全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 80-84(2011)
收稿日期: 2009-11-20; 修回日期: 2010-09-14
基金项目: 现代农业产业技术体系专项资金(Nycytx-35-gw08); 国家“863”项目(2006AA10Z1B9, 2006AA100108, 2006AA10A116); 国
家支撑计划(2006BAD01A7, 2009BAD8B00); 黑龙江新世纪人才培养计划(1152NCET003); 东北农业大学创新团队专项基
金(CXT002-3-2)
通讯作者: 许向阳,研究员,主要从事番茄遗传育种研究; Tel: 0451-55190214, E-mail: xxy709@126. com
第一作者: 雷 娜(1981 - ),女,黑龙江省哈尔滨人,硕士,主要从事蔬菜育种研究; E-mail: leina1236@sina. com。
番茄黄萎病抗病基因 Ve的 AFLP和 SSR分子标记
雷 娜2, 李景富1, 康力功1, 王傲雪1, 许向阳1*
( 1东北农业大学园艺学院, 哈尔滨 150030; 2哈尔滨市农业科学院, 哈尔滨 150070)
摘要: 本研究以番茄抗病品种 05046 与感病品种 051355 配制杂交组合,接种鉴定 F1 代及 F2 代分离群体的黄萎病发生情
况,结果表明,番茄黄萎病属单基因显性遗传。 用 545 对 AFLP引物和 101 对 SSR引物对两个亲本、抗感池及 F2 代分离群
体进行 AFLP和 SSR分析,得到 3 个与番茄抗黄萎病基因 Ve 连锁的 AFLP 标记和 1 个 SSR 标记,分别是 E66M84-A、
E78M84-D、E66M40-A和 SSR599,与抗病基因 Ve的连锁遗传距离分别为 10. 3、14. 2、30. 5 和 12. 5 cM。
关键词: 番茄; 黄萎病; AFLP分子标记; SSR分子标记
AFLP and SSR molecular markers linked to Verticillium wilt resistance gene Ve in
tomato　 LEI Na2, LI Jing-fu1, KANG Li-gong1, WANG Ao-xue1, XU Xiang-yang1 　 ( 1College of horti-
culture, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2Harbin Academy of Agricultural Science,Harbin 150070,China)
Abstract: A cross between Verticillium wilt resistant tomato variety 05046 and susceptible variety 051355 was
made for mapping Verticillium wilt resistance gene(s) . Through inoculation test on its F1 and F2 progeny, it
was proved that Verticillium wilt resistance gene was a single recessive gene. With 545 AFLP primer combina-
tions and 101 SSR primer combinations, AFLP and SSR analysis was performed on two parents,their F2 resis-
tant and susceptible bulks and F2 progeny. Three new AFLP markers and one new SSR marker linked to the
Verticillium wilt resistance gene-Ve gene were identified in the study. Three AFLP markers E66M84-A,
E78M84-D and E66M40-A were mapped at 10. 3 cM,14. 2 cM and 30. 5 cM genetic distance from the Ve
gene respectively. The marker SSR599 was 12. 5 cM away from the Ve gene.
Key words: tomato; Verticillium wilt; AFLP molecular markers; SSR molecular markers
中图分类号: S432. 4　 　 　 文献标识码: A　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)01-0080-05
　 　 番茄黄萎病是番茄生产特别是保护地栽培的
重要病害之一,除了可以大幅度降低产量之外,还
严重降低番茄果实的品质而使其丧失商品性,是番
茄生产上一个重要的限制性因素。 10 年前该病害
在我国很少发生,山西关中地区较早发生这种病
害,黑龙江地区也有报道。 但是由于番茄生产呈产
业化、规模化发展,大面积集中栽培使品种单一化
和高度设施化,加之黑龙江省保护地番茄栽培面积
的不断扩大和不合理的耕作方式,使该病害有逐渐
加重和蔓延的趋势,从以前的次要病害上升为主要
病害。
轮枝孢属(Verticillium)的大丽轮枝菌(Verti-
cillium dahliae Kleb. )和黑白轮枝菌(V. albo-atrum
Reinke and Berth)是引发多种植物黄萎病的病原
菌,可侵染 660 多种植物,包括多种农作物。 两个
种都侵染番茄,但由黑白轮枝菌引起的较少,只在
　
　 1 期 雷 娜,等:番茄黄萎病抗病基因 Ve的 AFLP和 SSR分子标记
美国等少数几个国家有报道[1],主要以大丽轮枝
菌危害严重。 我省番茄黄萎病亦属轮枝孢属的大
丽轮枝菌。
番茄黄萎病菌已发现两个生理小种,生理小种
1 发现较早,分布广泛,在 30 年代就有发生。 1957
年在加拿大发现生理小种 2,加利福尼亚、法国南
部、意大利、罗马尼亚、智利、南非、希腊和日本先后
报道了生理小种 2 的存在。 经 You[2]鉴定,哈尔滨
地区的番茄黄萎病菌属于生理小种 1。
番茄抗黄萎病生理小种 1 的强弱取决于一个
单个控制基因 Ve,Ve 是由一个名为 peruvian 的野
生番茄衍生而来[3]。 1959 年,Rick 等[4]首次提出
Ve基因位于第 4 条染色体上与 e 位点连锁;1977
年,Kerr 等[5]认为该基因位于第 12 条染色体上,
与一个叶绿素缺失位点 alb 相距 39 个单位;1994
年,Kawchuk 等[6]利用 RAPD 方法对 Ve 进行标
记,通过 400 个随机引物的筛选,得到一个与其紧
密连锁的标记,遗传距离在 3. 5 ± 2. 7 cM 以内;
1998 年,Diwan等[7]利用 RFLP进行 Ve的制图,认
为 Ve基因位于番茄的第 9 染色体的短臂上,单一
位点紧密地与 RFLP 基因标记 GP39 相连;最近,
SCAR基因标记和 RFLP 基因标记被应用到对 Ve
基因的克隆中。 在我国,分子标记技术已开始被广
泛的应用到抗病、虫基因的定位中,但番茄抗黄萎
病基因的分子标记研究在我国仍属空白。
分子标记技术中,AFLP ( amplified fragment
length polymorphism) 目前被认为是一种十分理
想、有效的分子标记手段,它最早由荷兰 Kcygene
公司科学家 Zabeau 等[8]发明,与其它 DNA 分析
技术相比,具有很多优点:多态性丰富、DNA 用量
少、检测效率高、不受环境影响、无复等位效应、带
纹丰富以及无需预知基因组的序列信息等[9]。 而
SSR (simple sequence repeats) 因其微卫星标记多
态性高、重复性好、具有共显性、操作简单以及费用
低等多方面的优点,被广泛认为是取代 RFLP 之后
的第二代分子标记[10]。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
以抗黄萎病的 05046 为母本,感黄萎病的
051355 为父本配制杂交组合,获得 F1 代。 通过在
海南岛种植 F1 代获得 F2 代种子;用于种质资源抗
性筛选的 95 份番茄材料,由本课题组保存;番茄黄
萎病病原菌 V. dahliae 采自东北农业大学园艺试
验站。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 番茄黄萎病抗性苗期接种鉴定　 在培养基
上大量繁殖番茄黄萎病菌,采用浸根法接种于抗、
感亲本、F1 及 F2 代群体,15 d 后调查,记录发病情
况。 将 F2 代群体分为抗病和感病两类。
1. 2. 2　 DNA的提取　 F2 单株在发病高峰时取其
幼嫩叶片,称取 200 mg装在 EP 管内,采用改良的
CTAB法提取 DNA。
1. 2. 3　 AFLP标记　 以父本、母本和 F2 代群体的
DNA为模板进行酶切与连接,此反应在 37℃条件
下进行 12 h或过夜;然后用上述产物为模板进行
DNA片段的预扩增,根据琼脂糖凝胶电泳检测的
结果稀释相应倍数,用于选择性扩增;选择性扩增
的引物筛选采用 Michelmore 的混合分组分析法
(bulk segregant analysis,BSA),将扩增产物进行聚
丙烯酰胺凝胶电泳,统计条带确定连锁距离。
1. 2. 4　 SSR 标记 　 以父本、母本和 F2 代群体的
DNA为模板,引物筛选采用Michelmore的 BSA方
法,进行 SSR扩增反应,扩增产物进行聚丙烯酰胺
凝胶电泳,统计条带确定连锁距离。
1. 2. 5　 连锁关系作图　 对已经标记出的 AFLP标
记和 SSR标记应用 Mapchart2. 1 进行作图。
1. 2. 6　 番茄种质资源的黄萎病抗性筛选　 采用已
得到的 AFLP分子标记对 95 份番茄种质资源进行
了抗性筛选及鉴定,由此来验证 AFLP标记的实用
性与准确性。
2　 结果与分析
2. 1　 抗病性鉴定结果
在感病品种 051355 充分发病的情况下,参照
抗病亲本 05046 的抗性表现对 F2 代群体的 196 个
单株进行了番茄抗黄萎病鉴定,其中抗病 145 株,
感病 51 株,χ2 测验符合单显性基因的遗传规律
(表 1)。
18
　
植物病理学报 41 卷
Table 1　 Identification of Verticillium wilt resistance of tomato
Variety No. of plant
No. of plant
Resistant Susceptible
Expected ratio χ2 P0. 01
05046 30 30 0
051355 30 0 30
05046 ×051355 196 145 51 3∶ 1 0. 11 6. 63
2. 2　 AFLP标记
2. 2. 1 　 引物筛选　 用父母本 051355 和 05046 对
545 对选择性扩增引物筛选,筛出差异引物 398
对,筛出率 77. 73% 。 对抗感亲本筛选出的 398 对
多态性好的引物,在抗感池中进行复选,筛出 24 对
差异性大和多态性好的引物。
2. 2. 2　 F2 单株 PCR 扩增　 利用 F2 代群体共 196
株(其中 143 株表现抗病,53 株表现感病)对 24 条
多态性好、差异明显的 AFLP 引物进行扩增,通过
MAPMAKE3. 0 软件[11]对分离群体单株的抗病性
和分子标记的分离数据进行连锁分析,得出遗传距
离( cM)。 结果表明: E66M84-A、 E78M84-D 和
E66M40-A 的遗传距离分别为 10. 3、 14. 2 和
30. 5 cM。
2. 3　 SSR标记
用父母本 051355 和 05046 对 101 对 SSR引物
进行筛选,筛出二者间有差异的引物 35 对,然后在
抗感池中进行复选,筛出 13 对差异明显且稳定的
引物。 用筛出的 13 对 SSR引物,分别以 196 个 F2
代单株 DNA为模板进行 PCR扩增,然后通过聚丙
烯酰 胺 凝 胶 电 泳 检 测。 统 计 带 型 后 利 用
MAPMAKE 3. 0 软件[11]对分离群体单株的抗病性
和分子标记的分离数据进行连锁分析,结果表明:
SSR599 的遗传距离为 12. 5 cM。
2. 4　 连锁关系作图
对已经标记出的 3 个 AFLP 标记和 1 个 SSR
标记应用 Mapchart2. 1 进行作图(图 1)。
2. 5　 番茄种质资源的黄萎病抗性筛选
对供试的 95 份番茄材料进行人工鉴定,得到
免疫材料 3 份、高抗材料 3 份和抗病材料 34 份,同
时运用 AFLP 标记 E66M84-A 进行 AFLP 标记验
证分析,结果二者吻合度达 90. 5% ,说明本试验找
到的番茄抗黄萎病基因的特异分子标记可以用于
番茄育种材料抗黄萎病基因 ( Ve)的追踪选择
(表 2)。
Fig. 1 　 Linkage map of tomato Verticillium
wilt resistance gene
3　 讨论
1959 年,Rick 等[4]首次提出 Ve 基因位于第 4
条染色体上与 e位点连锁;但在 1977 年,Kerr等[5]
认为该基因位于第 12 条染色体上,与一个叶绿素
缺失位点 alb 相距 39 个单位;Kawchuk 等[6] 1994
年利用 RAPD方法对 Ve 进行标记,通过 400 个随
机引物的筛选,得到 1 个与其紧密连锁的标记,遗
传距离在 3. 5 ±2. 7 cM 以内;直到 1998 年,Diwan
等[7]利用 RFLP进行 Ve的制图,认为 Ve基因位于
番茄的第 9 染色体的短臂上,单一位点紧密地与
RFLP 基因标记 GP39 相连。通过本研究得到的
28
　
　 1 期 雷 娜,等:番茄黄萎病抗病基因 Ve的 AFLP和 SSR分子标记
Table. 2　 Germplasm source selection of tomato resistant to Verticillium wilt disease
Variety Inoculation test Molecular markers Variety Inoculation test Molecular markers
051294 S - 051151 S -
05818 R + 051375 S +
05883 R + 051338 R +
05892 S - 05854 R +
051078 R + 051200 S -
051336 R + 051366 R -
05826 S - 051394 R +
05828 S + 051249 R +
05824 R + 051150 S -
051377 R + 051085 R +
05962 R + 051287 R +
05937 R + 051310 S -
051382 R + 051391 R +
051109 S - 05963 R +
051186 R + 051376 R +
051026 R + 05877 S -
051389 R + 05898 R +
051204 S - 05888 R +
051289 R + 05891 R +
051337 S - 051092 R +
05850 R + 05914 R +
051141 R + 051359 S -
051390 R + 051242 S -
051049 R + 051124 S -
051108 R + 051339 S -
051172 S - 051251 R +
05881 R + 05862 S -
05892 R + 05855 R -
05830 R + 05926 R +
051358 S - 051247 S -
051202 S - 05837 R +
051385 R + 051374 R +
051341 R - 051139 S -
051364 S - 051393 S +
051288 S + 051138 S -
05860 S - 051378 R +
05899 R + 051158 S +
05915 R + 051166 R +
05825 R + 051035 S -
05813 R + 051113 R +
051384 R - 05927 R +
051363 S - 051093 S -
051354 S - 051401 S -
051361 S - 05809 S -
05808 S - 05852 R +
05895 R + 051357 R +
051365 R + 051162 R +
05829 R +
R: Resistant; S: Susceptible; + : Differential; - : Non-differential.
38
　
植物病理学报 41 卷
SSR标记证明 Ve基因位于第 9 条染色体上,与 Di-
wan 等的结果一致。 其中,得到的 AFLP 标记
E66M84-A与抗病基因间的连锁距离 10. 3 cM,虽
然与 Ve基因连锁不是特紧密,但通过对番茄材料
的分子和人工鉴定,吻合率较高,说明该标记可在
育种实践中发挥作用。 有了该标记,可以在苗期对
材料进行抗性鉴定,减少了时间、空间、人力、物力
等耗费。 本研究中得到的 4 个标记,与抗病基因
Ve间的遗传距离仍较大,可能是由于用于研究的
后代株数较少(196 株),亲本之间亲缘关系较近等
因素影响遗传距离的准确性,因此,进一步寻找紧
密连锁的标记和增加群体中单株数量是下一步研
究的重点。
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责任编辑:李晖
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