全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１６０７３ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
邵麟惠，郑兴卫，李聪．蒺藜苜蓿Ｅ３泛素连接酶Ｕｂｏｘ基因克隆及表达分析．草业学报，２０１６，２５（７）：６２７２．
ＳＨＡＯＬｉｎＨｕｉ，ＺＨＥＮＧＸｉｎｇＷｅｉ，ＬＩＣｏｎｇ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆａＵｂｏｘｇｅｎｅｏｆＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｆｒｏｍ犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪．
ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（７）：６２７２．
蒺藜苜蓿犈３泛素连接酶犝犫狅狓基因克隆及表达分析
邵麟惠，郑兴卫，李聪
（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３）
摘要：泛素化在植物生长和发育过程中起重要作用，Ｅ３泛素连接酶负责对靶蛋白特异性识别，其中 Ｕｂｏｘ结构的
Ｅ３泛素连接酶具有调控植物生长发育和免疫反应等功能，并在抗逆性方面发挥作用。目前，关于蒺藜苜蓿 Ｕｂｏｘ
家族基因的研究尚未见报道。本研究从蒺藜苜蓿中克隆得到Ｕｂｏｘ（犕狋犘犝犅４）基因，该基因ｃＤＮＡ全长２４４８ｂｐ，
编码８１５个氨基酸，包括１个 Ｕｂｏｘ结构（ＣＸ２ＨＸ７ＣＸ７ＣＸ２ＣＨＸ２Ｈ）和５个 ＡＲＭ 结构域，属于 Ｕｂｏｘ／
ＡＲＭ类型Ｅ３泛素连接酶。构建原核表达载体ｐＥＴ犕狋犘犝犅４，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）表明在大
肠杆菌中表达了 ＭｔＰＵＢ４蛋白。荧光定量ＰＣＲ分析表明犕狋犘犝犅４基因在蒺藜苜蓿花中的表达量最高，在根中表
达量最低。犕狋犘犝犅４基因受到ＮａＣｌ、聚乙二醇、脱落酸诱导，随着诱导时间增加，表达量呈现出增长趋势。这些结
果表明，犕狋犘犝犅４基因在蒺藜苜蓿生长发育和抗逆性中可能起到重要调节作用，但在低温胁迫中表达量稍微下降，
变化不明显。本研究成功构建了ｐＢＩ１２１犕狋犘犝犅４植物表达载体，为进一步转化拟南芥突变体犃狋狆狌犫４奠定了基
础。
关键词：蒺藜苜蓿；Ｅ３泛素连接酶；Ｕｂｏｘ；基因克隆；表达分析　　
犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犪犝犫狅狓犵犲狀犲狅犳犈３狌犫犻狇狌犻狋犻狀犾犻犵犪狊犲犳狉狅犿犕犲犱犻犮犪犵狅
狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＳＨＡＯＬｉｎＨｕｉ，ＺＨＥＮＧＸｉｎｇＷｅｉ，ＬＩＣｏｎｇ
犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犅犲犻犼犻狀犵１００１９３，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｕｂｉｑｕｉｔｉｎ，ａｎｄ
ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＴｈｅＵｂｏｘｆａｍｉｌｙｏｆＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａ
ｓｅｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｐｌａｎｔｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｔｏｔｈｅｂｅｓｔｏｆｏｕｒｋｎｏｗｌｅｄｇｅ，ｔｈｅｒｅ
ｈａｖｅｂｅｅｎｎｏｒｅｐｏｒｔｓｏｎＵｂｏｘｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｉｎ犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ａＵｂｏｘｇｅｎｅ（犕狋犘犝犅４），
ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆａ２４４８ｂｐｃＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｕｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆ８１５ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍ犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪．
ＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅＭｔＰＵＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｓａＵｂｏｘｄｏｍａｉｎ（ＣＸ２ＨＸ７ＣＸ７
ＣＸ２ＣＨＸ２Ｈ）ａｎｄｔｗｏＡＲＭ （Ａｒｍａｄｉｌｏ）ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｗａｓｃｌａｓｓｉｆｉｅｄａｓａＵｂｏｘ／ＡＲＭＥ３ｕｂｉｑ
ｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅ．Ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ（ｐＥＴ犕狋犘犝犅４），ａｎｄａｎＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓ
ｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅＭｔＰＵＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｓ．Ｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｏｆ犕狋犘犝犅４ｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｉｎｆｌｏｗｅｒｓａｎｄｌｏｗｅｒｉｎｒｏｏｔｓ．Ａｂｉ
ｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓｓｕｃｈａｓＮａＣｌ，ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ａｎｄａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｏｆ犕狋
犘犝犅４，ｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓａｆｔｅｒｌｏｎｇｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅｓ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｏｆ犕狋犘犝犅４ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
６２－７２
２０１６年７月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２５卷　第７期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７
收稿日期：２０１６０３０２；改回日期：２０１６０４０１
基金项目：国家自然科学基金（３１３７２３６２）项目和“十二五”国家科技支撑计划项目（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０１）资助。
作者简介：邵麟惠（１９８１），女，甘肃合水人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｓｈａｏｌｉｎｈｕｉ＠１２６．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｌｉｃｏｎｇ０５２０＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｓｌｉｇｈｔｌｙｕｎｄｅｒｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ犕狋犘犝犅４ｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｇｒｏｗｔｈ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎ犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪．ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐＢＩ１２１犕狋犘犝犅４ｖｅｃｔｏｒ
ｈａｓｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｉｎｆｕｔｕｒｅｓｔｕｄｉｅｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪；Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｅｎｚｙｍｅ；Ｕｂｏｘ；ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ
泛素化是真核生物细胞中重要的蛋白质翻译后修饰的过程，对生物体生长发育和生物体对周围环境适应性
起调控作用，其中泛素分子是由７６个高度保守的氨基酸组成的多肽［１］。该过程首先是靶蛋白被泛素分子标记，
然后被蛋白酶体识别后降解［２］。标记靶蛋白的过程由Ｅ１泛素活化酶、Ｅ２泛素结合酶和Ｅ３泛素连接酶共同介
导催化完成［１］。Ｅ１泛素活化酶依靠ＡＴＰ提供能量催化泛素分子与底物蛋白结合，同时激活泛素分子转移至Ｅ２
泛素结合酶，最后通过Ｅ３泛素连接酶与赖氨酸残基结合标记靶蛋白［３５］。Ｅ３泛素连接酶在靶蛋白特异性识别中
起关键作用，依据共价键结合方式，可分为 ＨＥＣＴ （ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔｏｔｈｅＥ６ＡＰｃａｒｂｏｘｙｌｔｅｒｍｉｎｕｓ）结构域和
ＲＩＮＧ／Ｕｂｏｘ结构域［６］。近年来研究表明，Ｅ３泛素连接酶参与了各种抗病信号反应途径的调控，其中Ｕｂｏｘ蛋
白也在抗非生物胁迫和抗病过程中发挥作用［７８］。
Ｕｂｏｘ／ＡＲＭ蛋白是植物中特有的一类蛋白，由７０多个氨基酸残基构成，功能域最初在酵母ＵＦＤ２蛋白中
发现，在多种真核生物中高度保守［９］。植物Ｕｂｏｘ蛋白的数量多于其他生物，目前在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻
犪狀犪）中已经鉴定出６４个Ｕｂｏｘ蛋白［１０］，水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）中鉴定出７７个Ｕｂｏｘ蛋白［１１］，蒺藜苜蓿（犕犲犱犻犮犪
犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）中鉴定出４１个Ｕｂｏｘ蛋白［１２］。研究表明，拟南芥狆狌犫４基因影响花粉绒毡层细胞生长发育，在花
粉发育的第８～９期开始出现差异变化，其突变体在２２℃时花粉绒毡层细胞过度生长膨胀或延迟退化、减小了花
粉囊腔空间，使花粉粒被挤压粘连、无法释放传粉而造成雄性不育，却在１６℃的低温时可恢复部分育性，说明该
基因表达方式对温度敏感［３］。因此，推测利用此类基因特性可创制出温敏型雄性不育材料。此外，近年研究人员
发现，Ｕｂｏｘ类基因也参与植物非生物胁迫应答反应，拟南芥犃狋犘犝犅２２和犃狋犘犝犅２３响应干旱胁迫［７］，犃狋
犘犝犅１８和犃狋犘犝犅１９基因受ＮａＣｌ诱导表达［１３］，辣椒（犆犪狆狊犻犮狌犿犪狀狀狌狌犿）基因犆犪犘犝犅１在拟南芥中超表达可以
增强植物的耐盐性［１４］。
蒺藜苜蓿是豆科苜蓿属草本［１５］。二倍体（２狀＝２狓＝１６），具有生育期短（８０～１００ｄ）、基因组小（４５４～５２６
Ｍｂ）、自花授粉、易于转化、再生时间较短等特点，被作为豆科模式植物进行研究，目前已完成全基因组测序［１２］。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）与蒺藜苜蓿同属于苜蓿属植物，具有相似的遗传特点，从蒺藜苜蓿中获得的信息对
研究其他豆科植物特别是紫花苜蓿具有重要参考价值。目前，有关蒺藜苜蓿 Ｕｂｏｘ基因家族的研究尚未见报
道［１２］。因此，本试验以蒺藜苜蓿为研究材料，利用植物Ｕｂｏｘ基因序列高度保守的特点，采用ＲＴＰＣＲ方法对
蒺藜苜蓿Ｕｂｏｘ基因编码区序列进行克隆研究，以期为蒺藜苜蓿Ｕｂｏｘ基因在花粉发育过程中所起的调控作用
和该类基因抗逆特性进行初步探索，为今后通过基因工程手段选育新种质奠定理论基础。
１　材料与方法
１．１　供试植物与试剂
选取蒺藜苜蓿Ａ１７基因型，蒺藜苜蓿种子由本实验室保存。
ＲＮＡ提取使用犜狉犪狀狊犣狅犾ＵｐＰｌｕｓＲＮＡＫｉｔ（ＥＲ５０１）试剂盒，ｃＤＮＡ反转录使用犜狉犪狀狊犛犮狉犻狆狋ＩＩＯｎｅＳｔｅｐ
ｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒｍｉｘ（ＡＨ３１１）试剂盒，ＰＣＲ扩增使用犜狉犪狀狊犛狋犪狉狋犉犪狊狋犘犳狌ＦｌｙＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酶，实时荧光定量使用犜狉犪狀狊犛狋犪狉狋ＴｏｐＧｒｅｅｎｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ试剂盒，购于北京全式金生物有限公
司。ＤＮＡｍａｋｅｒＤＬ５０００、限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ连接酶，购于 Ｔａｋａｒａ公司；克隆载体使用
狆犈犃犛犢ＵｎｉＳｅａｍｌｅｓｓＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙＫｉｔ（ＣＵ１０１）试剂盒、质粒抽提使用犈犪狊狔犘狌狉犲ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＰｒｅｐ
Ｋｉｔ试剂盒，原核表达载体使用狆犈犃犛犢ＢｌｕｎｔＳｉｍｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇＫｉｔ试剂盒，胶回收使用 ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ试剂
盒，分别购于北京全式金生物有限公司和北京康为世纪生物有限公司。大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α购于
天根生化科技（北京）有限公司；根癌农杆菌 （犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＡＧＬ１由本实验室保存；ｐＭＤ１８ＲＴ
３６第２５卷第７期 草业学报２０１６年
ｖｅｃｔｏｒ载体购于Ｔａｋａｒａ公司。其他试剂为国产分析纯级。
１．２　实验方法
１．２．１　材料处理　　将蒺藜苜蓿种子用酒精消毒后播种于铺有滤纸的培养皿中，在光照培养箱（温度２４℃，光
照１２ｈ／ｄ）培养至种子发芽，将发芽种子用海绵条包裹种植移至盛有ＭＳ营养液的水培盘继续培养。２０ｄ左右对
幼苗开始处理，胁迫处理时将水培溶液换成０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液、２０％聚乙二醇（ＰＥＧ）溶液和１×１０－４ ｍｏｌ／Ｌ
ＡＢＡ溶液，低温处理的水培溶液换成蒸馏水置于４℃冰箱，分别处理０，２，６，１２，２４ｈ，各时间点选取叶片组织置
于２ｍＬ离心管，液氮速冻后贮于－８０℃，提取总ＲＮＡ，用于ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ分析。组织特异性分析选取正常栽
培条件下结荚期蒺藜苜蓿根、茎、叶、花、荚果。基因克隆选取开花期１６℃放置４８ｈ的蒺藜苜蓿叶片。
１．２．２　ＲＮＡ 提取及反转录　　取蒺藜苜蓿叶片组织１００ｍｇ，按照北京全式金 ＴｒａｎｓＺｏｌＰｌｕｓＲＮＡ Ｋｉｔ
（ＥＲ５０１）试剂盒说明步骤提取总ＲＮＡ［１６］。利用紫外分光光度计测定ＲＮＡ含量，经琼脂糖凝胶电泳检验，将质
量合格的ＲＮＡ在－８０℃条件保存备用。ｃＤＮＡ第一链合成方法，反应体系为：ＲＮＡ１μＬ，５×ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＡｌ
ｉｎＯｎｅＳｕｐｅｒＭｉｘｆｏｒｑＰＣＲ４μＬ，ｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌ１μＬ，ＲＮａｓｅｆｒｅｅＷａｔｅｒ１４μＬ，反转录反应体系总体积为２０
μＬ，反应条件为：２５℃１０ｍｉｎ，５０℃３０ｍｉｎ，８５℃５ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ，－２０℃条件保存备用。
１．２．３　犕狋犘犝犅４基因全长克隆及生物信息学分析　　从 Ｇｅｎｂａｎｋ中下载 犕狋犘犝犅４基因（登录号：ＸＰ＿
０１３４６０３８８．１）序列，用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０和ｏｌｉｇｏ５．０软件设计并合成扩增引物Ｆ１／Ｒ１（表１），以反转录ｃＤＮＡ
第一链为模板，进行ＰＣＲ扩增。反应体系５０μＬ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ１μＬ，Ｐｒｉｍｅｒ各１μＬ，５×ＴｒａｎｓＳｔａｒｔＢｕｆｆｅｒ１０μＬ，
ｄＮＴＰｓ５μＬ；ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ３１μＬ；反应条件：预变性９５℃５ｍｉｎ；９５℃２０ｓ，５５℃２０ｓ，７２℃
９０ｓ，３５个循环；延伸７２℃１０ｍｉｎ。将ＰＣＲ扩增产物经凝胶电泳检测合格后胶回收。将胶回收纯化ＰＣＲ产物，
用ｐＭＤＲ１８Ｔ载体４℃条件下连接过夜；将连接产物转化至ＤＨ５α感受态细胞，冰浴３０ｍｉｎ后，４２℃热激３０ｓ，
加入ＬＢ培养基于３７℃恒温摇床振荡培养过夜后，置于含Ａｍｐ＋抗性的ＬＢ平板中进行筛选，对所获得的单菌落
培养后提取质粒、ＰＣＲ扩增、用ＢａｍＨＩ单酶切鉴定，重复２４次。对菌液进行ＰＣＲ检测，选择阳性菌液送北京英
俊公司进行ＤＮＡ测序。测定序列用ＤＮＡｓｔａｒ软件进行拼接分析，得到正确的 Ｕｂｏｘ基因核苷酸序列，并进行
氨基酸序列预测。
利用ＮＣＢＩ网站（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ和ＣｏｎｓｅｒｖｄＤｏｍａｉｎｓ程序分析核酸和氨基酸序
列；利用在Ｅｘｐａｓｙ网站查询（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）预测蛋白功能；利用Ｇｅｎｅｂａｎｋ筛选下载其他植
物的１２种Ｕｂｏｘ蛋白同源序列，在 ＭＥＧＡ５．０软件中选择邻近结合法（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ）构建进化树，分析犕狋
犘犝犅４编码的氨基酸序列物种进化关系［１６］。
１．２．４　实时荧光定量ＰＣＲ检测犕狋犘犝犅４基因表达量　　提取总ＲＮＡ，进行反转录合成ｃＤＮＡ第一链，方法同
１．２．２。使用ＢｉｏＲａｄＣＦＸ９６实时定量ＰＣＲ仪，采用两步法进行ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ扩增。基因特异性引物Ｆ３／Ｒ３
（表１），内参基因选择蒺藜苜蓿ＡＣＴＩＮ１，引物Ｆ２／Ｒ２（表１）。反应条件：第一步９４℃预变性３０ｓ；第二步９４℃
３０ｓ，５８℃１５ｓ，７２℃１０ｓ，共４０个循环。每个样品３次重复。根据实验所得Ｃｔ值，利用Ｌｉｖａｋ等［１７］报道的
ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ＝２－ΔΔＣＴ法，计算蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４基因在根、茎、叶、花、荚果中的表达量。把根的表达量设为对照，
茎、叶、花、荚果设为４个处理；不同胁迫处理中，把０ｈ表达量设为对照，２，６，１２，２４ｈ设为４个处理，利用公式进
行计算：
ΔΔ犆Ｔ＝（犆Ｔｇｅｎｅ－犆Ｔａｃｔｉｎ）胁迫处理－（犆Ｔｇｅｎｅ－犆Ｔａｃｔｉｎ）对照
式中，犆Ｔ 表示循环阈值，犆Ｔｇｅｎｅ表示目标基因达到设定阈值的循环数，犆Ｔａｃｔｉｎ表示犃犮狋犻狀基因达到设定阈值的循环
数，（犆Ｔｇｅｎｅ－犆Ｔａｃｔｉｎ）胁迫处理表示处理样品中目标基因经犃犮狋犻狀基因校正的循环次数；（犆Ｔｇｅｎｅ－犆Ｔａｃｔｉｎ）对照表示
对照样品中目标基因经犃犮狋犻狀基因校正的循环次数；ΔΔ犆Ｔ 表示处理样品中目标基因和对照样品中目标基因循
环次数的差值。然后再计算出２－ΔΔＣＴ的相对表达量，根据计算所得结果绘制柱形图。
１．２．５　蛋白原核表达与鉴定　　以蒺藜苜蓿ｃＤＮＡ为模板，利用引物Ｆ４／Ｒ４（表１），进行ＰＣＲ扩增。取ＰＣＲ
胶回收产物和表达载体狆犈犃犛犢ＢｌｕｎｔＳｉｍｐｌｅ进行连接，将连接产物全部转化犜狉犪狀狊１Ｔ１感受态细胞中，接种
ＳＯＣ（ｓｕｐｅｒｏｐｔｉｍａｌｂｒｏｔｈ）培养基培养，涂于ＬＢ培养基（含５０μｇ／ｍＬＡｍｐ
＋）３７℃过夜培养。次日挑取单菌
４６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７
落，以引物Ｆ５／Ｒ５（表１）进行菌液ＰＣＲ验证，将合格菌液加入１ｍＬ含Ａｍｐ＋抗生素的ＬＢ培养基３７℃培养过
夜，提取合格质粒送公司测序。以构建好的亚克隆载体为模板，进行ＰＣＲ扩增目的片段，引物使用Ｆ６／Ｒ６（表
１），胶回收ＰＣＲ产物，连接狆犈犃犛犢ＢｌｕｎｔＥ１载体，转化犜狉犪狀狊１Ｔ１感受态细胞，通过筛选阳性菌液、提取质粒、
送交测序，得到插入目的基因重组子ｐＥＡＳＹ犕狋犘犝犅４。
将阳性克隆菌液２０μＬ接种至２ｍＬＬＢ（含５０μｇ／ｍＬ的Ｋａｎ
＋和Ａｍｐ＋）培养基中３７℃过夜培养。取３０
μＬ过夜培养菌液，加入至３ｍＬＬＢ培养基中，３７℃震荡培养至ＯＤ６００约０．６；取部分液体作为未诱导对照组，余
下的分别加入０．１，０．２，０．５，１．０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导剂作为实验组，在３７℃震荡培养。在诱导５ｈ时取菌体
１ｍＬ，离心１００００ｒ／ｍｉｎ×３０ｓ收获沉淀，用１００μＬ１％ 磷酸盐缓冲液ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ）重悬，混
匀，１００℃１０ｍｉｎ。１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。
１．２．６　植物表达载体构建　　以克隆测序后的质粒为模板，使用犜狉犪狀狊犛狋犪狉狋犓犇ＰｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合
酶，通过ＰＣＲ扩增目的片段，以酶切鉴定引物Ｆ７／Ｒ７（表１），用内切限制酶ＢａｍＨＩ，对克隆载体ｐＭＤ１８Ｔ：：犕狋
狆狌犫４进行单酶切。酶切体系共２００μＬ，质粒１２０μＬ，限制性内切酶４μＬ，１０×ＣｕｔＳｍａｒｔＢｕｆｆｅｒ２０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补
足至２００μＬ。提取单酶切表达载体质粒，取纯化目的基因ＰＣＲ产物和ｐＢＩ１２１载体，用狆犈犃犛犢ＵｎｉＳｅａｍｌｅｓｓ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙＫｉｔ（ＣＵ１０１）连接酶连接，将连接体系置于２５℃连接２ｈ；连接体系共１０μＬ，其中载体
３．７５μＬ，目的片段１．２５μＬ，２×ＡｓｓｅｍｂｌｙＭｉｘ５μＬ。对于酶切后的表达载体质粒，取纯化目的产物，用 Ｔ４
ＤＮＡＬｉｇａｓｅ连接酶与ｐＢＩ１２１载体连接，将连接体系置于２５℃连接２ｈ；连接体系１０μＬ，其中载体３．０μＬ，目的
片段４μＬ，Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ１μＬ，５×Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ２μＬ。将质粒连接产物转化至ＤＨ５α感受态细胞，
冰浴３０ｍｉｎ后，４２℃ 热激３０ｓ，加入４００μＬＬＢ于３７℃恒温摇床振荡培养，涂于含Ｋａｎ
＋抗性的ＬＢ平板上，３７
℃过夜培养；次日挑取单克隆，进行菌落ＰＣＲ鉴定；取鉴定合格菌液，加２ｍＬ至含Ｋａｎ＋抗性的ＬＢ培养基中，３７
℃，２００ｒ／ｍｉｎ转速摇菌过夜，使用犈犪狊狔犘狌狉犲ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＰｒｅｐＫｉｔ试剂盒提取质粒；将质粒进行酶切鉴定，反应
条件为２５℃１ｈ，３７℃１ｈ。取鉴定合格菌液，送北京英骏公司测序。
表１　引物信息
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉狊犻狀犳狅狉犿犪狋犻狅狀
引物名称Ｎａｍｅｏｆｐｒｉｍｅｒ 引物序列（５′３′）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｒｉｍｅｒｓ（５′３′） 引物用途Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒ
Ｆ１ ＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＴＣ 犕狋犘犝犅 克隆
Ｒ１ ＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣ 犕狋犘犝犅ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｆ２ ＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＧ ＡＣＴＩＮ１ＲＴ－ＰＣＲ引物
Ｒ２ ＴＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＡＧＴＴＴ ＲＴ－ＰＣＲｆｏｒＡＣＴＩＮ１
Ｆ３ ＣＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣ 犕狋犘犝犅ＲＴ－ＰＣＲ
Ｒ３ ＣＧＣＣＡＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＣＴ
Ｆ４ ＡＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴ 原核表达犕狋犘犝犅 基因克隆
Ｒ４ ＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣ 犕狋犘犝犅ｃｌｏｎｉｎｇｉｎｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｆ５ ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ ｐＥＡＳＹ犕狋犘犝犅载体构建
Ｒ５ ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ ＶｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＥＡＳＹ犕狋犘犝犅
Ｆ６ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ｐＥＡＳＹ载体特异性引物
Ｒ６ ＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧ ＳｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｏｆｐＥＡＳＹｖｅｃｔｏｒ
Ｆ７ ＣＧＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧ ｐＢＩ１２１犕狋犘犝犅载体构建
Ｒ７ ＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡ ＶｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＢＩ１２１犕狋犘犝犅
２　结果与分析
２．１　目的基因克隆
取蒺藜苜蓿叶片提取总ＲＮＡ，凝胶电泳检测显示有２８Ｓ、１８Ｓ两个条带，说明ＲＮＡ较完整。用紫外分光光
５６第２５卷第７期 草业学报２０１６年
度计检测，Ａ２６０／Ａ２８０值为１．８７７；Ａ２６０／Ａ２３０值为２．０５４，
图１　蒺藜苜蓿犚犖犃提取和犕狋犘犝犅４基因犘犆犚扩增
犉犻犵．１　犚犖犃犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犪狀犱犝犫狅狓犈３狌犫犻狇狌犻狋犻狀犾犻犵犪狋犻狀犵犲狀狕狔犿犲
犵犲狀犲犪犿狆犾犻犮犪狋犻狅狀犻狀犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
　　　Ａ：ＲＮＡ提取 ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ｂ：犕狋犘犝犅４基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增
产物（１～３）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ犕狋犘犝犅４ｇｅｎｅｂｙＲＴ－ＰＣＲ（１－
３）；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
说明ＲＮＡ质量较好（图１Ａ）。将提取ＲＮＡ反转录合
成ｃＤＮＡ第一链；以ｃＤＮＡ第一链为模板，以基因特
异性引物进行 ＰＣＲ 扩增目的片段（图１Ｂ），利用
ＤＮＡＭＡＮ拼接后的全长ｃＤＮＡ为２４４８ｂｐ。将该基
因命名为犕狋犘犝犅４，ＮＣＢＩ登录号为ＸＰ＿０１３４６０３８８．１。
２．２　生物信息学分析
２．２．１　保守结构域　　运用Ｅｘｐａｓｙ网站ＳＭＡＲＴ
程序对犕狋犘犝犅４基因编码的蛋白结构域分析，结果显
示 ＭｔＰＵＢ４蛋白２１５～２７８位氨基酸具有 Ｕｂｏｘ／
ＡＥＭ家族所具备的典型 Ｕｂｏｘ结构，５１５～７６４位氨
基酸具有典型的ＡＲＭ 重复结构，该基因属于 Ｕｂｏｘ
家族的一员，其编码的 Ｕｂｏｘ保守氨基酸序列为ＦＣ
ＣＰＬＳＬＥＬＭＴＤＰＶＩＶＡＳＧＱＴＹＥＲＡＦＩＫＮＷＩＤＬＧＬＴ
ＶＣＰＫＴＨＱＴＬＡＨＴＮＬＩＰＮＹＴＶＫＡＬＩＡＮＷ。运用ＮＣ
ＢＩ保守域在线分析，该蛋白氨基酸序列Ｃ端存在Ｕｂｏｘ结构域，修饰ＲＩＮＧ锌指结构，没有Ｚｎ２＋结合配体，蛋白
Ｎ端存在ＡＲＭ重复结构，最末端是谷氨酰胺，可能参与Ｅ３泛素化。与其他物种Ｕｂｏｘ蛋白序列多重比对结果
表明，Ｕｂｏｘ／ＡＲＭ结构区域保守性较强，有１２７个氨基酸完全一致（图２）。
２．２．２　系统进化　　将克隆序列提交ＮＣＢＩ网站ＢＬＡＳＴ程序进行比对，选取同源性较高不同物种序列下载，
利用 ＭＥＧＡ５．０软件邻近法程序构建系统进化树［１２］。根据图３显示结果，克隆序列蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４与鹰嘴
豆（犆．犪狉犻犲狋犻狀狌犿）（ＸＰ＿００１２５７１３３７．１）同源性最高，为８９％；与野生大豆（犌．狊狅犼犪）（ＫＨＮ４８３９６．１）和大豆（犌．
犿犪狓）（ＸＰ＿００３５５１１７３．１）、菜豆（犘．狏狌犾犵犪狉犻狊）（ＸＰ＿００７１４６８５７．１）同源性次之，都是８１％；与其他科属植物可可
（犜．犮犪犮犪狅）（ＸＰ＿００７０４７４３６．１）、木本棉（犌．狉犪犻犿狅狀犱犻犻）（ＫＪＢ４８６４１．１）、黄瓜（犆．狊犪狋犻狏狌狊）（ＸＰ＿００４１４９７０２．１）、烟
草（犖．狋犪犫犪犮狌犿）（ＡＡＯ６１４９０．１）、甘蓝（犅．狅犾犲狉犪犮犲犪）（ＸＰ＿０１３６０５０１７．１）、拟南芥（犃．狋犺犪犾犻犪狀犪）（ＮＰ＿１７９８９５．６）
和水稻（犗．狊犪狋犻狏犪）（ＡＡＴ９４１６１．１）等植物同源性较低，分别是７１％，６９％，６５％，５８％，５６％，５６％和５４％。
２．３　蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４基因组织特异性表达
蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４基因在不同组织中的相对表达量见图４。结果表明，犕狋犘犝犅４在花中表达量最多，其次
是叶，根中表达量最少。以蒺藜苜蓿根中犕狋犘犝犅４基因表达量为对照，花中表达量是根中表达量的２６．６８倍，叶
中表达量是根中１５．４５倍，荚果中表达量是根中的５．６０倍，茎中表达量是根中的４．８２倍。
２．４　蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４基因在非生物胁迫下的表达量
蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４基因分别受到ＮａＣｌ、ＰＥＧ、ＡＢＡ和低温诱导０，２，６，１２，２４ｈ的相对表达量见图５。结果
显示，犕狋犘犝犅４基因在ＮａＣｌ胁迫诱导下，６ｈ时迅速上升，是２ｈ时表达量的３倍，１２ｈ时达到峰值，２４ｈ下降
（图５Ａ）。在ＰＥＧ胁迫诱导下２ｈ以内变化较小，６ｈ表达量增到２ｈ的４倍，达到峰值，与ＮａＣｌ胁迫下变化近
似，但是１２ｈ时开始下降，２４ｈ时表达量低于０ｈ时表达量（图５Ｂ）。在低温处理后，２ｈ时表达量稍微有所下降，
６ｈ时表达量与２ｈ表达量接近，１２ｈ时持续下降，２４ｈ时恢复至６ｈ水平（图５Ｃ）。在ＡＢＡ诱导１２ｈ后，表达量
稍有降低，随后迅速上升，２４ｈ时表达量接近０ｈ的５倍（图５Ｄ）。除了低温胁迫犕狋犘犝犅４基因表达量变化稍有
降低，表达量变化不明显外，其余３种处理方式表达量都出现数倍上升，这说明犕狋犘犝犅４基因对盐、干旱和ＡＢＡ
胁迫响应，可能参与这些逆境的信号调控。
２．５　犕狋犘犝犅４基因蛋白原核表达
将目的片段连接ｐＥＡＳＹＢｌｕｎｔＳｉｍｐｌｅ载体，转化至大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经测序验证序列正确，表明蛋白
表达载体构建成功。将含有阳性质粒的大肠杆菌表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳＣｈｅｍｉｃａｌｙＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌ株系，用
不同浓度的ＩＰＴＧ诱导表达，上样浓度为０．１，０．２，０．５和１．０ｍｍｏｌ／Ｌ。结果显示，含有犕狋犘犝犅４片段的表达载体
６６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７
图２　犕狋犘犝犅４与其他植物犝犫狅狓蛋白氨基酸保守区序列多重对比分析
犉犻犵．２　犕狌犾狋犻狆犾犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犕狋犘犝犅４犮狅狀狊犲狉狏犲犱犱狅犿犪犻狀狑犻狋犺犻狋狊犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊犻狀狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊　
７６第２５卷第７期 草业学报２０１６年
续图２　犕狋犘犝犅４与其他植物犝犫狅狓蛋白氨基酸保守区序列多重对比分析
犆狅狀狋犻狀狌犲犱犉犻犵．２　犕狌犾狋犻狆犾犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犕狋犘犝犅４犮狅狀狊犲狉狏犲犱犱狅犿犪犻狀狑犻狋犺犻狋狊犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊犻狀狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊
　犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿：鹰嘴豆；犌犾狔犮犻狀犲狊狅犼犪：野大豆；犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓：大豆；犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊：菜豆；犜犺犲狅犫狉狅犿犪犮犪犮犪狅：可可；犌狅狊狊狔狆犻狌犿犪狉犫狅狉犲狌犿：木本
棉；犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊：黄瓜；犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿：烟草；犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪：甘蓝；犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪：拟南芥；犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪：水稻。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ表示序
列一致性，黑色表示１００％相同，粉色表示７５％相同，蓝色表示５０％相同。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｓａｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄａｒｅｌｉｓｔｅｄｂｅｌｏｗ；Ｂｌａｃｋｉｎｄｉｃａｔｅｓ
１００％ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｐｉｎｋｉｎｄｉｃａｔｅｓ７５％ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｂｌｕｅｉｎｄｉｃａｔｅｓ５０％ｉｄｅｎｔｉｔｙ．
图３　蒺藜苜蓿犝犫狅狓犈３泛素蛋白 犕狋犘犝犅４进化树分析
犉犻犵．３　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犝犫狅狓犈３狌犫犻狇狌犻狋犻狀犾犻犵犪狋犻狀犵犲狀狕狔犿犲犕狋犘犝犅４狆狉狅狋犲犻狀狊犻狀犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
　
菌体在诱导后出现特异性条带，各个浓度对蛋白表达
图４　犕狋犘犝犅４基因在蒺藜苜蓿不同组织中的相对表达量
犉犻犵．４　犜犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犕狋犘犝犅４犵犲狀犲犻狀
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋犻狊狊狌犲狊狅犳犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
　
影响不明显。该蛋白在９０ｋＤａ条带处，与预期结果
８８．３６ｋＤａ相符（图６）。说明该蛋白在大肠杆菌中成
功诱导，可用于进一步蛋白表达研究。
２．６　植物表达载体构建
将植物表达载体ｐＢＩ１２１和克隆载体分别酶切，回
收相应片段纯化连接、转化、挑取单菌落、提取质粒，构
建犕狋犘犝犅４基因植物表达载体。经过ＢａｍＨＩ酶切鉴
定，得到与预期大小一致的目的片段（图７）。鉴定为
阳性的质粒送公司测序后拼接，与基因序列一致，说明
成功构建植物表达ｐＢＩ１２１犕狋犘犝犅４。
８６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７
图５　犕狋犘犝犅４基因在犖犪犆犾、犘犈犌、４℃低温和犃犅犃处理后的相对表达量
犉犻犵．５　犜犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犕狋犘犝犅４犵犲狀犲狋狉犲犪狋犲犱犫狔犖犪犆犾，犘犈犌，犃犅犃犪狀犱４℃
　Ａ：ＮａＣｌ处理 ＮａＣｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｂ：ＰＥＧ处理ＰＥＧｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｃ：４℃ 低温处理４℃ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｄ：脱落酸处理 ＡＢＡ（ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
　
图６　犕狋犘犝犅４融合蛋白犛犇犛－犘犃犌犈电泳考马斯亮蓝染色
犉犻犵．６　犆狅狅犿犪狊狊犻犲狊狋犪犻狀犲犱犛犇犛－犘犃犌犈犵犲犾犻犾狌狊狋狉犪狋犻狀犵犕狋犘犝犅４
犎犻狊狋犪犵犳狌狊犻狅狀狆狉狅狋犲犻狀犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犈．犮狅犾犻　
图７　植物表达载体犘犆犚和酶切验证
犉犻犵．７　犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉犫狔
犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀　
　１～５：０，０．１，０．２，０．５和１．０ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导的菌体蛋白。１－５
ｉｎｄｉｃａｔｅ０，０．１，０．２，０．５ａｎｄ１．０ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏ
ｔｅｉｎ；Ｍ：蛋白标记Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ．
　１～２：表达载体ｐＢＩ１２１质粒提取结果。１－２：Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｖｅｃｔｏｒ
ｐＢＩ１２１ｐｌａｓｍｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；３～４：质粒单酶切后结果。３－４：Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆ
ｓｉｎｇｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；Ｍ：ＤＬ５０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
３　讨论
ＵｂｏｘＥ３泛素连接酶基因在植物生长发育和抗逆过程中起着重要作用。目前Ｅ３泛素连接酶 Ｕｂｏｘ的研
究主要集中在拟南芥、水稻、烟草等模式植物中。本研究得到的蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４基因的氨基酸序列中（图３），
在Ｃ端存在ＲｉｎｇｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＵｂｏｘ结构域，有Ｚｎ指结构４０个残基结合２个Ｚｎ原子，由半胱氨酸和组氨酸组
成，可能参与蛋白质与蛋白质之间的相互反应，Ｈａｔａｋｅｙａｍａ等［８］认为这类蛋白与序列复制、信号传导和发育有
关；在Ｎ端有连续５个ＡＲＭ重复结构，末端是谷氨酰胺，推测参与Ｅ３泛素化。有学者认为ＡＲＭ结构域蛋白质
在植物生长发育和激素应答等方面起重要作用［９，１８］。在某些植物 Ｕｂｏｘ蛋白中，如拟南芥中 ＡＲＣ１（ＡｒｍＲｅ
ｐｅａｔＣｏｎｔａｉｎｉｎｇ１），其Ｃ端含有一个６～７个ＡＲＭ重复结构功能域，中间含有一个Ｕｂｏｘ功能域，是ＳＲＫ激酶
９６第２５卷第７期 草业学报２０１６年
下游信号的传递因子，能在柱头乳突细胞中特异性表达，能促进花粉水合、萌发和花粉管生长的雌性亲和因
子［１９］。在水稻中发现的ＳＰＬ１１［２０２２］、烟草中的ＡＣＥＲ２７６［２３］、拟南芥中的犃狋犘犝犅１７等Ｕｂｏｘ基因都与植物抗病
性有关［２４］；马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）中发现的Ｕｂｏｘ基因ＰＨＯＲ１（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ１）参与ＧＡ信号
转导，是ＧＡ信号转导途径中的正调控因子［２５］；烟草中的犖狋犘犝犅４参与了植物发育和细胞分裂素信号转导［２６］；
拟南芥犃狋犘犝犅４的Ｕｂｏｘ／ＡＲＭ功能域缺失能使绒毡层结构肥大最终导致植物雄性不育［３］；蒺藜苜蓿中未见报
道。通过构建系统进化树结果表明，它们与同科属植物同源性很高，和其他科属的植物同源性较低，这与其他学
者在其他物种间同源性分析结论基本一致［１６，２７］，说明同源关系较近的植物中基因保守性更强。依据属内同源性
较高的理论，说明Ｕｂｏｘ／ＡＲＭ蛋白家族基因进化上也比较保守，其氨基酸序列相似度可在一定程度上说明了
不同物种亲缘关系远近，本研究中的蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４基因与拟南芥犃狋犘犝犅４基因、烟草犖狋犘犝犅４的同源性较
低，但是在同一类型进化枝上，这可能与拟南芥与烟草基因组较小有关系。
前人研究表明ＵｂｏｘＥ３连接酶可调控植物多个生理代谢途径，Ｓａｍｕｅｌ等［２８］研究发现，拟南芥中的Ｕｂｏｘ／
ＡＲＭ蛋白家族与拟南芥ＳＤ１受体蛋白激酶亚家族相互结合，通过酵母双杂交实验表明，两个受体结合可使 Ｕ
ｂｏｘ／ＡＲＭ蛋白的ＡＲＭ功能域磷酸化，从而参与调控植物生理过程。Ｋｉｍ等［２６］研究认为，烟草的ＮｔＰＵＢ４参
与ＣＨＲＫ１介导的植物发育及细胞分裂素信号转导过程。据报道，ＣＨＲＫ１是烟草内的一种新型类受体激酶，参
与调控发育信号转导及内源细胞分裂素平衡，且 ＮｔＰＵＢ４在烟草的花器官大量表达，在苗、根、茎、叶中少量表
达。本研究中，蒺藜苜蓿犕狋狆狌犫４基因也在花中大量表达，与ＮｔＰＵＢ４、ＡＲＣ１有相似的结构域，因此推测它们具
有相似的功能。而ＣＨＲＫ１与ＳＲＫ类受体激酶聚类在一起，推测ＮｔＰＵＢ４与ＡＲＣ１功能相似［２６］。Ｓａｍｕｅｌ等［２８］
在拟南芥中研究发现，一些Ｕｂｏｘ／ＡＲＭ基因受到ＮａＣｌ胁迫诱导表达，基因表达量会上调。以上结果表明 Ｕ
ｂｏｘ基因在抗性方面也可能发挥作用。本实验增加了干旱、低温和ＡＢＡ诱导方面的研究，通过模拟各种胁迫条
件，犕狋犘犝犅４基因在受到ＮａＣｌ、ＰＥＧ和ＡＢＡ胁迫诱导后，基因表达量都数倍提高，此基因在ＮａＣｌ、ＰＥＧ和ＡＢＡ
胁迫反应中也可能参与调控反应，但在低温胁迫中，表达量稍微下降，变化不明显。
雄性不育与一些基因突变有关，产生这些基因突变的主要原因包括光周期、光强度、湿度和温度等环境因素
的改变。目前，利用这种现象人工筛选突变体，通过两系配套法培育不育系已在杂交作物的生产上成功应用［２９］。
在拟南芥中，突变体犃狋狆狌犫４在１６℃中可恢复部分育性，主要是花粉囊中的花粉粒可成功授粉。目前尚无蒺藜
苜蓿ＵｂｏｘＥ３泛素连接酶蛋白的相关研究［３０］，我们通过全基因组Ｕｂｏｘ结构域分析得出，蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅３２
可能与ＡＲＫ２共同调控植株侧根发育，犕狋犘犝犅２６可能与干旱胁迫相关［１２］。通过对克隆蒺藜苜蓿犕狋犘犝犅４序列
分析，得出它与拟南芥ＡｔＰＵＢ４蛋白间有共同保守域结构，利用生物信息学相关软件分析基因序列特征、功能蛋
白结构、基因进化关系，发现克隆基因属于植物 Ｕｂｏｘ家族成员，具备１个 Ｕｂｏｘ结构域和５个 ＡＲＭ 重复结
构。本研究为进一步了解Ｕｂｏｘ基因如何调控蒺藜苜蓿的生长发育，以及如何参与逆境胁迫信号转导，揭示植
物生长发育过程中的一些机制提供理论基础。
４　结论
本实验通过ＲＴ－ＰＣＲ技术，克隆了蒺藜苜蓿 ＵｂｏｘＥ３泛素连接酶基因，对其核苷酸、氨基酸序列对比分
析，检测相对表达量变化规律，进行原核表达并提取了 ＭｔＰＵＢ４蛋白，同时成功构建植物表达载体。为后期筛选
蒺藜苜蓿雄性不育基因、将其转化至拟南芥犃狋狆狌犫４雄性不育突变体材料进行遗传互补提供了候选基因。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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ｌｉｇａｓｅｓｓｕｇｇｅｓｔａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００８，１４７（４）：２０８４２０９５．
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１７第２５卷第７期 草业学报２０１６年
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２７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７