免费文献传递   相关文献

Toxicity measurement on the Fusarium oxysporum f.sp. cubense and GC-MS analysis of the extracts from Allium tuberosum and A. fistulosum

两种葱属植物提取液对香蕉枯萎病菌的毒力测定及GC-MS分析



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  44(4): 428 ̄432(2014)
收稿日期: 2012 ̄12 ̄06ꎻ 修回日期: 2014 ̄03 ̄14
基金项目: 广东省科技计划项目(2010A020507001 ̄78)
通讯作者: 冯 岩ꎬ教授ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻTel:020 ̄89002016ꎬE ̄mail:fengyan8@163.com
第一作者: 杨静美ꎬ女ꎬ湖北宜昌人ꎬ实验师ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻE ̄mail:cycleplace@126.comꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2014.04.012
两种葱属植物提取液对香蕉枯萎病菌的毒力测定及
GC ̄MS分析
杨静美ꎬ 王 强ꎬ 伍惠媚ꎬ 何小静ꎬ 冯 岩∗
(仲恺农业工程学院农学院ꎬ广州 510225)
摘要:以韭菜和葱的乙酸乙酯提取液对香蕉枯萎病菌进行了抑菌试验ꎬ并在高温条件下ꎬ采用气相色谱-质谱法(GC ̄MS)
对葱的各部位、韭菜根的乙酸乙酯提取液进行分析ꎮ 结果表明:韭菜和葱各部位乙酸乙酯提取液对香蕉枯萎病菌均有一定
的抑制作用ꎬ以韭菜茎的抑制效果最好ꎬ为 29.85%ꎬ韭菜根的抑制效果次之ꎻ葱的根、茎、叶和韭菜根的乙酸乙酯提取液检
出物分别为 34、20、12和 21种ꎬ其中韭菜根提取液中有较多的含硫化合物ꎬ脒基硫脲最多ꎬ为 17.01%ꎮ 葱提取液中除含硫
化合物外ꎬ还检出噻吩、吡嗪和喹啉类物质ꎮ
关键词:韭菜ꎻ 葱ꎻ 香蕉枯萎病菌ꎻ GC ̄MSꎻ 抑菌作用
Toxicity measurement on the Fusarium oxysporum f.sp. cubense and GC ̄MS analy ̄
sis of the extracts from Allium tuberosum and A. fistulosum   YANG Jing ̄meiꎬ WANG
Qiangꎬ WU Hui ̄meiꎬ HE Xiao ̄jingꎬ FENG Yan   (College of AgricultureꎬZhongkai University of Agriculture and
EngineeringꎬGuangzhou 510225ꎬChina)
Abstract: The antibiotic experiment of extracts from Allium tuberosum and A. fistulosum with ethylacetate
against Fusarium oxysporum f. sp. cubense was studied. Compositions of the extracts of A. fistulosum and A.
tuberosum root with ethylacetate were analyzed by GC ̄MS at high temperature. The results indicated that all
the extracts of two Allium plants with ethylacetate showed inhibitory effects on the F. oxysporum f. sp.
cubenseꎬ the inhibition efficiency of A. tuberosum stem was 29.85%ꎬ on the top of the listꎬ closely followed
by A. tuberosum root. The kinds of extractives from the root of A. fistulosum and A. tuberosum with ethylace ̄
tate were 34ꎬ 20ꎬ 12 and 21ꎬ respectively. Extracts of A. tuberosum contained many sulfo ̄compounds.
Amidinothiourea was the mostꎬ accounted for 17. 01%. Compounds containing thiopheneꎬ pyrazine and
quinoline were also detected except sulfo ̄compounds from extracts of A. fistulosum.
Key words: Allium tuberosumꎻ A. fistulosumꎻ Fusarium oxysporum f. sp. cubenseꎻ GC ̄MSꎻ antibiotic effect
中图分类号: S432          文献标识码: A          文章编号: 0412 ̄0914(2014)04 ̄0428 ̄05
    葱(Allium fistulosum)和韭菜(Allium tubero ̄
sum)作为百合科葱属植物ꎬ不仅可作蔬菜ꎬ还具有
一定的药用价值ꎬ因此在我国各地方均有种植[1]ꎮ
目前对这 2种葱属植物体内化学成分及作用的深
入研究已有报道ꎬ如葱属植物中有多种含硫化合
物—二丙基二硫化物、丙基烯丙基二硫化物[2]、烯
丙基硫醚[3]、1 ̄丙烯基甲基二硫化物和二甲基三硫
化物等ꎬ还含有噻吩[4]、海罂粟碱、吲哚、咔唑[5]、
吡唑、吡喃和毒扁豆碱等[6]ꎮ 葱属植物挥发油对
毛癣菌属和曲霉属真菌有一定的抑制作用[7~8]ꎮ
研究表明ꎬ韭菜具有杀虫抗菌、抗突变、抗氧化和温
肾助阳等多种生物学功能[9]ꎮ 韭菜挥发油中的化
 
  4期 杨静美ꎬ等:两种葱属植物提取液对香蕉枯萎病菌的毒力测定及 GC ̄MS分析
学成分如二丙烯基二硫醚、二丙烯基三硫醚和 S-
甲基甲烷硫代亚磺酸盐等ꎬ对大肠杆菌、蜡状芽孢
杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等都有显著的抑
制作用[10~12]ꎮ
    香蕉枯萎病(Banana Fusarium Wilt)由尖孢镰
刀菌古巴专化型侵染引起的维管束系统性病害ꎬ是
世界农业史上记载的分布最广、毁灭性最强的植物
病害之一[13]ꎮ Feng 等[5ꎬ14]研究报道:韭菜和葱各
部位不同浓度的稀释汁液对香蕉枯萎病菌孢子萌
发的抑制率均达 100%ꎬ表现出极强的抑菌活性ꎬ
同时对香蕉枯萎病菌菌丝生长也有一定的抑制作
用ꎻ葱和韭菜根的石油醚提取液 Gas Chromatogra ̄
phy ̄Mass Spectrometer 检测结果表明了葱茎的石
油醚提取液中含有较多的二硫化物和噻烷类化合
物ꎬ对植物病原菌有一定的抑菌活性ꎮ
    依据前人的试验研究ꎬ本文采用了韭菜和葱各
部位乙酸乙酯的提取物进行香蕉枯萎病菌抑菌试
验ꎬ并对它们各部位的提取成分进行 GC ̄MS 分
析ꎬ从而探索出一种更有利于抑菌活性成分提取的
有机溶剂ꎬ以便找出对香蕉枯萎病菌具有抑菌活性
的主要化学成分及这些化学成分的位置分布ꎬ为植
物源农药的发展提供理论依据ꎮ
1  材料与方法
1.1  材料
1.1.1   供试菌及植物   香蕉枯萎病菌(Fusarium
oxysporum f.sp.cubenseꎬ FOC)4号生理小种(病原
为尖孢镰刀菌古巴专化型ꎬ由仲恺农业工程学院植
物病理研究所提供)ꎻ韭菜品种为蓼江韭菜ꎬ葱品
种为四季葱(均采自广东省广州市白云区江高镇
蓼江村农户)ꎮ
1.1.2   供试试剂   乙酸乙酯(Ethylacetateꎬ分析
纯ꎬ广州化学试剂厂)
1.1.3  供试仪器及色谱条件  Agilent 6890 ̄5973N
气相色谱-质谱联用仪(美国 Agilent 公司)ꎻ毛细
管气相色谱柱 HP ̄SHS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)
(美国 Agilent公司)ꎻ载气:高纯 He(纯度 99.999%
以上)ꎻ质谱条件:EI源ꎬ电离电压 70 eVꎻ离子源温
度 230℃ꎻ质量扫描范围 50~550 uꎮ
1.2  方法
1.2.1  样品预处理  将韭菜和葱洗净后用无菌水
浸泡 1 hꎬ晾干ꎬ表面消毒[15]ꎬ其根、茎和叶切碎后
备用ꎮ 称取上述备用并稍加研磨的葱(根、茎、叶)
和韭菜(根)各 20 gꎬ分别置于 125 mL的磨口瓶中ꎬ
各加入乙酸乙酯 20 mLꎬ萃取 24 h 后ꎬ收集有机
相[5]ꎮ 另称取未研磨的韭菜(根、茎、叶)和葱(根、
茎、叶)各 20 gꎬ置于 125 mL的磨口瓶中ꎬ分别加入
乙酸乙酯 20 mLꎬ萃取 24 h后ꎬ无菌条件下将乙酸乙
酯完全挥发ꎬ然后各加入 20 mL无菌水浸泡 10 hꎬ收
集水相ꎮ 空白对照则只加入等体积的乙酸乙酯ꎬ待
其完全挥发后ꎬ加入等体积无菌水ꎬ收集水相ꎮ
1.2.2  韭菜和葱各部位提取液对香蕉枯萎病菌的
抑菌实验  在无菌条件下ꎬ分别吸取上述 1.2.1 步
骤韭菜、葱各部位的收集液以及空白对照液各
2 mL加入到 45 mL PDA 培养基(45 ~ 50℃)中摇
匀ꎬ等量倒入 3 个无菌培养皿(Φ = 90 mm)中ꎬ冷
却放置ꎮ 用打孔器(Φ = 9 mm)打取预培养(4 ~ 5
d)的香蕉枯萎病菌菌落最边缘成菌饼ꎬ用接菌针
每皿接 1个菌饼ꎻ试验重复 3 次ꎮ 28℃恒温培养 3
d后ꎬ采用十字交叉法测量菌落生长直径(mm)并
计算抑制百分率(%)ꎮ 数据用 SAS 8.0软件ꎬ邓肯
新复极差法分析ꎮ
菌落生长抑制率(%)=
[对照菌落直径(mm)-9(mm)]-[处理菌落直径(mm)-9(mm)]
对照菌落直径(mm)-9(mm)
×100%
1.2.3  提取液 GC-MS测定  样品按上述 1.1.3的
色谱条件参照文献[5]分别对葱和韭菜各部位乙
酸乙酯提取液进行 GC-MS 分析测定ꎮ 其中进样
口和接口温度分别为 270℃ꎬ程序升温 100℃保持
2 minꎬ以 10℃ / min 升温至 250℃保持 10 minꎬ进
样方式为不分流进样ꎬ进样量 1 μLꎮ
2  结果与分析
2.1  韭菜和葱提取液的抑菌效果测定
    韭菜和葱各部位乙酸乙酯提取液对香蕉枯萎
病菌菌丝生长的影响结果见表 1 和图 1ꎮ 香蕉枯
萎病菌在无菌水对照条件下 72 h 后菌落生长直径
为 42.5 mmꎬ韭菜根和茎提取液对病原菌的抑制率
达 28%以上ꎮ 提取液的抑菌效果:韭菜茎>韭菜根
>韭菜叶ꎻ葱根>葱茎>葱叶ꎮ 与对照相比ꎬ韭菜和
葱各部位对病原菌均有抑制作用ꎬ说明 2种葱属植
物各部分的乙酸乙酯提取液中都含有抑制香蕉枯
萎病菌的活性成分ꎮ
924
 
植物病理学报 44卷
Table 1  Influence of extract from Allium tuberosum and A. fistulosum on growth of
mycelium of Fusarium oxysporum f. sp. cubense
Plant
Root Culm Leaf
I / mm II / % I(mm) / % II / % I / mm II / %
CK / mm
Allium tuberosum 32.8±0.13cd 28.96 32.5±0.15d 29.85 34.7±0.12c 23.28
A. fistulosum 34.7±0.08c 23.28 38.3±0.06b 9.88 39.2±0.08b 7.76
42.50±0.13a
Note: 1)Different small letters indicated the significant difference at 0.05 levelꎻ2)Ⅰ: Colony diameter / mmꎻⅡ: Inhibition rate / %.
Fig. 1  Influence of extract from Allium tuberosum on growth of
mycelium of Fusarium oxysporum f. sp. cubense
2.2  GC ̄MS检测结果
    通过对葱的根、茎、叶和韭菜的根部位乙酸乙
酯提取液抑菌活性成分进行 GC ̄MS 分析ꎬ并对
GC ̄MS检出物进行峰面积归一化分析ꎬ减去与空
白对照保留时间相同的组分ꎬ与标准质谱库比对ꎬ
将相似度高的含硫、噻吩和吡嗪等杂环类的化合物
列表(表 2)ꎮ 结果表明:葱的根、茎、叶和韭菜的根
部位乙酸乙酯检出物分别为 34、20、12 和 21 种ꎮ
韭菜根的提取液中ꎬ脒基硫脲的含量最高ꎬ为
17.01%ꎬ二烯丙基二硫化物的含量为3.22%ꎬ这
2种化合物可能是抑菌的主要成分ꎮ 葱的各部位
提取液中检测出噻吩、吡嗪和喹啉类化合物ꎬ未检
出噻烷ꎬ这与石油醚提取液检测物有所不同ꎮ 葱根
和叶的提取液中二丙基二硫化物含量较高ꎬ可能是
抑菌活性的主要成分(其中叶中的含量较多ꎬ为
9.66%)ꎮ
3  结论与讨论
    本文进行了韭菜和葱不同部位的乙酸乙酯提
取液对香蕉枯萎病菌的毒力试验ꎬ并对提取液进行
了 GC ̄MS检测ꎮ 结果显示:韭菜茎的乙酸乙酯提
取液抑菌活性达到 29.85%以上ꎬ这与之前平板对
峙法和加入法中韭菜茎抑菌活性结果相一致ꎻ但与
将葱和韭菜直接研磨后其汁液加入到病原菌中的
抑制活性相比ꎬ其结果差异较大[14]ꎬ这表明两种葱
属植物提取液中具有抑菌活性的化合物可能具有
挥发性ꎬ也可能是由于乙酸乙酯提取的仅是亲酯类
的物质ꎬ应用其它溶剂进行进一步研究ꎮ 葱的根、
茎、叶和韭菜根的乙酸乙酯检出物分别为 34、20、
12和 21种ꎬ其中葱部位的乙酸乙酯提取液中含有
11.85%的二硫化物和少量的噻吩、吡嗪类化合物ꎻ
韭菜根中含有0.88%的硫酸二甲酯ꎬ3.22%的二烯
丙基二硫化物及 17.01%的脒基硫脲ꎬ这些活性化
合物的抑菌活性评价指标有待于进一步的研究ꎬ并
且提取工艺还需进一步优化以达到理想的抑菌效
果ꎮ 与前期 2种葱属植物石油醚提取液相比ꎬ乙酸
乙酯提取液中硫化合物的含量和种类都较少ꎬ其中
葱的各部位乙酸乙酯提取物中共检出 66 种化合
物ꎬ石油醚为 44种ꎻ韭菜各部位乙酸乙酯提取物中
共检出 77种化合物ꎬ石油醚为 148 种[5~6]ꎬ表明不
同的有机溶剂对不同植物部位提取效果不同ꎬ具有
选择性ꎮ
034
 
  4期 杨静美ꎬ等:两种葱属植物提取液对香蕉枯萎病菌的毒力测定及 GC ̄MS分析
Table 2  GC ̄MS results of ethylacetate extractives from Allium fistulosum and A. tuberosum
Molecular formula of compound tR / min
Ethylacetate(w / %)
Allium fistulosum
Root of A.
tuberosum
Root Culm Leaf
3ꎬ6 ̄Bis(N ̄dimethylamino)  ̄9 ̄ ethylcarbazole 3.13 — — — —
Thiopheneꎬ2ꎬ4 ̄dimethyl 3.91 0.98 — — —
Quinolineꎬ3 ̄bromo 3.91 — — 3.78 —
Sulfuric acidꎬdimethylester 4.07 — — — 0.88
Diallyl disulphide 4.29 — — — 3.22
Ethaneꎬ1 ̄(4ꎬ4ꎬ4 ̄trifluoro ̄1ꎬ3 ̄dithiobutyl)
 ̄2 ̄(3ꎬ3ꎬ3 ̄trifluoro ̄ 1ꎬ2 ̄dithiopropyl)
4.39 — — 2.70 —
Benzeneꎬ 2 ̄[( tert ̄butyldimethylsilyl)oxy]  ̄1 ̄isopropyl ̄4 ̄methyl ̄ 4.40 — — — —
Amidinothiourea 4.58 — — — 17.01
Disulfideꎬbis(1 ̄methylethyl) 4.61 — — — —
isulfideꎬdipropyl 4.61 2.19 — 9.66 —
2ꎬ6 ̄Bis(2 ̄methylpropyl)pyrazine 4.62 — 3.38 — —
1ꎬ3 ̄Dithianeꎬ2ꎬ2 ̄dimethyl 4.71 — — — —
Acetic acidꎬ2 ̄( thiocarboxy)hydrazideꎬO ̄methyl ester 4.71 0.88 — — —
4 ̄Thiazolidinoneꎬ3 ̄amino ̄2 ̄thioxo 4.71 — — 6.67 —
3 ̄Nitrophthalhydrazide 4.73 — 1.58 — —
Ethaneꎬ1 ̄(4ꎬ4ꎬ4 ̄trifluoro ̄1ꎬ3 ̄dithiobutyl)
 ̄2 ̄(3ꎬ3ꎬ3 ̄trifluoro ̄1ꎬ2 ̄ dithiopropyl)
5.29 — — — —
3 ̄Vinyl ̄1ꎬ2 ̄dithiacyclohex ̄4 ̄ene 5.76 — — — 2.90
3 ̄Vinyl ̄1ꎬ2 ̄dithiacyclohex ̄5 ̄ene 6.07 — — — 1.27
Furanꎬ2 ̄methyl ̄5 ̄(methylthio) 6.35 0.49 — — —
Trisulfideꎬdipropyl 7.58 — — — —
Phenethylamineꎬ N ̄methyl ̄beta.ꎬ3ꎬ4 ̄tris( trimethylsiloxy) 11.17 — — — —
Glaucine 11.28 — — — —
N ̄Methyladrenalineꎬtri ̄TMS 11.35 — 3.08 — —
Benzoic acidꎬ2ꎬ4 ̄bis [( trimethylsilyl)oxy]  ̄ꎬtrimethylsilyl ester 11.35 — — — —
Phenethylamineꎬ N ̄methyl ̄.beta.ꎬ3ꎬ 4 ̄tris( trimethylsiloxy) 11.39 — — — —
Isoproterenol tri ̄TMS derivative 11.42 — 2.66 — —
Isoproterenol tri ̄TMS derivative 11.63 — — — —
Benzeneacetic acidꎬ .alpha.ꎬ3ꎬ4 ̄tris[( trimethylsilyl)oxy]  ̄ꎬ methyl ester 11.63 — — — —
Terbutalineꎬ N ̄trifluoroacetyl ̄oꎬoꎬo ̄tris( trimethylsilyl)derivative 11.63 — — — 9.21
Benzen ̄ eaceticacidꎬ alpha.ꎬ3ꎬ4 ̄tris[( trimethylsilyl)oxy]  ̄ꎬtrimethylsilyl ester 11.64 — — — —
4 ̄(3ꎬ4 ̄Dimethoxybenzylidene)  ̄1 ̄(4 ̄nitrophenyl)
 ̄3 ̄phenyl ̄2 ̄ pyrazolin ̄5 ̄one
12.89 0.32 — — —
(+ ̄)  ̄5 ̄(1 ̄Acetoxy ̄1 ̄methylethyl)  ̄2 ̄methyl
 ̄2 ̄cyclohexene ̄1 ̄ one semicar bazone
13.31 — — — —
2ꎬ4 ̄Di ̄tert ̄butylthiophenol 15.74 2.61 — — —
1ꎬ4 ̄Benzenediolꎬ2ꎬ5 ̄bis(1ꎬ1 ̄dimethylethyl) 15.98 1.01 — — —
Glaucine 16.35 — 1.496 — —
1H ̄Indoleꎬ2 ̄methyl ̄3 ̄phenyl 17.69 — — — —
total detected compounds 34 20 12 21
134
 
植物病理学报 44卷
参考文献
[1]   Wang F Cꎬ Qiu Dꎬ Wang H Cꎬ et al. Study on the
fatty acid in seed oils from Allinm fistulosum and
A.tuberosum ( in Chinese ) [ J ] . Journal of Hebei
Agricultural Sciences(河北农业科学)ꎬ 2009ꎬ 13(9):
49-50.
[2]   Chung M S. Volatile compounds of the cultivated
dumebuchu (Allium senescens L. var. senescens) [J] .
Food Science and Technologyꎬ 2010ꎬ 19(6):1679 -
1682.
[3]   Rattanachaikunsopon Pꎬ Phumkhachorn P. Diallyl
sulfide content and antimicrobial activity against food ̄
borne pathogenic bacteria of chives (Allium schoeno ̄
prasum) [J] . Biosci. Biotechnol. Biochem.ꎬ 2008ꎬ 72
(11):2987-2991.
[4]   Najjaa Hꎬ Neffati Mꎬ Zouari Sꎬ et al. Essential oil
composition and antibacterial activity of different
extracts of Allium roseum L.ꎬa North African endemic
species [J] . Comptes Rendus Chimieꎬ 2007ꎬ 10(9):
820-826.
[5]   Feng Yꎬ Yang J Mꎬ Liang X Mꎬ et al. GC ̄MS
Analysis of constituents with inhibitory effect on
Fusarium oxysporum f. sp. cubense in the extractives of
two Alliums( in Chinese) [ J] . Journal of Instrumental
Analysis(分析测试学报)ꎬ 2011ꎬ 30(8):941-944.:
[6]   Feng Yꎬ Yang J Mꎬ Chen Rꎬ et al. GC ̄MS analysis of
solvent extracts from chinese chives and their inhibi ̄
tory action on banana vascular wilt( in Chinese) [ J] .
Journal of Instrumental Analysis (分析测试学报)ꎬ
2011ꎬ 30(1):103-107.
[7]   Pyun M Sꎬ Shin S. Antifungal effects of the volatile
oils from Allium plants against Trichophyton species
and synergism of the oils with ketoconazole [ J ] .
Phytomedicineꎬ 2006ꎬ 13(6):394-400.
[8]   Yin M Cꎬ Tsao S M. Inhibitory effect of seven Allium
plants upon three Aspergillus species [J] . International
Journal of Food Microbiologyꎬ1999ꎬ 49(1-2):49-56.
[9]   Liu J Tꎬ Zhao Lꎬ Su Wꎬ et al. Research progress of
bioactive constituent and molecular biology in Allium
tuberosum ( in Chinese ) [ J ] . Food Science and
Technology(食品科技)ꎬ 2006ꎬ(8):67-70.
[10] Wang Xꎬ Wu Rꎬ Zhang Lꎬ et al. GC ̄MS analysis of
chemical compositions and antimicrobial activity of
volatile oil from Allium tuberosum against common
pathogenic bacteria( in Chinese)[J] . Chinese Veterina ̄
ry Science(中国兽医科学)ꎬ 2012ꎬ 42(2):201-204.
[11] Wang Xꎬ Zhao Z Gꎬ Wu Rꎬ et al. In vitro bacteriosta ̄
sis of eight chinese herbal medicines on common
pathogenic bacteria( in Chinese)[J] . Journal of Gansu
Agricultural University(甘肃农业大学学报)ꎬ 2010ꎬ
45(2):25-29.
[12] Seo K Iꎬ Moon Y Hꎬ Choi S Uꎬ et al. Antibacterial
activity of S ̄methyl methane thio sulfinate and
S ̄methylꎬ 2 ̄propene ̄1 ̄thiosulfinate from chinese chive
toward Escherichia coli O157: H7 [ J ] . Biosci.
Biotechnol. Biochem.ꎬ 2001ꎬ 65(4):966-968.
[13] Mai M Xꎬ Huang H Qꎬ Bao S X. Advances on Fusari ̄
um oxysporum f. sp. cubense Race 4( in Chinese)[ J] .
Chinese Journal of Biological Control (中国生物防
治)ꎬ 2009ꎬ 25(S1):71-75.
[14] Feng Yꎬ Yang J Mꎬ Wang X Rꎬ et al. Inhibitory
effects of Allium tuberosum and Allium fistulosum juice
on Fusarium oxysporum f.sp.cubense( in chinese)[ J] .
Journal of Huazhong Agricultural University(华中农业
大学学报)ꎬ 2010ꎬ 29(3):292-294.
[15] Fang Z D. Research Method of Plant Pathology ( in
Chinese) [M] . Beijing:China Agricultural Press (北
京:中国农业出版社)ꎬ 1998:123-124.
责任编辑:张宗英  曾晓葳
234