｓｉａｎａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｗｈｅｎ
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ [ Ｊ ] . Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２０１０ꎬ ８６(５):１５４３－
１５５３.
[１９] Ｚｈａｎｇ Ｌ Ｑꎬ Ｇｕｏ Ｆ Ｘꎬ Ｘｉａｎ Ｈ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｃｕꎬ Ｚｎ￣ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ
ｆｒｏｍ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｎｄ
ｉｔｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ [ Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ
２０１１ꎬ ３３(６): １１２７－１１３２.
[２０] Ｌｉｎ Ｙ Ｊꎬ Ｚｈａｎｇ Ｑ. Ｏｐｔｉｍｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉ￣
ｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓꎬ ２００５ꎬ ２３(８): ５４０－５４７.
[２１] Ｇｉａｎｎｏｐｏｌｉｔｉｓ Ｃ Ｎꎬ Ｒｉｅｓ Ｓ Ｋ. Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅｓ:
ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ
１９７７ꎬ ５９: ３０９－３１４.
[２２] Ｃｕｉ Ｙ Ｐꎬ Ｚｏｕ Ｌ Ｆꎬ Ｚｏｕ Ｈ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. ＨｒｐＥ３ ｉｓ ａ ｔｙｐｅ ＩＩＩ
ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆｕｌｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｘａｎ￣
ｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ｉｎ ｒｉｃｅ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ １４(７): ６７８－６９２.
[２３] Ｙａｏ Ｒꎬ Ｌｉ Ｙꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓ￣
ｓｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌ￣
ｌｅｔｉｎ (生物技术通报)ꎬ ２０１２ꎬ １１: ７８－８２.
[２４] Ｌｉ Ｙꎬ Ｄｅｎｇ Ｘ Ｐꎬ Ｇｕｏ Ｓ Ｓ ꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｏｔｈ Ｃｕ / Ｚｎ
ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ａｎｄ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ (植物生理与分子生物学学报)ꎬ
２００６ꎬ ３２(４): ４５１－４５７.
[２５] Ｆａｉｚｅ Ｍꎬ Ｆａｉｚｅ Ｌꎬ Ｐｅｔｒｉ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｕ / Ｚｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ
ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ａｎｄ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｓｈｏｏｔ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌｕｍ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ １７０(７): ６２５－６３２.
[２６] Ｇｉｌｌ Ｓ Ｓꎬ Ｔａｊｒｉｓｈｉ Ｍꎬ Ｍａｄａｎ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ＤＥＳＤ￣ｂｏｘ
ｈｅｌｉｃａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓａｌｉｎｉｔｙ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂｙ ｉｍｐｒｏ￣
ｖｉｎｇ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｉｎ ｒｉｃｅ
(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ. ｃｖ. ＰＢ１ ) [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ ８２: １－２２.
[２７] Ｓｏｎｇ Ｆ Ｎꎬ Ｙａｎｇ Ｃ Ｐꎬ Ｌｉｕ Ｘ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｌｔ
ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ( ＳＯＤ) ｉｎ
Ｕｌｍｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ. [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ
２００６ꎬ １７(１): １３－１６.
[２８] Ｆａｎｇ Ｂ Ｈꎬ Ｚｈａｎｇ Ｇ Ｍꎬ Ｃｈｉ Ｃ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ
ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ ｆ. ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｔｏｘｉｎ ｏｎ
ＭＤＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植
物病理学报)ꎬ ２００４ꎬ ３４(１): ２７－３１.
[２９] Ｙｕ Ｌꎬ Ｚｈａｎｇ Ｌꎬ Ｈｅ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ａｎｔｉ￣ｏｘｉｄａｎｔ
ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｔｒｉｓ ｐｖ.
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｉｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｌｅａｆ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｂｂａｇｅ ( ｉｎ Ｃｈｉ￣
ｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学
报)ꎬ ２０１０ꎬ ４０(２):１２２－１２８.
[３０] Ｒｅｉｍｍａｎｎ Ｃꎬ Ｒｉｎｇｌｉ Ｃꎬ Ｄｕｄｌｅｒ Ｒ. Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ
ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎ￣
ｄｕｃｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ.
１９９２ꎬ １００: １６１１－１６１２.
[３１] Ｗｕ Ｑꎬ Ｈｏｕ Ｍ Ｍꎬ Ｌｉ Ｌ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｇｅｎｅ ＸＡ２１￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ
２０１１ꎬ ９３(２): ４５５－４５９.
[３２] Ｃｈｅｎｇ Ｃꎬ Ｇａｏ Ｘꎬ Ｆｅｎｇ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｌａｎｔ ｉｍｍｕｎｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｄｉｆｆｅｒｓ ｗｉｔｈ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａ￣
ｔｕｒｅｓ [Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ ２０１３ꎬ ４:２５３０.
责任编辑:于金枝
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