全 文 ：犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１４１７２ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
贾辉，陈秀蓉，芦光新，孔雅丽，杨成德．纤维素降解细菌的筛选、生物学特性及降解效果．草业学报，２０１６，２５（３）：６０６６．
ＪＩＡＨｕｉ，ＣＨＥＮＸｉｕＲｏｎｇ，ＬＵＧｕａｎｇＸｉｎ，ＫＯＮＧＹａＬｉ，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇＤｅ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｕｌｏｓｅｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒ
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（３）：６０６６．
纤维素降解细菌的筛选、生物学特性及降解效果
贾辉１，陈秀蓉１，芦光新２，孔雅丽１，杨成德１
（１．甘肃农业大学草业学院，草业生态系统重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；２．青海大学农牧学院草业科学系，青海 西宁８１００１６）
摘要：为了从东祁连山高寒草甸土壤中分离筛选纤维素分解细菌，本研究根据在羧甲基纤维素钠培养基和滤纸平
板培养基上的生长情况，初步筛选出３株具有较强纤维素分解能力的细菌，并对其生长条件进行了初步研究，结果
表明，３株菌的最适生长温度范围为２５～３０℃；最适生长ｐＨ 因菌种不同位于５～８之间；最适生长盐浓度位于
４％～５％。菌株Ｘ１２具有较好降解特性，根据形态观察、革兰氏染色及１６ＳｒＲＮＡ系统发育比较，鉴定该菌为芽孢
杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊ｓｐ．），是一株十分具有开发生产纤维素酶能力的菌株。
关键词：纤维素分解菌；筛选；生物学特性；降解效果
犐狊狅犾犪狋犻狅狀狅犳犮犲犾狌犾狅狊犲犱犲犵狉犪犱犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪犪狀犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犻狉犱犲犵狉犪犱犪狋犻狅狀
犪犮狋犻狏犻狋狔
ＪＩＡＨｕｉ１，ＣＨＥＮＸｉｕＲｏｎｇ１，ＬＵＧｕａｎｇＸｉｎ２，ＫＯＮＧＹａＬｉ１，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇＤｅ１
１．犓犲狔犔犪犫狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犈犮狅狊狔狊狋犲犿狅犳犕犗犈，犆狅犾犾犲犵犲狅犳犘狉犪狋犪犮狌犾狋狌狉犲，犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪；
２．犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犛犮犻犲狀犮犲，犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱犃狀犻犿犪犾犎狌狊犫犪狀犱狉狔犆狅犾犾犲犵犲狅犳犙犻狀犵犺犪犻犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犡犻狀犻狀犵８１００１６，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＥｉｇｈｔｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌｉｎｔｈｅｅａｓｔＱｉｌｉａｎＭｏｕｎｔａｉｎｓ．Ｏｆｔｈｅｓｅ，ｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｈａｄ
ａｈｉｇｈｅｒｃａｐａｃｉｔｙｆｏｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｃｅｌｕｌｏｓｅｗｈｅｎｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎａＣＭＣＮａｐｌａｔｅｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ，ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒａｎｇｅｏｆｔｈｅ４ａｃｔｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓ
２５－３０℃，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐＨｆｏｒｇｒｏｗｔｈｗａｓ５－８，ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｓｏｄｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ４％ｔｏ５％．Ａ
ｓｔｒａｉｎｄｅｓｉｇｎａｔｅｄＸ１２ｐｏｓｓｅｓｓｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｃｅｌｕｌｏｓｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ．Ｂａｓｅｄｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｇｒａｍｓｔａｉｎｒｅ
ａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ１６ＳｒＲＮＡｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｔｈｉｓｓｔｒａｉｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＢａｃｉｌｕｓ
（犅犪犮犻犾犾狌狊ｓｐ．）．Ｉｔｉｓａｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇｐｌａｎｔｃｅｌｕｌｏｓｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｃｅｌｕｌｏｓｅｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
纤维素是葡萄糖残基以β１，４糖苷键连接而形成的线性葡聚糖，是一种广泛存在于植物中的骨架多糖
［１２］。
纤维素丰富的糖源可以用于许多原料加工工业。遗憾的是许多纤维素废弃物通常被燃烧处理掉，这是一个普遍
存在于发展中国家甚至是全球的浪费现象［３４］，由此形成的环境污染问题和资源浪费都已经相当严重。因此，研
发大规模、工业化和经济节约的天然纤维素资源化转化技术是摆在当今世界的一大课题。利用微生物分解转化
纤维素类物质可以将其变为饲料、栽培基质、有机肥料、化工原料等［５７］。纤维素酶是纤维素降解过程中的重要酶
６０－６６
２０１６年３月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２５卷 第３期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３
收稿日期：２０１４０４０８；改回日期：２０１５０９０７
基金项目：国家自然科学基金项目（３１４６０１５２，４１２６１０６４）和青海省科技厅项目（２０１４ＺＪ９２４Ｑ）资助。
作者简介：贾辉（１９８１），男，甘肃古浪人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｈ６６＠１６３．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｘｉｕｒｏｎｇ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｌｕｇｘ７４＠ｑｑ．ｃｏｍ
类物质，包括３类可溶性细胞外的酶：１，４β内切葡聚糖酶，１，４β外切葡聚糖酶和β葡糖苷酶。许多微生物包括
许多细菌、真菌和放线菌都有产纤维素酶的能力。自然界中具有纤维素分解能力的菌株很多，例如：梭状芽孢杆
菌、球毛壳菌、木霉、青霉属、曲霉、担子菌、虫拟蜡菌、木腐菌和青霉菌等［８１０］。但目前获得的菌株其纤维素酶活
力普遍较低［１１１３］，即使酶活力很高的菌株继代培养后表现出退化或不稳定，这些因素一直是阻碍纤维素酶大规模
生产应用的瓶颈问题［１４１７］。筛选高效纤维素酶活力的菌株仍然是人们努力的目标［１８１９］。东祁连山高寒草甸金
枪河流域，植物群落多样性复杂，微生物资源丰富，本研究拟从该地区土壤中筛选高产纤维素分解细菌，通过对其
纤维素降解能力和生物学特性测定，旨在获得能够高效、快速降解纤维素的优良菌种。
１ 材料与方法
１．１ 材料
２０１３年５月土样采集自祁连山高寒草甸甘肃省天祝县金枪河地区。主要供试培养基有以下几种：羧甲基纤
维素钠（ＣＭＣＮａ）平板培养基：ＮａＮＯ３２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、ＫＣｌ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４０．５ｇ、ＦｅＳＯ４０．０１ｇ、ＣＭＣＮａ１０ｇ、
琼脂１０ｇ、蒸馏水１０００ｍＬ。滤纸平板培养基：ＮａＮＯ３２．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＣａＣｌ２·６Ｈ２Ｏ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４０．３ｇ、
ＮａＣｌ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３０．０１ｇ、滤纸条１０ｇ、蒸馏水１０００ｍＬ、无菌滤纸、ｐＨ自然。牛肉膏蛋白胨（ＮＡ）培养基：牛肉
膏３ｇ、蛋白胨５ｇ、琼脂８ｇ。ＮＢ培养基：牛肉膏３ｇ、蛋白胨５ｇ、葡萄糖２．５ｇ。
１．２ 方法
１．２．１ 具有降解纤维素能力的细菌分离 称取各样１０ｇ加入９０ｍＬ无菌水，将样品振荡１０～１５ｍｉｎ，使土
壤颗粒均匀分散成为悬液，静置数分钟，吸取１ｍＬ土悬液到９ｍＬ稀释液中，依次按１０倍法稀释，通常稀释到
１０－４成一系列稀释液。取１ｍＬ土悬液接种于羧甲基纤维素钠平板培养基上，用玻璃刮刀使其均匀涂抹于培养
基表面，每稀释度设３个重复，在２８～３０℃温箱中培养，待菌落长成后，按菌落特征归类和编号，然后将菌落特征
不同的细菌转入ＮＡ斜面培养基培养，纯化后保存备用。
１．２．２ 供试细菌分解纤维素能力的测定 对ＣＭＣＮａ分解能力的测定：挑取分离的细菌菌落接到ＣＭＣＮａ
平板培养基上，于２５℃避光培养７ｄ，采用刚果红染色，记录各菌株的透明圈大小。
对滤纸分解能力的测定：将分离得到的具有纤维素分解能力的菌株，接入ＮＢ培养基中２０℃摇床培养５ｄ后
制成菌悬液，于盛有５０ｍＬ液体培养基的１５０ｍＬ三角瓶中放入２．６ｃｍ×６．２ｃｍ的滤纸条，接入１ｍＬ菌液１００
ｒ／ｍｉｍ进行恒温振荡培养８ｄ，以滤纸条的断裂程度评价降解效果。
对中华羊茅（犉犲狊狋狌犮犪狊犻狀犲狀狊犻狊）凋落物分解能力的测定：称取５ｇ中华羊茅凋落物，放入盛有１００ｍＬ液体培
养基的２５０ｍＬ三角瓶中，然后接入１ｍＬ菌液，１００ｒ／ｍｉｍ进行恒温振荡培养１５ｄ后取出，烘干称重，按下列公
式计算中华羊茅的减重百分比，确定菌种分解中华羊茅凋落物的能力。
犠＝（犛－犛１）／犛×１００％
式中，犠 代表中华羊茅凋落物分解百分比，犛代表中华羊茅凋落物的原始干重，犛１ 为中华羊茅凋落物溶解后的烘
干量。
１．２．３ 纤维素降解菌的生长条件测定 最佳生长温度的测定：将复选出的菌种接于细菌液体培养基，分别置
于５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５℃等９个温度下悬浮培养，每处理３次重复，３ｄ后测定菌液的ＯＤ６００值，并根据
ＯＤ６００值的大小判断不同温度条件下菌体的生长状况，确定其最适生长温度。
最佳生长酸碱度的测定：ｐＨ值分别用４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５，９．０磷酸缓冲液配制
成１１个浓度，置于上述所测最适温度下培养，每处理３次重复。３ｄ后测定菌液的ＯＤ６００值，并根据ＯＤ６００值的大
小判断不同ｐＨ条件下菌体的生长状况，确定其生长的最适ｐＨ值。
耐盐能力的测定：在２８℃条件下，将ＮＡ培养液中ＮａＣｌ含量分别调到０．５％，１．０％，１．５％，２．０％，２．５％，
３．０％，３．５％，４．０％，５．０％，６．０％，７．０％，８．０％和９．０％，然后接入菌体。４８～７２ｈ后取出用分光光度计进行测
定，记录ＯＤ６００数值。
１６第２５卷第３期 草业学报２０１６年
１．２．４ 菌株的分子生物学鉴定 引物设计：根据１６ＳｒＤＮＡ两端的保守序列，设计１对细菌的通用引物。引
物１序列：５′ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡ３′；引物２序列：５′ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣ
ＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３′，由上海生物工程技术有限公司合成。
菌株ＤＮＡ的提取和纯化：采用Ｅｚｕｐ柱式细菌基因组ＤＮＡ抽提试剂盒，１６ＳｒＲＮＡ基因的扩增按文献［９］
进行。
系统发育分析：将纯化ＰＣＲ产物送至上海Ｓａｎｇｏｎ生物技术公司测序，并将获得的序列与ＮＣＢＩ数据库中已
报道的与该序列相似性较高的典型菌株的序列进行同源性比较。采用Ｃｌｕｓｔａｌ１．８软件进行多序列比对，再用
ＭＥＧＡ４．１中的Ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）方法构建系统发育树，用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ对系统树进行统计检验，确定菌株的
系统发育学地位。
１．３ 数据处理
所得数据用ＳＰＳＳ１７．０软件进行处理和分析，并用Ｅｘｃｅｌ软件作图。
２ 结果与分析
２．１ 菌种形态特征
将初次分离的８株细菌接在ＮＡ培养基上培养３ｄ后，对菌落形态特征进行描述（表１）。
表１ 菌落培养特征描述
犜犪犫犾犲１ 犆狌犾狋狌狉犪犾犳犲犪狋狌狉犲狊狅犳犫犪犮狋犲狉犻犪
菌种Ｓｔｒａｉｎ 菌落特征Ｃｏｌｏｎｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
Ｘ１１ 菌落呈淡粉色，表面粗糙并有突起，形状不规则。Ｔｈｅｃｏｌｏｎｉｅｓａｒｅｐａｌｅｐｉｎｋ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｉｓｒｏｕｇｈ，ｔｈｅｓｈａｐｅｉｓｉｒｒｅｇｕｌａｒ．
Ｘ１２ 菌落乳白色，表面无光泽且较粗糙，边缘不整。Ｔｈｅｃｏｌｏｎｉｅｓａｒｅｗｈｉｔｅ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｉｓｄｕｌａｎｄｒｏｕｇｈ，ｔｈｅｅｄｇｅｉｓｉｒｒｅｇｕｌａｒ．
Ｘ２ 菌落呈乳白色，表面光滑，形状为近似圆形。Ｔｈｅｃｏｌｏｎｉｅｓａｒｅｍｉｌｋｙｗｈｉｔｅ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｉｓｓｍｏｏｔｈ，ｔｈｅｓｈａｐｅｉｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙｃｉｒｃｕｌａｒ．
Ｘ３１ 菌落为粉红色，表面光滑，形状不规则。Ｔｈｅｃｏｌｏｎｉｅｓａｒｅｐａｌｅｐｉｎｋ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｉｓｒｏｕｇｈ，ｔｈｅｓｈａｐｅｉｓｉｒｒｅｇｕｌａｒ．
Ｘ３２ 菌落为白色近似透明，表面粗糙，形状不规则。Ｔｈｅｃｏｌｏｎｉｅｓａｒｅｗｈｉｔｅａｎｄｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｉｓｒｏｕｇｈ，ｔｈｅｓｈａｐｅｉｓｉｒｒｅｇｕｌａｒ．
Ｘ４ 菌落为乳黄色，表面光滑，形状为近似圆形。Ｔｈｅｃｏｌｏｎｉｅｓａｒｅｍｉｌｋｙｅｌｏｗ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｉｓｓｍｏｏｔｈａｎｄｔｈｅｓｈａｐｅｉｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙｃｉｒｃｕｌａｒ．
Ｘ５ 菌落为纯白色，表面粗糙，形状为近似圆形。Ｔｈｅｃｏｌｏｎｉｅｓａｒｅｐｕｒｅｗｈｉｔｅ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｉｓｒｏｕｇｈ，ｔｈｅｓｈａｐｅｉｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｃｉｒｃｌｅ．
Ｘ６ 菌落为纯白色，表面粗糙，菌落中心有一个圆形凸起，形状为圆形。Ｔｈｅｃｏｌｏｎｙｉｓｐｕｒｅｗｈｉｔｅ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｉｓｒｏｕｇｈ，ｔｈｅｃｏｌｏｎｙｃｅｎｔｅｒ
ｈａｓａｃｉｒｃｕｌａｒｂｕｌｇｅ．
２．２ 纤维素分解能力的测定
２．２．１ 菌种分解ＣＭＣＮａ能力测定 将８株分离
获得的具有纤维素分解能力的细菌，根据水解圈直径
（Ｄ２）与菌落直径（Ｄ１）的比值可以看出，菌株Ｘ１２分
解纤维素的能力最强，Ｘ１１和Ｘ２次之，Ｘ５的纤维素
分解能力最弱（表２）。
２．２．２ 滤纸崩解试验 对获得的８株纤维素分解
细菌进行摇瓶滤纸崩解试验，探究其纤维素分解能力，
在１５ｄ的滤纸崩解试验中，有３株细菌表现出明显的
滤纸降解效果（图１），其菌株Ｘ１１、Ｘ１２和Ｘ２中滤纸
基本完全崩解，摇瓶中的液体处于半清状，表明该３株
细菌对滤纸具有明显的分解能力。
２．２．３ 中华羊茅分解定量测定 根据获得的菌株
表２ 纤维素分解菌株的犆犕犆犖犪分解能力测定
犜犪犫犾犲２ 犇犻犪犿犲狋犲狉狉犪狋犻狅犫犲狋狑犲犲狀犮犲犾狌犾狅狊犲犱犲犮狅犿狆狅狊犻狀犵
犮犻狉犮犾犲犪狀犱犫犪犮狋犲狉犻犪犾犮狅犾狅狀狔狅狀犳犾犪狋狅犳犆犕犆犖犪
菌株编号Ｓｔｒａｉｎｎｕｍｂｅｒ Ｄ１（ｃｍ） Ｄ２（ｃｍ） Ｄ２／Ｄ１
Ｘ１１ ０．３７ ２．２７ ５．９７
Ｘ１２ ０．３０ ２．３８ ７．９３
Ｘ２ ０．２３ １．３７ ５．９６
Ｘ３１ ０．５１ ２．４２ ４．７１
Ｘ３２ ０．５７ ２．９２ ５．１２
Ｘ４ ０．５７ ２．０４ ３．５２
Ｘ５ １．４６ ３．５７ ２．４７
Ｘ６ ０．１９ ０．９３ ４．８９
Ｄ１：菌落直径Ｄｉａｍｅｔｅｒｏｆｔｈｅｃｏｌｏｎｙ；Ｄ２：水解圈直径Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｉｒ
ｃｌｅｄｉａｍｅｔｅｒ．
２６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３
在ＣＭＣＮａ平板上的生长情况和水解结果，以及滤纸的崩解试验结果，选择３株细菌Ｘ１１、Ｘ１２和Ｘ２进一步研
究它们对中华羊茅纤维素的分解效果。对３株细菌分别培养５，１０，１５ｄ后的中华羊茅重量变化情况进行了测
定，结果见图２和表３。
图１ 培养１５犱后菌株对滤纸的崩解效果
犉犻犵．１ 犇犻狊犻狀狋犲犵狉犪狋犻狅狀狅犳犳犻犾狋犲狉狆犪狆犲狉狑犻狋犺犻狊狅犾犪狋犲狊犪犳狋犲狉犮狌犾狋狌狉犻狀犵犳狅狉１５犱犪狔狊
图２ 培养１５犱后菌株对中华羊茅的分解效果
犉犻犵．２ 犇犻狊犻狀狋犲犵狉犪狋犻狅狀狅犳犉．狊犻狀犲狀狊犻狊狑犻狋犺犻狊狅犾犪狋犲狊犪犳狋犲狉犮狌犾狋狌狉犻狀犵犳狅狉１５犱犪狔狊
表３ 纤维素分解菌株对中华羊茅纤维素分解能力测定
犜犪犫犾犲３ 犆犺犪狀犵犲狊狅犳狇狌犪犾犻狋狔狅犳犉．狊犻狀犲狀狊犻狊犪犳狋犲狉犫犲犻狀犵犱犲犵狉犪犱犲犱犳狅狉１５犱犪狔狊犫狔３狊狋狉犪犻狀狊
项目Ｉｔｅｍ
时间Ｔｉｍｅ（ｄ）
５
Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ２
１０
Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ２
１５
Ｘ１１ Ｘ１２ Ｘ２
ＣＫ ５．００ ５．００ ５．００ ５．００ ５．００ ５．００ ５．００ ５．００ ５．００
残余质量Ｒｅｓｉｄｕａｌｍａｓｓ（ｇ） ４．５２ ４．３１ ４．４８ ３．８６ ３．２５ ３．９７ ３．１２ ２．２４ ３．３６
分解率Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏ（％） ９．８ １３．９ １１．３ ２２．８ ３５．０ ２６．３ ３６．２ ５５．４ ３２．８
培养５ｄ后，３株细菌对中华羊茅纤维素都有所分解，但差异性不显著，其中中华羊茅的分解率分别为９．８％，
１３．９％和１１．３％。培养１０ｄ后３株菌株对中华羊茅的分解率都有了显著的增加，分别为２２．８％，３５．０％和
２６．３％，尤其是菌株Ｘ１２降解中华羊茅纤维素的能力最高，继续培养至１５ｄ后菌株Ｘ１２使得中华羊茅的分解
率达到了５５．４％，分解效果明显。
２．３ 菌株生物学特性测定
２．３．１ 温度对菌体生长的影响 试验结果表明，接菌培养３ｄ后，３种菌在１５～４５℃均能够生长。Ｘ１１最适
生长温度为２５℃，在３０和３５℃均生长良好，与２５℃相比差异显著（犘＜０．０５），低于２５℃，在１５，１０和５℃时菌体
生长明显受阻，与２５℃相比差异显著（犘＜０．０５）；Ｘ１２最适生长温度为２５℃，低于２０℃或高于３０℃对菌体生长
３６第２５卷第３期 草业学报２０１６年
均产生明显的差异（犘＜０．０５）；Ｘ２在１５～４５℃之间
生长差异不显著（犘＞０．０５），且随着温度的上升，生
长有增强趋势，属高温菌（表４）。
２．３．２ ｐＨ对菌体生长的影响 试验结果表明，
３株细菌在ｐＨ为４．５～８．５之间均能生长，但最适
生长的ｐＨ 值存在较大差异。Ｘ１１偏酸性，最适
ｐＨ值为５．５，与ｐＨ为５．０差异不显著（犘＞０．０５），
大于５．５或小于５．０均存在显著性差异（犘＜
０．０５）；Ｘ１２生长的酸度范围较广；Ｘ２的最适ｐＨ
均为８．５，大于或小于８．５存在显著差异（犘＜
０．０５）。总体可见偏酸环境（ｐＨ＜４．５）对３种菌均
有不同程度的抑制作用，与对照无明显差异（犘＞
０．０５）（表５）。
２．３．３ 盐浓度对菌体生长的影响 试验表明，每
种菌体的最适盐浓度不同，Ｘ１１最适盐浓度为
６．０％，与５．０％差异不显著（犘＞０．０５），大于６．０％
或 小于５．０％均存在显著差异（犘＜０．０５）；Ｘ１２最
表４ 温度对菌株生长的影响
犜犪犫犾犲４ 犈犳犳犲犮狋狅犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀犵狉狅狑狋犺狅犳狋犺犲狊狋狉犪犻狀狊
温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
Ｘ１１
ＯＤ 犉０．０５
Ｘ１２
ＯＤ 犉０．０５
Ｘ２
ＯＤ 犉０．０５
ＣＫ
ＯＤ 犉０．０５
５ ０．０７６０ ｅｆ ０．０７７７ ｅ ０．０７１０ ｂ ０．０５７３ ａ
１０ ０．０６００ ｆ ０．０９６０ ｄｅ ０．０７４３ ｂ ０．１０３７ ａ
１５ ０．１５５５ ｄｅ ０．１１７７ ｃｄ ０．１５８３ ａ ０．１０２０ ａ
２０ ０．２１７０ ｃｄ ０．１６００ ｂ ０．１５２０ ａ ０．０９０３ ａ
２５ ０．４１８５ ａ ０．２４０３ ａ ０．１４１７ ａ ０．０６９０ ａ
３０ ０．３７３０ ａｂ ０．１６２７ ｂ ０．１９３７ ａ ０．０６００ ａ
３５ ０．２６９５ ｂｃ ０．１６１０ ｂ ０．１７００ ａ ０．０６０３ ａ
４０ ０．２７１５ ａｂ ０．１５３０ ｂｃ ０．０７７７ ａ ０．０５７３ ａ
４５ ０．３０５０ ｂ ０．１５７７ ｂ ０．１８２３ ａ ０．３２１０ ａ
ＯＤ：平均ＯＤ值 ＭｅａｎｏｆＯＤ．同列不同字母表示差异显著（犘＜０．０５）。
下同。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｃｅｓ（犘＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
适盐浓度为３．０％，与１．０％，１．５％，２．０％和２．５％差异不显著（犘＞０．０５），说明Ｘ１２耐盐性较差；Ｘ２在０．５％～
８．０％的盐度范围内生长差异不显著（犘＞０．０５），即Ｘ２对盐度具有广泛的适应性，有一定的耐盐能力；总体上３
个菌株的盐浓度承受值Ｘ２＞Ｘ１１＞Ｘ１２（表６）。
表５ 狆犎对菌株生长的影响
犜犪犫犾犲５ 犈犳犳犲犮狋狅犳狆犎狅狀犵狉狅狑狋犺狅犳狋犺犲狊狋狉犪犻狀狊
ｐＨ
Ｘ１１
ＯＤ 犉０．０５
Ｘ１２
ＯＤ 犉０．０５
Ｘ２
ＯＤ 犉０．０５
４．０ ０．０５７０ ｅ ０．０４６３ ｄ ０．０５３３ ｃ
４．５ ０．０９８１ ｄｅ ０．０８７０ ｃｄ ０．２０１７ ａｂ
５．０ ０．５３０３ ａ ０．０６５０ ｄ ０．２５６３ ａｂ
５．５ ０．５５００ ａ ０．１１２７ ｂｃｄ ０．１７３３ ｂｃ
６．０ ０．３７１７ ｂ ０．１７７３ ｂ ０．１５９３ ｂｃ
６．５ ０．２９４３ ｃ ０．１４３３ ｂｃ ０．１４２７ ｂｃ
７．０ ０．２３９０ ｃ ０．１６１０ ｂ ０．１６４３ ｂｃ
７．５ ０．１３６３ ｄ ０．１８４３ ｂ ０．１２８０ ｂｃ
８．０ ０．１３９３ ｄ ０．２５４０ ａ ０．１４３０ ｂｃ
８．５ ０．１０２７ ｄｅ ０．０８４３ ｃｄ ０．３３０７ ａ
９．０ ０．０８３７ ｄｅ ０．０６５０ ｄ ０．１４７３ ｂｃ
表６ 盐度对菌株生长的影响
犜犪犫犾犲６ 犈犳犳犲犮狋狅犳犖犪犆犾狅狀犵狉狅狑狋犺狅犳狋犺犲狊狋狉犪犻狀狊
盐度Ｓａｌｉｎｉｔｙ
（％）
Ｘ１１
ＯＤ 犉０．０５
Ｘ１２
ＯＤ 犉０．０５
Ｘ２
ＯＤ 犉０．０５
ＣＫ
ＯＤ 犉０．０５
０．５ ０．３２０３ ｂｃｄ ０．１３２０ ｂｃ ０．１４７０ ａ ０．０７４３ ａｂｃ
１．０ ０．３１５３ ｂｃｄ ０．２００７ ａ ０．２１２３ ａ ０．０８１０ ａｂｃ
１．５ ０．１５５３ ｅ ０．１７２０ ａｂ ０．１４０７ ａ ０．０７５７ ａｂｃ
２．０ ０．４８０７ ａｂ ０．１６００ ａｂ ０．２５５０ ａ ０．０９３０ ａ
２．５ ０．１７７７ ｄｅ ０．２０５３ ａ ０．２０７０ ａ ０．０５７７ ｃ
３．０ ０．２４０７ ｃｄｅ ０．１９７３ ａ ０．２３１７ ａ ０．０７５３ ａｂｃ
３．５ ０．３６２７ ｂｃｄ ０．０７４０ ｄ ０．２３９０ ａ ０．０８３３ ａｂ
４．０ ０．４０４３ ｂｃ ０．０９３０ ｃｄ ０．２４２７ ａ ０．０９４７ ａ
５．０ ０．６１０３ ａ ０．０７６０ ｄ ０．２６３３ ａ ０．０９１３ ａ
６．０ ０．５３５１ ａ ０．０７８０ ｃｄ ０．２５７３ ａ ０．０６３０ ｂｃ
７．０ ０．３８１０ ｂｃｄ ０．０７４３ ｄ ０．１９９０ ａ ０．０７０７ ｂｃ
８．０ ０．２０１７ ｃｄｅ ０．０７０７ ｄ ０．１５６３ ａ ０．０５７７ ｃ
２．４ 菌株形态特征和１６ＳｒＲＮＡ系统发育分析
综合评价几株细菌的ＣＭＣＮａ水解圈试验、滤纸崩解试验以及中华羊茅分解试验，菌株Ｘ１２对纤维的分解
能力最强，生长速度快，易培养，具有进一步研究开发的潜力，因此，本试验通过形态学和分子生物学技术，对该细
菌进行了分析鉴定（图３和图４）。
菌株Ｘ１２为好氧、杆状，周生鞭毛，能运动，菌落乳白色，表面无光泽且较粗糙，边缘不整（图３Ａ）。在ＮＡ培
养基上，易培养，生长较快，革兰氏阳性菌（图３Ｂ）。
４６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３
图３ 菌株犡１２菌落和菌体形态
犉犻犵．３ 犕犻犮狉狅犵狉犪狆犺狅犳狊狋狉犪犻狀犡１２狑犻狋犺犮狅犾狅狀犻犲狊狅狀犪犖犃狆犾犪狋犲犪狀犱犻狋狊犿狅狉狆犺狅犾狅犵狔
Ａ：ＮＡ培养基中菌落照片ＮＡｍｅｄｉｕｍｃｏｌｏｎｙｐｈｏｔｏｓ；Ｂ：革兰氏染色显微照片Ｇｒａｍｓｔａｉｎｉｎｇｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ．
图４ 菌株犡１２的１６犛狉犚犖犃序列系统发育分析
犉犻犵．４ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犱犲狉犻狏犲犱犳狉狅犿１６犛狉犚犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狊狋狉犪犻狀犡１２
由测序结果可知，菌株Ｘ１２的１６ＳｒＲＮＡ序列全长为１４４３ｂｐ。通过与ＧｅｎＢａｎｋ中序列比对，调取与之基
因序列最为相近的菌种使用 ＭＥＧＡ５．０进行ＣｌｕｓｔａｌＸ多序列匹配比对，构建系统进化树（图４）。结果表明，菌
株Ｘ１２与芽孢杆菌系统发育关系密切。结合形态特征，初步确定菌株Ｘ１２属于芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌
（犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊）。
３ 结论与讨论
３．１ 多指标筛选体系的建立
滤纸属纤维素类物质，能够在滤纸上生长的菌种，说明可以利用滤纸作为碳源，滤纸片液体培养基中滤纸片
的溃烂程度可以证明供试菌种具有纤维素分解能力。在本研究中首先以供试菌种在ＣＭＣＮａ培养基的生长情
况和透明圈大小作为指标，筛选出具有纤维素分解能力的细菌，然后结合滤纸平板上的生长情况、滤纸片液体培
养基中的生长情况，选用多个指标进行初步筛选，避免了单一筛选方法的不足，多指标筛选体系的建立可防止试
验误差可能出现的漏选菌种。
３．２ 纤维素分解细菌的特性
细菌分解纤维素时，首先是细菌黏附在纤维素上，在多种酶的协同作用或多纤维素酶的作用下，在接触点纤
维素被溶解，细菌从纤维素的表面向内增生，逐渐分解纤维素。由于天然分解菌活性低、降解速度慢，而纤维素的
降解需要多种酶协同作用，所以充分利用自然界多种微生物的协同关系，人工筛选构建能够产生多种纤维素酶的
高效稳定菌系，引起了人们的高度重视。
３．３ 纤维素分解细菌稳定性的研究
稳定性试验过程中发现，当外界条件（如温度、ｐＨ 值、盐浓度）几乎相同时，３个菌种一直很稳定。采用
ＣＭＣＮａ培养基和刚果红染色相结合的方法进行筛选，淘汰了纤维素分解能力不稳定的菌株，保证了具有稳定遗
传特性的菌株基因资源，将菌株的稳定性作为一个指标进行筛选，目标性更强，并且具有实际的意义。
５６第２５卷第３期 草业学报２０１６年
３．４ 培养条件对菌种的影响
研究供试菌种的培养条件对菌体生长的影响，对了解菌体的生物学以及生理学特性具有重要的意义，尤其是
对一些新的微生物资源的认识和开发利用更具有不可估测的作用。本研究通过温度、ｐＨ值、盐浓度３个培养条
件对菌体生长进行了初步研究。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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犣狅狅狋犲狉犿狅狆狊犻狊犪狀犵狌狊狋犻犮狅犾犾犻狊．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，９２（１）：３２４０．
［１３］ ＤｅｌａｌｉｂｅｒａＪｒＩ，ＨａｎｄｅｌｓｍａｎＪ，ＲａｆｆａＫＦ．Ｃｏｎｔｒａｓｔｓｉｎｃｅｌｕｌｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｇｕｔｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｗｏｏｄｂｏｒｅｒ，
犛犪狆犲狉犱犪狏犲狊狋犻狋犪（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ：Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ），ａｎｄｔｈｅｂａｒｋｂｅｅｔｌｅｓ，Ｉｐｓｐｉｎｉａｎｄ犇犲狀犱狉狅犮狋狅狀狌狊犳狉狅狀狋犪犾犻狊（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ：Ｃｕｒｃｕ
ｌｉｏｎｉｄａｅ）．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，２００５，３４（３）：５４１５４７．
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ｓｔａｌｋｓｖｅｇｅｔａｂｌｅｗａｓｔｅｃｏｃｏｍｐｏｓｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，５１（６）：３５３３６０．
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ｓｏｉｌｓ．ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＥｕｒａｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００８，５：７１３７１６．
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ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：ａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｃｅｌｕｌｏｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｂｙｍｉｘｅｄｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈ
ｏｄｓ，１９９９，３７（２）：１０１１０９．
［１８］ ＳａｔｈｅｅｓｈＫｕｍａｒＧ，ＳｕｂｈｏｓｈＣｈａｎｄｒａＭ，ＳｕｍａｎｔｈＭ，犲狋犪犾．Ｃｅｌｕｌｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓｆｒｏｍｓｕｂｍｅｒｇｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｂｙｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄ犅犪犮犻犾犾狌狊ｓｐｐ．ＦＭＥ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＫｏｒｅａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，５２：１７
２１．
［１９］ ＬｅｎｚｉｏｕＶ，ＣｈｒｉｓｔａｋｏｐｏｕｌｏｓＰ，ＫｅｋｏｓＤ，犲狋犪犾．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｓｗｅｅｔｓｏｒｇｈｕｍｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅｓｔｏｅｔｈａｎｏｌｉｎａｆｅｄｂａｔｃｈｐｒｏｃｅｓｓ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，１９９４，１６（９）：９８３９８８．
６６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３