全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(1): 32-36(2012)
收稿日期: 2011-06-11; 修回日期: 2011-11-25;
基金项目: 转基因生物新品种培育重大专项 (2009ZX08003-014B); 山东省科技攻关项目 (2009GG10009021); 山东省现代农业
产业技术体系
通讯作者: 李向东,教授,主要从事植物病毒学研究; E-mail:xdongli@sdau. edu. cn
共同第一作者: 崔小雯(1987 - ),女,山东青州人,硕士研究生,主要从事植物病毒学研究; E-mail: echowenzi@163. com;
高 波(1985 - ),男,河北邯郸人,硕士研究生,主要从事植物病毒学研究; E-mail: gaobo89@163. com。
白草花叶病毒承德玉米分离物 3′-cDNA片段序列分析
崔小雯1#, 高 波1#, 许斐斐1, 李向东1*, 张春庆2, 苗洪芹3
( 1 山东农业大学植物保护学院植物病理学系, 泰安 271018; 2 山东农业大学农学院, 泰安 271018; 3河北省农科院植保所, 保定 071000)
摘要:采自河北承德 11 个表现矮花叶症状的玉米样品,用甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)和白草花叶病毒
(Pennisetum mosaic virus, PenMV)简并引物扩增了基因组 3′ 端约 2. 1 kb的片段并进行测序。 Blast 结果表明其中 8 个样
品含有 PenMV。 扩增到的 PenMV序列均为 2 135 nt,包括部分 NIb基因(985 nt)、完整的 CP基因(909 nt)和 3′-UTR(241
nt)。 这 8 个分离物 CP基因和 3′-UTR与 GenBank上其他 PenMV分离物相应序列的核苷酸一致率分别为 89. 8% ~ 93． 4%
和 95. 9% ~ 97. 9% 。 根据扩增的 2 135 nt序列和 CP基因序列构建系统发育树,8 个分离物与 GenBank上其他 PenMV分离
物都分为 2 个组:山西组和承德组。 重组分析表明 CD9 的 CP基因存在重组。
关键词: 白草花叶病毒; 玉米; 系统发育分析; 重组
Sequencing and analysis of the 3′-terminal genome of Pennisetum mosaic virus
isolates from maize plants in Chengde 　 CUI Xiao-wen1, GAO Bo1, XU Fei-fei1, LI
Xiang-dong1, ZHANG Chun-qing2, MIAO Hong-qin3 　 ( 1 Department of Plant Pathology, College of Plant Protection,
Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 2 College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Tai’ an
271018, China; 3 Institute of Plant Protection, Hebei Academy of Agricultural Sciences, Baoding 071000, China)
Abstract: Totally 11 maize samples showing dwarf mosaic symptoms were collected from Chengde, Hebei
Province. The 3′-terminal 2. 1 kb genomic fragments were amplified with degenerate primers for Sugarcane
mosaic virus (SCMV) and Pennisetum mosaic virus (PenMV) and then sequenced. The Blast results showed
that eight samples were infected with PenMV. The cloned genome of these eight isolates were all 2 135 nucleo-
tides (nt) long, including partial NIb gene (985 nt), complete CP gene (909 nt) and the 3′-UTR (241 nt) .
The CP gene and 3′- UTR shared nt identities of 89. 8% - 93. 4% and 95. 9% - 97. 9% , respectively, with
the corresponding PenMV sequences available in the GenBank. In the phylogenetic trees constructed with the
3′-terminal 2 135 nt sequence and CP gene, all the PenMV isolates were divided into two groups: Shanxi
group (SX) and Chengde group (CD) . Recombination event was detected in the CP gene of isolate CD9.
Keywords: Pennisetum mosaic virus; maize; phylogenetic analysis; recombination
中图分类号: S435. 131; Q939. 46　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)01-0032-05
　 　 矮花叶病毒病是严重危害世界玉米生产的主
要病害之一。 甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic vi-
rus, SCMV)、玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mo-
saic virus, MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mo-
saic virus, SrMV)、约翰逊草花叶病毒( Johnsong-
rass mosaic virus, JGMV) [1]、玉米花叶病毒(Zea
　
　 1 期 　 　 崔小雯,等:白草花叶病毒承德玉米分离物 3′-cDNA片段序列分析
mosaic virus, ZeMV) [2]和白草花叶病毒(Pennise-
tum mosaic virus, PenMV) [3]都可侵染玉米引起矮
花叶病。 引起我国玉米矮花叶病的毒原为 SCMV
和 PenMV,其中 SCMV在我国玉米上的发生较多,
而 PenMV的发生较少,且多限于山西省。
PenMV是马铃薯 Y 病毒属(Potyvirus)甘蔗花
叶病毒亚组的成员。 1986 年,石银鹿等首次从白草
上分离出该病毒,并鉴定为 MDMV-G株系,在随后
的研究中又先后被鉴定为白草花叶病毒(Flaccid
pennisetum mosaic virus, FPMV)和 SrMV-SCH 株
系[4 ~ 6]。 2003年,Fan 等对一个山西白草分离物的
基因组 3′ 端核苷酸序列特性进行了研究,并将其暂
定名为白草花叶病毒 PenMV[3]。 2004 年,Fan 等在
自然发病的玉米上分离到该病毒[7]。
本研究从河北承德 8 个玉米样品中检测到
PenMV,克隆并测定了其基因组 3′端 2 135 nt的序
列,分析了与 GenBank中已有 PenMV 分离物相关
序列的一致率、系统发育关系,并测定了其中 2 个
分离物对不同玉米品种的致病力。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
疑似矮花叶病的玉米样品采自河北承德。 克
隆载体 pMD18-T、T4 DNA 连接酶和 Taq DNA 聚
合酶购自 TaKaRa 公司,反转录酶 EasyScript RT、
DNA凝胶回收试剂盒和 Trizol试剂购自 TransGen
公司。 感受态细胞 E. coli TL-Blue 为本实验室提
供,其他化学试剂均为国产分析纯。 晋农黄土高粱
和 17 个玉米品种:登海 3 号、登海 6213、浚原单 1
号、鲁种 99118、振杰 3 号、粟玉 1 号、粟玉 2 号、农
大 108、郑单 958、登海 3622、承玉 10 号、承玉 18
号、枣玉 2044、联丰 20、鲁单 9032、蠡玉 35、农华
101 购自种子公司。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 植物总 RNA 的提取　 利用 Trizol 试剂提
取植物总 RNA,具体操作按照说明书进行。
1. 2. 2　 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 　 根据
已知 SCMV和 PenMV序列设计上游简并引物 SC-
MV-2F(5′-ACHCGNACTTTYACAGCAGC-3′) (H
=A / C / T, N = A / C / G / T, Y = C / T)和下游简并
引物 Oligo(dT)18 (5′- CAGGATCCAAGCTTTTTT-
TTTTTTTTTTTT -3′)。 以 Oligo(dT)18为引物进行
反转录,体系为:总 RNA 0. 1 ~ 5 μg、5 × ES-RT
buffer 4 μL、10 mmol / L dNTPs 1 μL、10 μmol / L
Oligo(dT) 18 1 μL、反转录酶 ES-RT 1 μL、RNA 酶
抑制剂 0. 5 μL,加 RNase-free水至 20 μL。 反应条
件为 42℃ 50 min,70℃ 15 min。 以反转录产物为
模板进行 PCR扩增,体系为:10 × PCR buffer 2. 5
μL、25 mmol / L MgCl2 1. 5 μL、2. 5 mmol / L dNTPs
1. 5 μL、反转录产物 2. 5 μL、10 μmol / L 引物 SC-
MV-2F和 Oligo ( dT) 18各加 1 μL、5 U / μL Taq
DNA聚合酶 0. 3 μL,加 ddH2O至 25 μL。 反应条
件为:94℃ 预变性 3 min,然后 94℃ 30 s,50℃ 30
s,72℃ 2 min 30 s,共 30 个循环;最后 72℃延伸 10
min。
1 . 2 . 3 　 外源片段的连接转化和阳性克隆筛选
PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下切下
目的条带,用 DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的
DNA片段。 将 DNA片段连接到 pMD18-T载体后
转化感受态细胞 E. coli TL-Blue。 用灭菌牙签挑
取单菌落,接种于含氨苄青霉素的 LB 液体培养基
中,于 37℃、200 r / min 培养 12 ~ 14 h。 用碱裂解
法提取质粒,于 1% 的琼脂糖凝胶中电泳,并以
pUC18 空载体为对照,初步筛选重组质粒,经 PCR
确定最终重组质粒。
1. 2. 4　 序列测定与分析　 将鉴定为阳性的克隆送
上海博尚公司测序,每个分离物至少测定 2 次独立
PCR得到的克隆各 1 个。 用 DNAMAN 和 DNAS-
tar软件比较所得序列与 GenBank 中 PenMV 序列
的一致率,用 MEGA4. 1 软件构建系统发育树(保
留 Bootstrap值大于 50%的分支)。 用 RDP3 软件
的 6 种程序进行重组分析。
1. 2. 5　 接种　 取 0. 1 g样品加 1 mL 0. 01 mol / L磷
酸盐缓冲液(pH 7. 0)研磨成匀浆,加入少量金刚砂
混匀后摩擦接种 3 ~ 4 叶期高粱和玉米植株幼苗。
毒源先接种保存于高粱植株上。 挑选鉴定为 Pen-
MV的 2个样品接种到 17 个玉米品种上,每个品种
接 5盆,每盆 3 ~5棵,接种 5 d后开始观察症状。
2　 结果
2. 1　 RT-PCR扩增和序列特征
从河北承德共采集 11 个样品,用 SCMV 和
33
　
植物病理学报 42 卷
PenMV的简并引物检测发现其中 10 个样品呈阳
性,依次命名为 CD1-CD10,扩增产物都在 2. 1 kb
左右,与预期大小一致。 测序后经 Blast 分析发现
编号为 CD2-CD9(登录号 JN083843-JN083850)的
分离物序列与已报道 PenMV 具有较高一致率,而
CD1、CD10 分离物序列与已报道 SCMV 具有较高
一致率。
这 8 个 PenMV 分离物扩增的基因组均为
2 135 nt,包括部分 NIb基因序列(985 nt),完整的
CP基因序列(909 nt)和 3′-UTR序列(241 nt)。 在
推定的氨基酸序列中,NIb 基因序列含有依赖
RNA的 RNA 聚合酶共有的 GDD保守基序,与 CP
的切割位点为 Q / S;CP 含有 302 个氨基酸,N′ 端
含有马铃薯 Y病毒属病毒蚜虫非持久性传播所需
要的 DAG基序。
2. 2　 序列一致率分析
获得的 8 个 PenMV 分离物基因组 3′端序列
(2 135 nt)间的核苷酸一致率为 92. 4% ~ 99. 9% 。
与 GenBank 上登录的分离物进行比对,8 个分
离物与已报道的 2 个山西分离物 PenMV-B和 Pen-
MV-C相应序列的一致率为 88. 5% ~ 89. 6% ,明显
低于 8 个分离物间的核苷酸一致率。 其中 CD9 与
同时测定的承德分离物序列一致率较低,而与
GenBank上分离物相应序列的一致率较高。 在单
个基因的一致率比对中,8 个分离物间 CP 基因的
核苷酸一致率和氨基酸一致率分别为 90. 9% ~
100%和 97. 4% ~ 100% ,与 GenBank 上分离物相
应序列的核苷酸和氨基酸一致率分别为 89. 8% ~
93. 4%和 97% ~ 99% ;8 个分离物间 3′-UTR 的核
苷酸一致率为 97. 9% ~ 100% ,与 GenBank 上分离
物相应序列的核苷酸一致率为 95. 9% ~ 97． 9% 。
不论是 CP基因还是 3′-UTR 间的比较,均是 CD9
与已报道山西分离物的序列一致率最高,而 CD2、
CD5、CD7 与已报道分离物相应序列的一致率
较低。
2. 3　 系统发育关系分析
以 SCMV为外组,用 CD2-CD9 8 个分离物以
及 GenBank中已登录的其他 PenMV 分离物 3′ 端
2 135 nt序列和 CP 基因序列分别构建系统发育
树。 根据 3′ 端 2 135 nt 序列构建系统发育树(图
1-A),承德样品聚为一簇,山西分离物 PenMV-B
和 PenMV-C聚为一簇。 根据地理来源的不同,可
分为承德组(CD)和山西组(SX)。 根据 CP 基因
序列构建系统发育树(图 1-B),分离物 CD2-CD8
仍聚在承德组(CD),而分离物 CD9 与山西的分离
物一同聚到了山西组(SX)。
2. 4　 重组分析
用 RDP3 软件对上述 PenMV 分离物的 CP 基
因进行重组分析,其中用 SIScan、GENECONV、
MaxChi和 Chimaera程序分析时均发现 CD9 有重
组现象,且 SIScan分析时有明显的重组现象(P =
8. 169 × 10 -7,Z = 4. 285)。 其中 CD9 CP 基因的
1 ~ 271 nt、472 ~ 909 nt 来源于分离物 CD2,而 272
~ 471 nt 来源于分离物 PenMV-C (DQ977725 )
(图 2)。
2. 5　 接种结果
将 CD1-CD10 分别接种高粱,一周后植株开
始表现症状。 8 个 PenMV分离物(CD2 - CD9)在
高粱上均引起系统性的叶脉间褪绿,呈深绿浅绿相
间的断续条纹花叶。 CD1 和 CD10 2 个 SCMV 分
离物在高梁上引起红色条斑。 选择分离物 CD2 和
CD9 分别接种 17 个玉米品种。 4 周后部分玉米植
株开始表现出系统花叶症状。 接种 CD2 后有 3 个
玉米品种发病,玉米品种和发病率分别为:登海 3
号为 14. 3% ,登海 6213 为 19. 0% ,农华 101 为
28． 6% 。 而接种 CD9 后只有登海 6213 一个玉米
品种发病,发病率仅为 8. 7% 。
3　 结论和讨论
本研究用 SCMV和 PenMV简并引物,对承德
地区 11 个疑似玉米矮花叶病毒病样品进行 RT-
PCR检测,共检测出 2 个 SCMV 分离物和 8 个
PenMV分离物。 另外 1 个样品表现疑似矮花叶病
症状,但用 SCMV和 PenMV的简并引物没有扩增
出目的片段,用可能侵染玉米的其他病毒的引物进
行 RT-PCR检测也没有检测出目的条带,同时样品
中也不含 dsRNA,推测样品没有受到病毒侵染。
之前关于PenMV的报道大多限于山西省,在河北
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　 1 期 　 　 崔小雯,等:白草花叶病毒承德玉米分离物 3′-cDNA片段序列分析
Fig. 1　 Phylogenetic trees constructed with the 3′-terminal 2135 nt (A)
and the coat protein gene (B) of PenMV
Fig. 2　 Recombination pattern of the CP gene of CD9
省尚属首次发现。 PenMV有进一步向其他玉米产
区扩散的可能。
马铃薯 Y病毒属病毒的 CP 基因广泛应用于
系统发育关系分析[8]。 根据 3′端 2 135 nt 序列和
CP基因序列构建系统发育树,PenMV 被分成了和
地理来源相关的承德组和山西组。 但 CD9 却分别
被分在了承德组和山西组,暗示 CD9 分离物的基
因组可能有重组。 重组分析表明,CD9 分离物是
承德分离物 CD2 和山西分离物 PenMV-C 重组的
结果。 重组是一种成功进化的结果,在马铃薯 Y
病毒属病毒中非常普遍[9]。 病毒可以通过重组来
克服寄主的抗性,扩大寄主范围,提高对环境的适
53
　
植物病理学报 42 卷
应性[10,11]。
病毒的复合侵染在自然界非常普遍,Jiang[12]
发现在表现为粗条纹花叶的玉米上存在 SCMV 和
PenMV的复合侵染。 本研究中的 10 个样品用 SC-
MV和 PenMV 的特异性引物进行检测,并没有发
现复合侵染的现象(数据未列出),生物学实验也
支持这一结果。 选择 PenMV 分离物的 CD2 和
CD9 为代表,测定了不同玉米品种对承德地区
PenMV分离物的抗病性。 结果表明,供试的玉米
品种对这 2 个 PenMV分离物都有较强的抗性。 但
PenMV有广泛的寄主范围,目前明确的寄主有玉
米、高粱、白草、狗尾草、矛叶荩草、虎尾草,牛筋草、
狼尾草、大油芒多种禾本科植物,且病毒可由桃蚜、
麦长管蚜、禾谷缢管蚜和麦二叉蚜 4 种蚜虫以非持
久性方式进行传播[13],尤其是病毒有可能通过遗
传重组提高其适应性和致病力,因此对 PenMV 的
检测预警不容忽视。
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责任编辑:于金枝
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