全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５３４８ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
王晓成，刘军花，朱伟云，毛胜勇．瘤胃源酵母的分离筛选及对不同底物发酵能力影响．草业学报，２０１６，２５（５）：１４１１４８．
ＷＡＮＧＸｉａｏＣｈｅｎｇ，ＬＩＵＪｕｎＨｕａ，ＺＨＵ ＷｅｉＹｕｎ，ＭＡＯＳｈｅｎｇＹｏｎｇ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｕｍｅｎｙｅａｓｔａｎｄａｎｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｅｆｆｅｃｔ
ｏｎｒｕｍｉｎａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（５）：１４１１４８．
瘤胃源酵母的分离筛选及对不同底物发酵能力影响
王晓成，刘军花，朱伟云，毛胜勇
（南京农业大学动物科技学院，江苏 南京２１００９５）
摘要：本实验旨在分离筛选瘤胃源酵母，研究其对不同饲料底物的发酵特性。实验以山羊及奶牛瘤胃液为菌源，利
用酵母选择性培养基，通过分离筛选、生长曲线测定和２６ＳｒＤＮＡ鉴定，获得１株生长速度较快的 犕犲狔犲狉狅狕狔犿犪属
酵母菌株。在此基础上，采用体外发酵技术，分别以羊草与精料混合物、马铃薯淀粉和玉米淀粉为底物，以奶牛瘤
胃液为接种物，研究该酵母菌株对瘤胃微生物体外发酵参数的影响。结果表明，在以羊草和精料混合物为底物时，
添加瘤胃源酵母显著降低了发酵液ｐＨ和乳酸浓度（犘＜０．００１），显著提高了丙酸浓度和干物质消失率（犘＜０．０５）；
以玉米淀粉为底物时，添加该酵母菌显著降低了发酵液ｐＨ和乳酸浓度（犘＜０．００１）；以马铃薯淀粉为底物时，显著
降低了ｐＨ（犘＜０．０５），提高了丙酸浓度（犘＜０．０５）；但在上述３种底物条件下，添加酵母菌对发酵液中总产气量、
氨态氮、乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸浓度无显著影响（犘＞０．０５）。采用ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ测定结果表明，添加
该酵母菌可显著提高以羊草和马铃薯淀粉为底物时发酵液中总菌１６ＳｒＤＮＡ的挎贝数（犘＜０．０５）。结果说明，本
研究分离获取的瘤胃源酵母可提高瘤胃微生物对羊草精料混合物的降解能力，降低羊草精料混合物组和玉米淀粉
组发酵液中乳酸浓度，提示该菌株可能具有提高日粮消化利用效率、促进丙酸生成和瘤胃细菌生长的作用。
关键词：酵母；瘤胃；分离；体外发酵　　
犐狊狅犾犪狋犻狅狀犪狀犱犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狕犪狋犻狅狀狅犳狉狌犿犲狀狔犲犪狊狋犪狀犱犪狀犲狏犪犾狌犪狋犻狅狀狅犳犻狋狊犲犳犳犲犮狋狅狀狉狌犿犻
狀犪犾犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋狔狆犲狊狅犳狊狌犫狊狋狉犪狋犲
ＷＡＮＧＸｉａｏＣｈｅｎｇ，ＬＩＵＪｕｎＨｕａ，ＺＨＵ ＷｅｉＹｕｎ，ＭＡＯＳｈｅｎｇＹｏｎｇ
犜犺犲犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犖犪狀犼犻狀犵犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犖犪狀犼犻狀犵２１００９５，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｉｓｏｌａｔｅｒｕｍｅｎｙｅａｓｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｅｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｒｏｌｅｉｎｃｈａｎｇｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｂｙｕｓｉｎｇ犻狀狏犻狋狉狅ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ａｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｗｉｔｈａｆａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏｔｈｅ犕犲狔犲狉狅狕狔犿犪ｇｅｎｕｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ２６ＳｒＤＮＡｕｓｉｎｇａｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍｏｆｙｅａｓｔｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆｇｏａｔａｎｄｄａｉｒｙｃｏｗｒｕｍｉｎａｌｆｌｕｉｄ．
Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｉｓｉｓｏｌａｔｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｎｒｕｍｉｎａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｒｅｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ：Ｃｈｉｎｅｓｅｗｉｌｄｒｙｅ
ｐｌｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｍｉｘｔｕｒｅ，ｐｏｔａｔｏｓｔａｒｃｈａｎｄｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ．Ｒｕｍｉｎａｌｆｌｕｉｄｆｒｏｍｄａｉｒｙｃａｔｔｌｅｗａｓｕｓｅｄａｓａｎｉｎｏｃｕ
ｌａｎｔ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｗｉｔｈｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅｗｉｌｄｒｙｅｐｌｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｍｉｘｔｕｒｅａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｙｅａｓｔａｄｄｉｔｉｏｎ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄｒｕｍｉｎａｌｐＨａｎｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄ（犘＜０．００１），ｗｈｉｌｅｉｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ
ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄａｎｄｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆｄｒｙｍａｔｔｅｒ（犘＜０．０５）．ＴｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｙｅａｓｔｄｅｃｒｅａｓｅｄｒｕｍｉｎａｌｐＨａｎｄ
ｌａｃｔｉｃｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（犘＜０．００１）ｉｎｔｈｅｃｏｒｎｓｔａｒｃｈｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｙｅａｓｔｃｕｌｔｕｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ
第２５卷　第５期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．５
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１４１－１４８
２０１６年５月
收稿日期：２０１５０７１５；改回日期：２０１５１０１２
基金项目：奶业“９７３”项目子课题（２０１１ＣＢ１００８０１）资助。
作者简介：王晓成（１９９１），男，江苏南京人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：２０１３１０５０５５＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｍａｏｓｈｅｎｇｙｏｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
ｒｕｍｉｎａｌｐＨ （犘＜０．０５）ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ（犘＜０．０５）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｏｔａｌｇａｓｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆａｍｍｏｎｉａＮ，ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ，ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ，ｖａｌｅｒｉｃａｃｉｄａｎｄｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ
ａｃｉｄｗｅｒｅｎｏｔａｆｆｅｃｔｅｄ（犘＞０．０５）ｂｙｙｅａｓｔａｄｄｉｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｈｒｅｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｇｒｏｕｐｓ．ＴｈｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｄａｔａ
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ｐｏｔａｔｏｓｔａｒｃｈｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｅｒｕｍｅｎｙｅａｓｔｉｓｏｌａｔｅｓｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒｕｍｅｎ’ｓｄｉｅｔａｒｙｄｅｇｒａ
ｄａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｌａｃｔｉｃａｃｉｄｌｅｖｅｌｓｆｏｒｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅｗｉｌｄｒｙｅｐｌｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅａｎｄｃｏｒｎｓｔａｒｃｈｓｕｂ
ｓｔｒａｔｅｓ．Ｔｈｉｓｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｅｙｅａｓｔｉｓｏｌａｔｅｓｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｗａｙｓｔｈａｔｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｐｒｏ
ｐｉｏｎａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｒｕｍｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｙｅａｓｔ；ｒｕｍｅｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ犻狀狏犻狋狉狅
在当前反刍动物生产中，为提高奶牛的产奶量，养殖者常在奶牛日粮中使用高比例精料，但这种饲喂方式常
导致奶牛瘤胃中乳酸浓度增加，瘤胃微生物功能紊乱。研究表明，相对于瘤胃中挥发性脂肪酸而言，乳酸的电离
度更大，因此，其更容易引发瘤胃ｐＨ降低［１］。为防止瘤胃中乳酸累积和瘤胃微生物功能失衡，人们常采用添加
酵母培养物或乳酸利用菌等方式来降低瘤胃乳酸浓度，使瘤胃微生物功能恢复正常。一些研究表明，添加活性酵
母菌可提高干物质和中性洗涤纤维的降解率［２３］，提高奶产量［２］；Ｃｈａｕｃｈｅｙｒａｓ等［４］发现，酵母培养物可促进瘤胃
乙酸菌对氢的利用；促进瘤胃总细菌和纤维降解菌数量的增长，加强反刍兽新月单胞菌对乳酸的利用，显著提高
丙酸含量［５７］。但也有一些报道显示，添加酵母对奶牛瘤胃发酵无显著影响。如那日苏等［８］报道，添加酵母培养
物对育肥羊体重、瘤胃ｐＨ和挥发性脂肪酸（ｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙａｃｉｄ，ＶＦＡ）含量没有显著影响；Ｎｅｗｂｏｌｄ等［５］发现，体
外发酵中添加酵母对ｐＨ、丙酸、乙酸和总挥发性脂肪酸浓度均无显著影响。由此，这些研究提示，酵母菌对奶牛
瘤胃发酵的影响结果并不一致。分析其原因，我们发现当前养殖生产中所用酵母培养物或活酵母生产菌株主要
分离自外界环境。实际上，源自消化道外的酵母菌的最适生存环境可能与瘤胃环境并不一致，这种生存环境的不
一致可能直接影响其在动物消化道内的生长速度与作用效果，这也许是当前生产中所用活酵母或酵母培养物在
奶牛等反刍动物生产中的应用效果不稳定的主要原因之一。相对而言，利用源于动物消化道内的微生物，可能避
免以上应用效果不稳定的问题。由此，本论文拟分离筛选瘤胃源性酵母，并通过体外发酵技术，研究其对瘤胃微
生物发酵参数的影响。
１　材料与方法
１．１　动物饲养及瘤胃液的获取
本实验于２０１３年１２月至２０１４年６月进行。分离酵母的瘤胃液采自于３头装有永久性瘤胃瘘管的干奶期
奶牛（体重为５９０±４８ｋｇ，干物质采食量为１２ｋｇ／ｄ，日粮精粗比为２∶８）及４头装有永久性瘤胃瘘管的波杂山羊
（平均体重２７±３ｋｇ，干物质采食量为８５０ｇ，全粗料）的瘤胃液为菌源。体外研究瘤胃源酵母对瘤胃发酵参数的
影响的实验中所用接种瘤胃液采自上述奶牛。奶牛与山羊皆单栏饲喂，自由饮水。
１．２　培养基成分及其配制
酵母浸出物３ｇ（购自奥博星公司），麦芽提取物３ｇ（购自奥博星公司），蛋白胨５ｇ（购自奥博星公司），葡萄糖
１０ｇ（购自奥博星公司），琼脂２０ｇ（购自奥博星公司），链霉素０．１ｇ（购自Ｓｉｇｍａ公司），加蒸馏水至１Ｌ，１１５℃ 高
温灭菌１５ｍｉｎ，待培养基温度降至６０℃后，制备平板备用［９］。酵母浸出物麦芽糖液体培养基组成：酵母浸出物３
ｇ，麦芽浸出物３ｇ，蛋白胨５ｇ，葡萄糖１０ｇ，链霉素０．１ｇ，加蒸馏水至１Ｌ，１１５℃高温灭菌１５ｍｉｎ。乳酸液体培
养基：酵母抽取物３ｇ，麦芽抽取物３ｇ，蛋白胨５ｇ，乳酸７．５ｇ（购自国药集团），链霉素０．１ｇ，加蒸馏水至１Ｌ，
１１５℃高温灭菌１５ｍｉｎ。
１．３　瘤胃源酵母菌的分离纯化
实验当日，于饲喂前分别从奶牛或山羊瘤胃腹囊下部抽取瘤胃液，将瘤胃液经３层纱布过滤。取１ｍＬ过滤
所得的瘤胃液进行梯度稀释，将稀释至１０，１００和１０００倍的瘤胃液进行平板涂布，将培养基放入３９℃培养箱中
２４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．５
培养，７２ｈ后取出培养基，挑取形态、颜色等不同单菌落进行反复纯化，至所获菌株的形态完全一致后保存备
用［９］。
１．４　酵母菌的筛选
将分离出的酵母菌株置于含一定浓度乳酸的培养基中，３９℃培养２４ｈ后，通过测定培养基中乳酸含量，计算
酵母对乳酸的利用能力，将乳酸利用率较高的菌株放入液体培养基中３９℃培养２４ｈ，在波长为６００ｎｍ下测定其
生长曲线，最终筛选出生长较快的疑似酵母菌株［９］。
１．５　酵母菌的鉴定
将分离到的疑似菌经体外培养２４ｈ后，收集菌体用于ＤＮＡ提取，ＤＮＡ提取参照 Ｍｕｒｒａｙ等［１０］的方法。所
用引物序列如下：上游引物 ＮＬ１（５′ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ３′），下游引物 ＮＬ４（５′ＧＧＴＣ
ＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧ３′）。ＰＣＲ扩增体系为：９４℃预变性４ｍｉｎ，９４℃变性４５ｓ，５５℃退火４５ｓ，７２℃延伸１
ｍｉｎ，３０个循环，７２℃修复延伸１０ｍｉｎ。通过１％琼脂糖电泳，１５０Ｖ、１００ｍＡ下２０ｍｉｎ电泳观察，ＰＣＲ产物电泳
条带切割所需 ＤＮＡ目的条带，ＰＣＲ产物送至上海生工有限公司测序。测序结果通过ＢＬＡＳＴ数据库进行比对，
再用 ＭＡＧＡ（６．０）软件构建系统进化树。
１．６　体外法测定瘤胃源菌株对瘤胃发酵参数的影响
１．６．１　厌氧培养基制备　　培养基成分：２９２ｍｇ／ＬＫ２ＨＰＯ４，２４０ｍｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４，４８０ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４，
４８０ｍｇ／ＬＮａＣｌ，１００ｍｇ／ＬＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，６４ｍｇ／ＬＣａＣｌ２·Ｈ２Ｏ，４０００ｍｇ／ＬＮａ２ＣＯ３，６００ｍｇ／Ｌ半胱氨酸
盐酸盐。将上述组分溶于１Ｌ去离子水中，混合后通入饱和二氧化碳至完全厌氧［１１１２］。
１．６．２　实验分组与瘤胃液接种　　实验分别以羊草精料混合物、玉米淀粉和马铃薯淀粉为底物，在各底物条件
下，分别按酵母添加量为０，０．６２５×１０７，１．２５０×１０７和２．５００×１０７ＣＦＵ／ｍＬ设为４组，每组设４个重复。试验另
设１６个添加羊草精料混合物的发酵瓶，用于底物干物质消化率的测定。
试验开始前，准确称取２６６ｍｇ羊草精料混合物（羊草∶精料＝６∶４，精料由玉米与豆粕组成，比例为７∶３，
羊草、玉米与豆粕均经粉碎、过筛和烘干处理）、玉米淀粉和马铃薯淀粉于１００ｍＬ发酵瓶中。于晨饲前经瘤胃瘘
管分别从奶牛腹囊下部抽取瘤胃内容物，经３层纱布过滤。将所得瘤胃液与厌氧培养基按１∶２混合，取混合厌
氧培养基４０ｍＬ厌氧条件下分装至上述已装入底物的并提前预热至３９℃的发酵瓶中后，各发酵瓶经橡胶塞密
封、铝盖封口和平衡气压后，迅速放入３９℃培养箱静置培养２４ｈ。培养期间，分别于接种后２，４，６，８，１２，２４ｈ采
用气压转换仪测定各发酵瓶中的总产气量。发酵结束后立即测定各发酵瓶中发酵液的ｐＨ值，同时冰浴终止发
酵，随后取样备测氨态氮和乳酸等指标。另将１６个添加羊草精料混合物的发酵瓶转移至离心管中，４℃下１００００
ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，１０５℃烘干测定干物质消失率。
１．６．３　发酵液ＤＮＡ提取　　取发酵结束后发酵液１ｍＬ，采用珠磨法，参照 Ｍｕｒｒａｙ等［１０］的方法提取瘤胃微生
物总ＤＮＡ。
１．６．４　ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ法定量总菌数量　　参照Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖ等［１３］的方法，利用ｉＣｙｃｌｅｒＩＱｒｅａｌｔｉｍｅ检测系
统及配套软件（ｉＣｙｃｌｅｒｏｐｔｉｃａｌｓｙｓｔｅｍｉｎｔｅｒｆａｃｅｓｏｆｔｗａｒｅｖｅｒｓｉｏｎ２．３）进行ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ分析。ＰＣＲ反应体系
为２０μＬ：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ，美国）１０．４μＬ，上、下游引物（２５μｍｏｌ／Ｌ）各０．４μＬ、ＤＮＡ样品２μＬ、
超纯水６．８μＬ。引物为１３６９Ｆ（５′ＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＹＣＧＧ３′）和１４９２Ｒ（５′ＧＧＷＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡ
ＣＴＴ３′），反应条件参照Ｓｕ等［１４］的方法。
１．７　指标测定
ｐＨ的测定采用手持型ｐＨ计；产气量测定参照Ｔｈｅｏｄｏｒｏｕ等［１５］的方法；氨态氮测定参照冯宗慈和高民［１６］
的方法；挥发性脂肪酸测定参照秦为琳［１７］的方法。
乳酸的测定采用试剂盒法（购自南京建成生物工程研究所），按照试剂盒说明书，分别向空白管、标准管、测定
管中相对应地加入０．０２ｍＬ蒸馏水、３ｍｍｏｌ／Ｌ标准液和待测样品，然后均加入１ｍＬ酶工作液和０．２ｍＬ显色
剂，混匀后置于３７℃水浴锅中准确反应１０ｍｉｎ，再分别加入２ｍＬ终止液，混匀，用空白管调零，在５３０ｎｍ波长、
１ｃｍ光径下分别测各管吸光度值。乳酸的计算公式如下：
３４１第２５卷第５期 草业学报２０１６年
瘤胃液中乳酸含量（ｍｍｏｌ／Ｌ）＝（测定ＯＤ值－空白 ＯＤ值）／（标准 ＯＤ值－空白 ＯＤ值）×标准品浓度（３
ｍｍｏｌ／Ｌ）×样品测试前稀释倍数
１．８　数据统计
数据经Ｅｘｃｅｌ（２０１０）初步处理后，采用ＳＰＳＳ（２０．０）统计软件中的ＯｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ分析，显著性水平置于
０．０５。
２　结果与分析
２．１　瘤胃源酵母的富集与分离纯化
采用涂板划线分离法，大量挑取形态与颜色不同的菌落，经连续分离纯化，最终从奶牛瘤胃液中分离出３０株
疑似酵母菌株，从山羊瘤胃液中分离出６４株疑似酵母菌株，共计９４株。如图１所示，对分离菌株进行乳酸利用
率试验，结果共获得１４株乳酸利用率相对较高的疑似酵母菌株。对上述１４株菌进行生长速率测定，结果发现其
中６株菌生长速率较低，另外９株生长速率相对较快 （图２）。结合生长速率与乳酸利用率数据结果，最终筛选到
１株乳酸利用率较高及生长速度较快的疑似酵母菌株，编号为Ｙ０９。
图１　分离酵母对乳酸的利用率
犉犻犵．１　犜犺犲狌狋犻犾犻狕犪狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犾犪犮狋犪狋犲狅犳犻狊狅犾犪狋犲狊
　
图２　分离酵母的生长曲线
犉犻犵．２　犌狉狅狑狋犺犮狌狉狏犲狅犳犻狊狅犾犪狋犲狊
　
２．２　菌株鉴定
图３　犢０９号酵母菌形态（×４００）
犉犻犵．３　犕狅狉狆犺狅犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狕犪狋犻狅狀狅犳犻狊狅犾犪狋犲狊犢０９
　
２．２．１　菌落及菌体形态的观察　　将Ｙ０９号菌在麦
芽糖琼脂培养基上培养７２ｈ后，菌落呈乳白色，棋子
状突起，边缘整齐，表面无光泽，菌落松软湿润，发酵产
物呈酒香味；在麦芽汁液体培养基中静止培养时，有菌
环，沉淀，液体澄清。４００倍光学显微镜下显示该菌为
椭圆状，细胞多为单个或成对出现，出芽生殖（图３）。
２．２．２　Ｙ０９号酵母菌的系统发育学分析　　采用
ＢＬＡＳＴ软件，将该菌扩增序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的序列
进行同源性比较（图４）。结果发现，Ｙ０９号菌与犕犲狔
犲狉狅狕狔犿犪属的相似性达１００％，故将该菌归属于 犕犲狔犲狉狅狕狔犿犪属酵母菌。该菌序列已提交ＧｅｎＢａｎｋ，序列号为
ＫＰ７９７８８３．１。
２．３　体外法评定添加Ｙ０９号瘤胃源酵母对３种不同底物发酵参数的影响
２．３．１　添加Ｙ０９号酵母菌对羊草精料混合物为底物时瘤胃微生物体外发酵参数的影响　　与对照组相比，当
以羊草精料混合物为底物时，添加活酵母显著降低了发酵液ｐＨ和乳酸含量（犘＜０．００１）（表１），显著提高了（犘＜
０．０５）丙酸浓度、总菌数和干物质消失率，其中酵母添加量为０．６２５×１０７ＣＦＵ／ｍＬ组的ｐＨ降低了２％，酵母菌
添加量为２．５００×１０７ＣＦＵ／ｍＬ组的乳酸浓度降低了２５％，丙酸浓度提高了６％，总菌数提高了３１％，干物质消
４４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．５
失率提高了１７％；但添加酵母对氨态氮浓度、总产气量、乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和总挥发性脂肪酸浓度
与乙丙比无显著影响（犘＞０．０５）。随酵母添加量的逐渐增加，添加酵母对ｐＨ的影响呈线性和二次方效应（犘＜
０．００１），但对乳酸、丙酸浓度和底物干物质消失率仅呈线性效应（犘＜０．０５）。
图４　筛选酵母２６犛狉犇犖犃系统进化树的构建
犉犻犵．４　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳２６犛狉犇犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犻狊狅犾犪狋犲
　节点上的数字为该分支的置信度水平Ｎｕｍｂｅｒｓａｂｏｖｅｅａｃｈｎｏｄｅａｒｅｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅｌｅｖｅｌ（％）ｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍ１０００ｂｏｏｔｓｔｒａｐｔｒｅｅｓ．
　
表１　以羊草精料混合物为底物时添加瘤胃源酵母对瘤胃微生物体外发酵参数的影响
犜犪犫犾犲１　犈犳犳犲犮狋狅犳犾犻狏犲狔犲犪狊狋犪犱犱犻狋犻狅狀狅狀犻狀狏犻狋狉狅犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狑犻狋犺犿犻狓狋狌狉犲狅犳犮犺犻狀犲狊犲狑犻犾犱狉狔犲犪狀犱犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犲犪狊狊狌犫狊狋狉犪狋犲
指标
Ｉｎｄｅｘ
酵母Ｙｅａｓｔ（×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）
０ ０．６２５ １．２５０ ２．５００
标准误
ＳＥＭ
显著性Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（犘值犘ｖａｌｕｅ）
线性Ｌｉｎｅａｒ 二次方Ｑｕａｄｒａｔｉｃ
ｐＨ ６．３１ ６．１３ ６．１８ ６．１７ ０．０２５ ＜０．００１ ＜０．００１
氨态氮 ＮＨ３Ｎ（ｍｇ／ｄＬ） １７．７９ １７．３８ １７．７９ １７．９５ ０．２３４ ０．２４２ ０．１０９
总产气量 Ｔｏｔａｌｇａｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ｍＬ） ４２．３８ ４５．００ ４５．２５ ４３．３８ ２．９４５ ０．７３１ ０．３０１
乳酸Ｌａｃｔａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．２８ ０．２７ ０．２３ ０．２１ ０．０１１ ＜０．００１ ０．８３０
乙酸 Ａｃｅｔａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ３３．９６ ３４．８８ ３５．３６ ３５．３２ １．６４７ ０．４０６ ０．６８９
丙酸Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ７．１０ ７．３１ ７．６７ ７．５５ ０．２３３ ０．０４９ ０．３５２
异丁酸Ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．５２ ０．５２ ０．４４ ０．６２ ０．０６０ ０．３００ ０．０７６
丁酸Ｂｕｔｙｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） １．９９ ２．１１ ２．１３ ２．１３ ０．０８９ ０．１５１ ０．３７０
异戊酸Ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．４１ ０．４１ ０．４３ ０．４３ ０．０２４ ０．４２４ ０．９０２
戊酸 Ｖａｌｅｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．３３ ０．３３ ０．３６ ０．３５ ０．０３２ ０．４２０ ０．８２５
总挥发性脂肪酸 Ｔｏｔａｌｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙａｃｉｄ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ４４．３０ ４５．５５ ４６．３９ ４６．３８ １．７３８ ０．２３４ ０．６２６
乙丙比 Ｒａｔｉｏｎｏｆａｃｅｔａｔｅｔｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ４．７８ ４．７８ ４．６１ ４．６８ ０．１７２ ０．３９２ ０．７７５
总菌数 Ｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａ（×１０１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ） ７．７７ ８．２８ ９．９２ １０．２３ ０．８３８ ０．００９ ０．８７０
干物质消失率犻狀狏犻狋狉狅ｄｒｙｍａｔｔｅｒｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ（％） ３２．７９ ３５．７９ ３７．３２ ３８．４３ １．５９４ ０．０２２ ０．８４６
２．３．２　添加Ｙ０９号酵母菌对以玉米淀粉为底物时瘤胃微生物体外发酵参数的影响　　与对照组相比，当以玉
米淀粉为底物时，添加活酵母显著降低了发酵液ｐＨ和乳酸含量（犘＜０．００１）（表２），其中２．５００×１０７ＣＦＵ／ｍＬ
组的发酵液ｐＨ值降低了３％，乳酸浓度降低了７６％；但对总产气量、氨态氮、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异
戊酸和总挥发性脂肪酸浓度、总菌数和乙丙比无显著影响（犘＞０．０５）。随酵母添加量的逐渐增加，添加酵母对发
５４１第２５卷第５期 草业学报２０１６年
酵液ｐＨ和乳酸浓度的影响呈线性效应（犘＜０．００１）。
２．３．３　添加Ｙ０９号酵母菌对以马铃薯淀粉为底物时瘤胃微生物体外发酵参数的影响　　以马铃薯淀粉为底物
时，与对照组相比，添加活酵母显著降低了发酵液ｐＨ（犘＜０．０５）（表３），提高了丙酸浓度和总菌数量（犘＜０．０５），
其中，酵母添加量为２．５００×１０７ＣＦＵ／ｍＬ组的发酵液ｐＨ降低了１％，丙酸提高了９％，总菌数提高了１９％；但
添加酵母未显著影响总产气量、氨态氮、乳酸、乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和总挥发性脂肪酸浓度（犘＞
０．０５）。随酵母添加量的逐渐增加，添加酵母对发酵液ｐＨ和丙酸浓度的影响呈线性效应（犘＜０．０５）。
表２　以玉米淀粉为底物时添加酵母对瘤胃微生物体外发酵参数的影响
犜犪犫犾犲２　犈犳犳犲犮狋狅犳犾犻狏犲狔犲犪狊狋犪犱犱犻狋犻狅狀狅狀犻狀狏犻狋狉狅犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狑犻狋犺犮狅狉狀狊狋犪狉犮犺犪狊狊狌犫狊狋狉犪狋犲狊
指标
Ｉｎｄｅｘ
酵母Ｙｅａｓｔ（×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）
０ ０．６２５ １．２５０ ２．５００
标准误
ＳＥＭ
显著性Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（犘值犘ｖａｌｕｅ）
线性Ｌｉｎｅａｒ 二次方Ｑｕａｄｒａｔｉｃ
ｐＨ ５．６８ ５．６３ ５．５２ ５．５１ ０．０３１ ＜０．００１ ０．５１０
氨态氮 ＮＨ３Ｎ（ｍｇ／ｄＬ） ２．９５ ３．４８ ３．０７ ３．２３ ０．４３７ ０．７５９ ０．５６３
总产气量 Ｔｏｔａｌｇａｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ｍＬ） ８８．７５ ８９．５０ ８９．６３ ９０．８８ ３．２４１ ０．５３８ ０．９１５
乳酸Ｌａｃｔａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．２１ ０．１６ ０．０８ ０．０５ ０．０２９ ＜０．００１ ０．５８４
乙酸 Ａｃｅｔａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ３８．１３ ３９．４０ ３９．３５ ３９．０１ ０．８９４ ０．３７９ ０．２２７
丙酸Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） １９．０６ １９．８２ ２０．０４ １９．５９ ０．５３５ ０．３０５ ０．１３７
异丁酸Ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．２１ ０．２０ ０．２２ ０．２２ ０．０４７ ０．７６０ ０．９７１
丁酸Ｂｕｔｙｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ５．２４ ４．９８ ５．２４ ５．１７ ０．０６２ ０．８１４ ０．０５５
异戊酸Ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．５７ ０．５４ ０．５５ ０．５６ ０．０２６ ０．９５９ ０．２９８
戊酸 Ｖａｌｅｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．３２ ０．３２ ０．３１ ０．３１ ０．００９ ０．１１６ ０．９５３
总挥发性脂肪酸 Ｔｏｔａｌｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙａｃｉｄ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ６３．５５ ６５．２８ ６５．７４ ６４．８８ １．３２９ ０．３１２ ０．１９３
乙丙比 Ｒａｔｉｏｎｏｆａｃｅｔａｔｅｔｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ２．００ １．９８ １．９６ １．９９ ０．０４５ ０．７０１ ０．５４６
总菌数 Ｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａ（×１０１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ） ７．９２ ９．０８ ９．０７ １０．１０ ０．９２４ ０．０５６ ０．９２１
表３　以马铃薯淀粉为底物时添加酵母对瘤胃微生物体外发酵参数的影响
犜犪犫犾犲３　犈犳犳犲犮狋狅犳狔犲犪狊狋犪犱犱犻狋犻狅狀狅狀犻狀狏犻狋狉狅犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狑犻狋犺狆狅狋犪狋狅狊狋犪狉犮犺犪狊狊狌犫狊狋狉犪狋犲
指标
Ｉｎｄｅｘ
酵母Ｙｅａｓｔ（×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）
０ ０．６２５ １．２５０ ２．５００
标准误
ＳＥＭ
显著性Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（犘值犘ｖａｌｕｅ）
线性Ｌｉｎｅａｒ 二次方Ｑｕａｄｒａｔｉｃ
ｐＨ ５．５９ ５．６１ ５．５６ ５．５４ ０．０２９ ０．０４７ ０．３６５
氨态氮 ＮＨ３Ｎ（ｍｇ／ｄＬ） ３．０８ ２．８７ ３．０３ ３．１８ ０．３９６ ０．７１６ ０．５２５
总产气量 Ｔｏｔａｌｇａｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ｍＬ） ８５．６３ ８６．３８ ８４．８８ ８６．３８ ２．３１２ ０．９２０ ０．８２２
乳酸Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．０９ ０．０６ ０．０７ ０．０７ ０．０２５ ０．４９５ ０．３９３
乙酸 Ａｃｅｔａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ３６．４１ ３５．２４ ３６．２４ ３７．２９ １．２０４ ０．３８７ ０．２２２
丙酸Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｍｍｏｌ／Ｌ） １７．４８ １８．０４ １８．５０ １９．３９ ０．７９８ ０．０４３ ０．７７９
异丁酸Ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．２８ ０．１８ ０．１９ ０．１９ ０．０４６ ０．１００ ０．１５７
丁酸Ｂｕｔｙｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ６．６３ ６．１８ ６．６５ ５．９６ ０．４６２ ０．３４８ ０．７２１
异戊酸Ｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．５９ ０．５８ ０．６２ ０．５８ ０．０２９ ０．８７８ ０．５５０
戊酸 Ｖａｌｅｒａｔｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．３０ ０．２９ ０．３１ ０．２７ ０．０２０ ０．２５７ ０．４６０
总挥发性脂肪酸 Ｔｏｔａｌｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙａｃｉｄ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ６１．７０ ６０．５１ ６２．５０ ６３．６７ １．８１１ ０．２２０ ０．３７７
乙丙比 Ｒａｔｉｏｎｏｆａｃｅｔａｔｅｔｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ２．０８ １．９６ １．９６ １．９３ ０．０９７ ０．１８９ ０．５２３
总菌数 Ｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａ（×１０１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ） ７．７０ ８．６７ ８．５３ ９．１３ ０．５６９ ０．０４９ ０．６６１
６４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．５
３　讨论
研究表明，在反刍动物饲料中添加活酵母或酵母培养物可改善瘤胃内环境、调整菌群结构以及提高日粮纤维
消化率［１８］；同时，一些报道显示，添加酵母还可显著提高瘤胃内乳酸的利用速度，降低瘤胃乳酸浓度［１１］。本研究
从山羊及奶牛瘤胃中分离获得了１４株酵母菌，通过乳酸利用和生长速度比较实验，筛选到一株乳酸利用率较高
且生长速度较快的酵母菌株。该酵母菌对乳酸的利用率可达６９．９２％，说明其对乳酸具有较强的代谢能力。同
时体外试验也表明，添加所分离的酵母菌显著降低了羊草精料组和玉米淀粉组发酵液中的乳酸浓度，该结果进一
步说明，所分离酵母具有利用乳酸的能力。我们在以前的研究中发现，瘤胃中的一些乳酸利用菌具有利用乳酸生
成丙酸的能力［１９］。结合本实验的报道结果，我们认为，在瘤胃微生物区系中，除瘤胃细菌具有利用乳酸的能力
外，瘤胃内的酵母等部分微生物也具有代谢乳酸的能力，这些结果显示，瘤胃微生物可能通过多类微生物代谢利
用乳酸。
瘤胃ｐＨ是衡量瘤胃发酵程度的一项重要参数，本实验结果表明，添加瘤胃源酵母显著降低了３种底物下发
酵液的ｐＨ值，由于ｐＨ值是反映瘤胃酸度的一个重要指标，ｐＨ值降低暗示瘤胃微生物发酵产物尤其是挥发性
脂肪酸产量增加，但本试验发现，添加酵母并未显著影响挥发性脂肪酸浓度，仅在数字上提高了总挥发性脂肪酸
的产量。该结果与Ｃｈｕｎｇ等［２０］报道基本一致，其在研究中也发现，添加酵母可影响奶牛瘤胃ｐＨ值，但并未显著
影响瘤胃液中挥发性脂肪酸浓度。本研究显示，添加酵母对羊草、玉米淀粉和马铃薯淀粉３种底物下乳酸浓度的
影响并不一致。其中对以玉米淀粉组影响最大、羊草精料混合组次之，而对马铃薯淀粉组无显著影响。该结果说
明，酵母对瘤胃微生物发酵参数的影响具有底物特异性。Ｔｏｍａｎｋｏｖａ和Ｈｏｍｏｌｋａ［２１］报道，较其他谷物类饲料比
较，玉米淀粉的瘤胃降解速率相对较低，其原因与玉米淀粉相对较低的溶解度及较低比例的支链淀粉有关。本试
验中，玉米淀粉处理组中未添加酵母组的发酵液ｐＨ值相对高于马铃薯组，其原因可能与玉米淀粉的较低发酵速
率有关。由于相对较高的ｐＨ值及较低的底物发酵速率有利于瘤胃微生物菌群结构稳定及功能发挥，因此，玉米
淀粉组发酵液中乳酸浓度显著下降可能该底物下乳酸利用菌群的活力较高有关。另一方面，较玉米淀粉与马铃
薯淀粉等单一原料为底物时比较，羊草与精料混合物组发酵液ｐＨ值更高，而高ｐＨ值有利于瘤胃乳酸利用菌生
长并发挥作用，这也可能是该底物条件下乳酸浓度较低的主要原因之一。
在瘤胃中，丙酸主要通过两条途径生成，一为乳酸经琥珀酸途径生成丙酸，另一方面是经丙烯酸途径生成。
本研究发现，添加活酵母显著提高了羊草精料混合组发酵液中丙酸浓度，该结果与乳酸浓度降低相对应，结果说
明，在以羊草精料混合物为底物时，添加９号酵母可能有利于瘤胃微生物发酵乳酸生成丙酸。但本研究发现，添
加酵母虽未显著影响马铃薯淀粉组发酵液中乳酸浓度，但显著提高了丙酸浓度。我们推测，以马铃薯淀粉为底物
时，发酵液中丙酸浓度显著升高可能与添加酵母影响了丙烯酸途径相关菌群的组成有关。本实验中，添加酵母对
３种不同底物条件下发酵液中总菌数均有不同程度的提高，其中对以羊草和精料混合物为底物时的作用效果更
明显。此外，本实验结果还显示，添加瘤胃源酵母菌显著促进了羊草精料混合物组的瘤胃降解率，该结果也与
Ｌｉｌａ等［１１］的报道一致。这些结果也进一步证实，添加酵母可影响瘤胃微生物的生长与功能。
４　结论
本实验从奶牛和山羊瘤胃液中分离到９４株疑似酵母菌，基于乳酸利用率和生长参数，筛选获得１株乳酸利
用率较高及生长速率较快的酵母菌，基因比对表明，该酵母菌属于犕犲狔犲狉狅狕狔犿犪属。体外试验表明，添加酵母可
显著提高羊草精料混合物的底物降解率，降低羊草精料混合物组和玉米淀粉组中的乳酸浓度，提高羊草精料混合
物组和马铃薯淀粉组发酵液中丙酸含量以及发酵液中总菌数。结果说明，所筛选的瘤胃酵母菌具有影响瘤胃微
生物发酵的作用，但影响程度和作用效果与底物类型相关。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＳｋｏｒｙＣＤ，ＨｅｃｔｏｒＲＥ，ＧｏｒｓｉｃｈＳＷ，犲狋犪犾．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌａｃｔａｔｅｐｅｒｍｅａｓｅｉｎｔｈｅｆｕｎｇｕｓＲｈｉｚｏｐｕｓ．Ｅｎｚｙｍｅａｎｄ
ＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，４６：４３５０．
７４１第２５卷第５期 草业学报２０１６年
［２］　ＷｉｌｉａｍｓＰＥＶ，ＴａｉｔＣＡＧ，ＩｎｎｅｓＧ Ｍ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｉｎｃｌｕｓｉｏｎｏｆｙｅａｓｔｃｕｌｔｕｒｅ（犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲ｐｌｕｓ
ｇｒｏｗｔｈｍｅｄｉｕｍ）ｉｎｔｈｅｄｉｅｔｏｆｃｏｗｓｏｎｍｉｌｋｙｉｅｌｄａｎｄｆｏｒａｇｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｔｈｅｒｕｍｅｎｏｆｓｈｅｅｐａｎｄ
ｓｔｅｅｒｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１９９１，６９：３０１６３０２６．
［３］　ＣａｒｒｏＭＤ，ＬｅｂｚｉｅｎＰ，ＲｏｈｒＫ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｙｅａｓｔｃｕｌｔｕｒｅｏｎｒｕｍｅｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｄｕｏｄｅｎａｌｆｌｏｗｉｎｄａｉｒｙｃｏｗｓ
ｆｅｄａｓｉｌａｇｅｂａｓｅｄｄｉｅｔ．ＬｉｖｅｓｔｏｃｋＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅ，１９９２，３２：２１９２２９．
［４］　ＣｈａｕｃｈｅｙｒａｓＦ，ＦｏｎｔｙＧ，ＢｅｒｔｉｎＧ，犲狋犪犾．犐狀狏犻狋狉狅Ｈ２ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｙａｒｕｍｉｎａｌａｃｅｔｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｕｌｔｉｖａｔｅｄａｌｏｎｅｏｒｉｎａｓｓｏ
ｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈａｎａｒｃｈｅａｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙａｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｔｒａｉｎｏｆ犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，６１：３４６６３４６９．
［５］　ＮｅｗｂｏｌｄＣＪ，ＷａｌａｃｅＲＪ，ＭｃＩｎｔｏｓｈＦＭ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆ犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲ｄｉｆｆｅｒｉｎｔｈｅｉｒｅｆｆｅｃｔｓｏｎｒｕｍｉｎａｌｂａｃ
ｔｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒｓ犻狀狏犻狋狉狅ａｎｄｉｎｓｈｅｅｐ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１９９５，７３：１８１１１８１８．
［６］　ＳｕｌｉｖａｎＨ Ｍ，ＭａｒｔｉｎＳＡ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲ｃｕｌｔｕｒｅｏｎ犻狀狏犻狋狉狅ｍｉｘｅｄｒｕｍｉｎａｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，１９９９，８２：２０１１２０１６．
［７］　ＭａｒｔｉｎＳＡ，ＮｉｓｂｅｔＤＪ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｒｅｃｔｆｅｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｏｎｒｕｍｅｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，１９９２，７５：
１７３６１７４４．
［８］　ＮａＲＳ，ＧｕｉＲ，ＡｏＣＪ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｙｅａｓｔｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒｕｍｉｎａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｇｒｏｗｉｎｇｐｒｏｆｅｒｍａｎｃｅｏｆｓｈｅｅｐ．Ｃｈｉｎｅｓｅ
ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００４，（１）：６９．
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８４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．５