全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５３１７ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
占今舜，魏明吉，苏效双，詹康，刘明美，张春刚，赵国琦．苜蓿黄酮对热应激下体外培养奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响．草业学报，２０１６，２５（４）：
１５９１６５．
ＺＨＡＮＪｉｎＳｈｕｎ，ＷＥＩＭｉｎｇＪｉ，ＳＵＸｉａｏＳｈｕａｎｇ，ＺＨＡＮＫａｎｇ，ＬＩＵＭｉｎｇＭｅｉ，ＺＨＡＮＧＣｈｕｎＧａｎｇ，ＺＨＡＯＧｕｏＱｉ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｎ
ｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ犻狀狏犻狋狉狅ｕｎｄｅｒｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（４）：１５９１６５．
苜蓿黄酮对热应激下体外培养奶牛
乳腺上皮细胞凋亡的影响
占今舜１，魏明吉１，２，苏效双１，詹康１，刘明美１，３，张春刚１，４，赵国琦１
（１．扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州２２５００９；２．临沂大学生命科学学院，山东 临沂２７６０００；３．江苏联合职业技术学院
淮安生物工程分院，江苏 淮安２２３２００；４．上海光明荷斯坦牧业有限公司，上海２００４４３）
摘要：本实验旨在研究苜蓿黄酮对热应激下体外培养奶牛乳腺上皮细胞的影响。将乳腺上皮细胞分成５组，每组
培养基中分别含有０，２５，５０，７５和１００μｇ／ｍＬ苜蓿黄酮，同时置于细胞培养箱３７℃，５％ＣＯ２ 培养７２ｈ，再在４２℃
恒温水浴锅中热应激１ｈ后返回细胞培养箱培养１２ｈ，检测细胞活性、抗氧化指标和相关基因的表达。结果显示：
１）添加２５μｇ／ｍＬ组的细胞活性显著高于０和５０μｇ／ｍＬ组（犘＜０．０５），其他各组之间差异不显著。２）相对于０
μｇ／ｍＬ组，５０～１００μｇ／ｍＬ组细胞的 ＧＳＨＰｘ活性升高（犘＜０．０１），ＬＤＨ 和 ＭＤＡ含量降低（犘＜０．０１或犘＜
０．０５），而ＣＡＴ活性无显著性差异。３）相对于０μｇ／ｍＬ组，５０和７５μｇ／ｍＬ组犆犪狊狆犪狊犲３和犛狅犮狊３基因表达降低
（犘＜０．０１），２５μｇ／ｍＬ组犘５３、犛狋犪狋１和犛狅犮狊１基因表达升高（犘＜０．０１或犘＜０．０５），而犅犮犾２和犉犪狊基因表达无显
著差异。综上所述，在热应激下，苜蓿黄酮能够提高体外培养奶牛乳腺上皮细胞的活性，改善抗氧化能力和抑制细
胞凋亡，其中添加７５μｇ／ｍＬ效果较好。
关键词：黄酮；奶牛；乳腺上皮细胞；热应激
犈犳犳犲犮狋狅犳犪犾犳犪犾犳犪犳犾犪狏狅狀狅犻犱狊狅狀犫狅狏犻狀犲犿犪犿犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾犮狌犾狋狌狉犲狊犻狀狏犻狋狉狅狌狀犱犲狉
犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊
ＺＨＡＮＪｉｎＳｈｕｎ１，ＷＥＩＭｉｎｇＪｉ１，２，ＳＵＸｉａｏＳｈｕａｎｇ１，ＺＨＡＮＫａｎｇ１，ＬＩＵ ＭｉｎｇＭｅｉ１，３，ＺＨＡＮＧＣｈｕｎＧａｎｇ１，４，
ＺＨＡＯＧｕｏＱｉ１
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犢犪狀犵狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犢犪狀犵狕犺狅狌２２５００９，犆犺犻狀犪；２．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲，
犔犻狀狔犻犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犔犻狀狔犻２７６０００，犆犺犻狀犪；３．犑犻犪狀犵狊狌犑狅犻狀狋犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔狅犳犘狉狅犳犲狊狊犻狅狀狅犳 犎狌犪犻’犪狀犅犻狅犲狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵
犅狉犪狀犮犺，犎狌犪犻’犪狀２２３２００，犆犺犻狀犪；４．犛犺犪狀犵犺犪犻犅狉犻犵犺狋犎狅犾狊狋犪狀犆狅．，犔狋犱，犛犺犪狀犵犺犪犻２００４４３，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅａｉｍｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｎ犻狀狏犻狋狉狅ｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉ
ｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｕｎｄｅｒｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ．Ｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｍｅｄｉａｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｉｏｎｓｏｆａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（０，２５，５０，７５，ａｎｄ１００μｇ／ｍＬ）ａｔ３７℃ ｗｉｔｈ５％ＣＯ２ｆｏｒ７２ｈ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅｃｕｌ
ｔｕｒｅｄｃｅｌｓｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏａｈｅａｔｓｈｏｃｋｔｒｅａｔｍｅｎｔ（４２℃ｆｏｒ１ｈ）ｂｅｆｏｒｅｂｅｉｎｇｒｅｔｕｒｎｅｄｔｏ３７℃ｗｉｔｈ５％ＣＯ２
ｆｏｒ１２ｈ．Ｔｈｅｃｅｌａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｉｎｄｅｘ，ａｎｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅｃｅｌａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｔｈｅ２５μｇ／ｍＬｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｔｈａｎｉｎｔｈｅ０ａｎｄ５０μｇ／ｍＬ
第２５卷 第４期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１５９－１６５
２０１６年４月
收稿日期：２０１５０６２５；改回日期：２０１５０９３０
基金项目：江苏省高校优势学科建设工程项目（ＰＡＰＤ），长三角地区生鲜乳质量安全追溯体系关键技术研究应用项目（１４３９５８１０１００）和江苏省高
校研究生科研创新计划项目（ＫＹＺＺ＿０３６７）资助。
作者简介：占今舜（１９８５），男，江西玉山人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｊｉｎｓｈｕｎ１９８５＠１６３．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｇｑｚｈａｏ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓ（犘＜０．０５），ｂｕｔｃｅｌａｃｔｉｖｉｔｙｄｉｄｎｏｔｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｍｏｎｇｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（０μｇ／ｍＬ）ｔｈｅ５０，７５，ａｎｄ１００μｇ／ｍＬｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓｓｈｏｗｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒ
ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ（犘＜０．０１）ａｎｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｍａｌｏｎｄｉａｌ
ｄｅｈｙｄｅｃｏｎｔｅｎｔｓ（犘＜０．０１ａｎｄ犘＜０．０５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．Ｔｈｅｃａｔａｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｉｄｎｏｔｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｍｏｎｇ
ｔｈｅｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（０μｇ／ｍＬ），ｔｈｅ５０ａｎｄ７５μｇ／ｍＬｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓｓｈｏｗｅｄ
ｒｅｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｏｆ犆犪狊狆犪狊犲３ａｎｄ犛狅犮狊３，ａｎｄｔｈｅ２５μｇ／ｍＬｇｒｏｕｐｓｈｏｗｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｏｆ犘５３，犛狋犪狋１，ａｎｄ犛狅犮狊１（犘＜０．０１ｏｒ犘＜０．０５）．Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｏｆ犅犮犾２ａｎｄ犉犪狊ｄｉｄｎｏｔ
ｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｍｏｎｇｔｈｅｇｒｏｕｐｓ．Ｔｏｇｅｔｈｅｒ，ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｃｅｌａｃ
ｔｉｖｉｔｙａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｃｅｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｉｓ７５μｇ／ｍＬ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｄａｉｒｙｃｏｗ；ｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌ；ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）由于营养价值高，含有丰富的蛋白质、粗纤维、维生素以及微量元素，被称为“牧
草之王”，是我国最重要的栽培牧草之一［１２］。苜蓿中的黄酮类化合物是一类含有２苯基色原酮结构的化合物，包
括黄酮醇、花色素、异黄酮等物质［３］。苜蓿中黄酮含量较高，据报道，４５个紫花苜蓿品种中有７０％以上品种的总
黄酮含量为０．６％～０．９％［４］。黄酮类化合物具有抗氧化、改善血液循环、抑制炎症等作用，添加在饲料中可促进
动物生长和改善繁殖性能等。欧阳克蕙等［５］研究发现，饲粮中添加苜蓿黄酮不会影响生长后期的崇仁麻鸡母雏
生产性能，但降低平均日采食量，减少脂肪沉积。朱宇旌等［６］研究发现，苜蓿黄酮对小鼠生长性能的影响与性别
和剂量有关，低剂量处理可显著地提高雄性小鼠的生长性能，高剂量能改善小鼠的特异性和非特异性免疫功能。
王伟等［７］发现，苜蓿总黄酮能够显著降低下丘脑中ＧｎＲＨ和垂体ＦＳＨ的表达量，高剂量组ＦＳＨ的表达量显著
降低和ＬＨＲ表达量显著升高，说明苜蓿总黄酮通过影响下丘脑－垂体－卵巢性腺轴来改善妊娠期间雌鼠的繁
殖性能。细胞培养技术是在活体内取出与试验相关组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，且建立无菌、适温和
一定的营养条件，使细胞生长和生存并维持其结构与功能的一种方法。该方法具有易于提供性状相似的试验对
象，耗资少，对于大型经济动物来讲比较经济等特点，被广泛用于医药、农业等领域［８９］。目前，利用细胞培养技术
来研究苜蓿黄酮对热应激下奶牛乳腺上皮细胞的影响鲜见报道。因此，本试验研究热应激下，苜蓿黄酮对奶牛乳
腺上皮细胞的影响，目的是从细胞水平研究苜蓿黄酮对奶牛的影响，丰富相关理论的研究，为推广苜蓿黄酮在奶
牛生产上的应用提供科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
苜蓿黄酮购于陕西绿清生物工程有限公司，奶牛乳腺上皮细胞由本试验室通过组织块培养法获得。
１．２ 试验方法
１．２．１ 细胞培养 试验于２０１４年１０月开始进行，将细胞置于ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，美国）培养基在３７℃，
５％ＣＯ２ 的培养箱中培养，培养基中含有１０％的胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ，美国）、２ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、１００Ｕ／ｍＬ青霉素
和１００μｇ／ｍＬ链霉素（Ｓｉｇｍａ，美国）。
１．２．２ 噻唑蓝（ＭＴＴ）法检测细胞活性 以密度为３×１０４ 个／ｍＬ细胞接种到９６孔板，分为５组，即基础培养
基中分别加０，２５，５０，７５和１００μｇ／ｍＬ苜蓿黄酮，每组５个重复，其中苜蓿黄酮用ＤＭＳＯ（索莱宝，北京）完全溶
解，各处理组中的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）含量为２‰。细胞于３７℃，５％ＣＯ２ 培养箱中培养７２ｈ后，将其置于４２℃
恒温水浴锅中热应激１ｈ后回细胞培养箱培养１２ｈ，然后分别在每孔中加入２０μＬ０．５％ ＭＴＴ，放回培养箱中继
续培养４ｈ，然后去除培养液，用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）冲洗２遍，每孔加入ＤＭＳＯ１５０μＬ于摇床混匀１０ｍｉｎ，最
后在４９０ｎｍ下测定ＯＤ值。
１．２．３ 抗氧化指标的测定 取密度为２．５×１０５ 个／ｍＬ细胞接种到１２孔板，方法同上。然后根据购买于南
京建成生物工程研究所试剂盒中的说明书测定一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ＮＯ）含量、乳酸脱氢酶（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏ
０６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
ｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＧＳＨＰｘ）、过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）、超氧化物
歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性和丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）含量。
１．２．４ 细胞总ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ的合成 取密度为５×１０５ 个／ｍＬ细胞接种到６孔板，方法同上。然后
根据购买于天根生化科技有限公司ＲＮＡ提取试剂盒中的说明书进行组织总ＲＮＡ的提取，采用ＯｎｅＤｒｏｐ仪器
进行总ＲＮＡ的浓度和纯度的测定。采用Ｔａｋａｒａ反转录试剂盒进行ｃＤＮＡ的合成，ｃＤＮＡ合成试验在冰上进
行，１０μＬ体系，反应条件为３７℃１５ｍｉｎ、８５℃５ｓ、４℃保存。所得ｃＤＮＡ保存于－２０℃待测。
１．２．５ 引物设计 根据ＧｅｎｅＢａｎｋ中的基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计引物，引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合
成（表１）。
表１ 引物设计
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉犱犲狊犻犵狀
基因Ｇｅｎｅ 登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ 产物长度Ｐｒｏｄｕｃｔｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
β犪犮狋犻狀 ＮＭ＿１７３９７９．３ Ｆ：ＧＡＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡ ２０５
Ｒ：ＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣ
犉犪狊 ＮＭ＿１７４６６２．２ Ｆ：ＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧ １８９
Ｒ：ＣＡＧＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴ
犆犪狊狆犪狊犲３ ＮＭ＿００１０７７８４０．１ Ｆ：ＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡ １６７
Ｒ：ＡＧＣＣＴＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＴＴ
犅犮犾２ ＮＭ＿００１１６６４８６．１ Ｆ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧＧＣＧＣＴＡＣ １８１
Ｒ：ＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＡＣ
犘５３ ＮＭ＿１７４２０１．２ Ｆ：ＣＧＴＣＴＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＴＣ １９４
Ｒ：ＣＴＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＧＴＣＡＴＧＴＧ
犛狅犮狊３ ＮＭ＿１７４４６６．２ Ｆ：ＧＧＣＣＡＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＧＴ ９９
Ｒ：ＴＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＣＣＧＡＡＴＧＧ
犛狅犮狊１ ＣＢ４６００５５．１ Ｆ：ＣＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡ ９４
Ｒ：ＣＴＣＧＴＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴ
１．２．６ ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ条件 根据ＴａＫａＲａ试
剂盒说明书进行冰上配制反应液（表２），后在罗氏
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ?９６ＰＣＲ仪上进行检测。
１．３ 数据处理
采用２－ΔΔ犆狋方法进行基因相对表达量计算，用
Ｅｘｃｅｌ２００７进行试验数据预处理，结果以平均值±
标准差表示，采用 ＳＰＳＳ１７．０单因素方差分析
（ＡＮＯＶＡ），ＬＳＤ法多重比较，犘＜０．０１表示差异极
显著，犘＜０．０５表示差异显著。
２ 结果与分析
２．１ 苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞活性的影响
由表３可知，添加２５μｇ／ｍＬ苜蓿黄酮组的奶
牛乳腺上皮细胞活性显著高于０和５０μｇ／ｍＬ组
（犘＜０．０５），其他各组之间差异不显著。说明添加
低剂量的苜蓿黄酮具有提高乳腺上皮细胞抗热应激
的作用。
表２ 犚犜－犘犆犚反应液
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲狉犲犪犮狋犻狅狀犾犻狇狌犻犱狅犳狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
试剂
Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ
使用量
Ｖｏｌｕｍｅ
（μＬ）
终浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（μｍｏｌ／Ｌ）
ＳＹＢＲ预混合试剂ＥｘＴａｑⅡ １０．０ １×
ＳＹＢＲ?ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑⅡ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓ） ２×
ＰＣＲ正向引物ＰＣＲｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．８ ０．４
ＰＣＲ反向引物ＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．８ ０．４
ｃＤＮＡ模板ｃＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ ２．０ １×
灭菌蒸馏水ＳｔｅｒｉｌｅｄＨ２Ｏ ６．４
总体积 Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ ２０．０
ＰＣＲ反应条件为：９５℃预变性３０ｓ；ＰＣＲ反应为９５℃、５ｓ，６０℃、２０ｓ，循
环４０次；融解曲线分析６５℃、１５ｓ。ＲｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＰＣＲ：ｉｎｉｔｉａｌｄｅ
ｎａｔｕｒａｔｉｏｎｉｎ９５℃，３０ｓ；ＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｉｎ９５℃５ｓ，６０℃２０ｓ，４０ｃｙｃｌｅｓ；
ｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎ６５℃，１５ｓ．
１６１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
表３ 苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞活性的影响
犜犪犫犾犲３ 犈犳犳犲犮狋狅犳犪犾犳犪犾犳犪犳犾犪狏狅狀狅犻犱狊狅狀犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犿犪犿犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾
项目Ｉｔｅｍ
苜蓿黄酮Ａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（μｇ／ｍＬ）
０ ２５ ５０ ７５ １００
ＯＤ ０．１０±０．０１ｂ ０．１２±０．０１ａ ０．０９±０．０１ｂ ０．１１±０．０２ａｂ ０．１１±０．０１ａｂ
注：同行不同小写字母表示差异显著 （犘＜０．０５），不同大写字母表示差异极显著 （犘＜０．０１），下同。
Ｎｏｔｅ：Ｉｎｔｈｅｓａｍｅｒｏｗ，ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（犘＜０．０５）ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｈｉｇｈｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（犘＜０．０１）．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．２ 苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞抗氧化性指标的影响
由表４可知，相对于０μｇ／ｍＬ组，２５～１００μｇ／ｍＬ组细胞的ＧＳＨＰｘ活性均显著提高（犘＜０．０１），但ＬＤＨ
活性则相反；１００μｇ／ｍＬ组细胞的ＮＯ含量降低（犘＜０．０５），５０～１００μｇ／ｍＬ组细胞 ＭＤＡ含量降低（犘＜０．０１
或犘＜０．０５），５０μｇ／ｍＬ组细胞的ＳＯＤ活性降低（犘＜０．０１），但各处理组的ＣＡＴ活性无显著性差异。说明添加
苜蓿黄酮具有改善细胞的抗氧化功能。
表４ 苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞抗氧化指标的影响
犜犪犫犾犲４ 犈犳犳犲犮狋狅犳犪犾犳犪犾犳犪犳犾犪狏狅狀狅犻犱狊狅狀犪狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犻狀犱犲狓狅犳犿犪犿犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾
项目Ｉｔｅｍ
苜蓿黄酮Ａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（μｇ／ｍＬ）
０ ２５ ５０ ７５ １００
ＧＳＨＰｘ（Ｕ／ｍＬ） ２１２．４０±１．８９Ｅ ２５５．３９±９．８５Ｄ ３９０．８０±３．１７Ｃ ４５９．３４±１．７８Ｂ ５０５．８７±９．４７Ａ
ＳＯＤ（Ｕ／ｍＬ） ２３．１２±１．３５Ａａ ２２．３６±０．３６ＡＢａ ２１．００±０．９７Ｂｂ ２３．１４±０．４８Ａａ ２２．３８±０．８３ＡＢａ
ＣＡＴ（Ｕ／ｍＬ） １０．１０±０．６９ａ １０．７２±１．３５ａ １０．８５±１．０５ａ １１．５９±０．７７ａ １０．９１±０．９０ａ
ＭＤＡ（ｎｍｏｌ／Ｌ） ５．４６±０．５０Ａａ ４．４７±０．５０Ａａｂ ３．８１±０．７６Ａｂ ４．１４±０．７６ＡＢｂ ２．６５±０．７６Ｂａ
ＮＯ（μｍｏｌ／Ｌ） ６．５２±０．６３ａ ６．６３±０．４２ａｂ ６．６７±０．５６ａｂ ６．５７±０．４８ａｂ ５．９７±０．６８ｂ
ＬＤＨ （Ｕ／Ｌ） ８２１．２１±１７４．７４Ａ ３３０．５１±７９．３９Ｂ ３０１．１８±５８．６１Ｂ ３００．０６±４６．６９Ｂ ３９３．６８±２９．５７Ｂ
２．３ 苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞相关基因表达的影响
由表５可知，各处理组犅犮犾２和犉犪狊基因表达无显著差异，５０和７５μｇ／ｍＬ组犆犪狊狆犪狊犲３和犛狅犮狊３基因表达显
著低于０μｇ／ｍＬ组（犘＜０．０１）。相对于０μｇ／ｍＬ组，２５μｇ／ｍＬ组犘５３、犛狋犪狋１和犛狅犮狊１基因表达升高（犘＜０．０１
或犘＜０．０５）。说明添加适量的苜蓿黄酮能够抑制细胞的凋亡。
表５ 苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞相关基因表达的影响
犜犪犫犾犲５ 犈犳犳犲犮狋狅犳犪犾犳犪犾犳犪犳犾犪狏狅狀狅犻犱狊狅狀狉犲犾犪狋犻狏犲犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犿犪犿犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾
项目Ｉｔｅｍ
苜蓿黄酮Ａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（μｇ／ｍＬ）
０ ２５ ５０ ７５ １００
犅犮犾２ １．０１±０．０２ａ １．１０±０．２６ａ ０．９２±０．２４ａ １．１６±０．５１ａ ０．７２±０．１０ａ
犆犪狊狆犪狊犲３ １．００±０．０７Ｂ ０．５２±０．０８Ｃ ０．５８±０．０５Ｃ ０．５９±０．０５Ｃ １．３４±０．２３Ａ
犘５３ １．０７±０．１４ＡＢｂ １．５７±０．１７Ａａ １．３２±０．１６Ａａｂ ０．７２±０．０５Ｂｂ １．３２±０．３５Ａａｂ
犉犪狊 １．０１±０．０８ａ ０．９６±０．２４ａ １．２１±０．１８ａ １．０７±０．１１ａ ０．９４±０．２６ａ
犛狋犪狋１ １．０１±０．０３ｂ １．３１±０．３１ａ ０．９７±０．１９ｂ １．１０±０．１５ａｂ １．２２±０．１２ａｂ
犛狅犮狊１ １．０１±０．０５ＢＣｂ １．６１±０．２４Ａａ １．２２±０．０８Ｂａ １．２９±０．０７Ｂａ ０．９０±０．１３Ｃａ
犛狅犮狊３ １．１２±０．３６Ａ １．１３±０．２２Ａ ０．４９±０．１３Ｂ ０．５６±０．０７Ｂ ０．５４±０．１１Ｂ
２６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
３ 讨论
周振峰等［１０］研究发现，奶牛乳腺上皮细胞在４２℃高温处理下生长停滞，细胞凋亡率在４２℃高温培养测定的
第３ｈ达到最大值。宋学立等［１１］发现，热应激促使细胞活性氧（ＲＯＳ）升高是导致心肌细胞损伤的重要机制之
一，细胞凋亡是热应激心肌细胞死亡的主要途径。说明热应激能够导致细胞活力下降，诱导细胞凋亡。刘春龙
等［１２］和林成招等［１３］研究发现，适量的大豆异黄酮能够促进奶牛乳腺上皮细胞和大鼠小肠细胞的增殖。陈静［１４］
研究发现，在一定范围内，槲皮素能够上调奶牛乳腺上皮细胞存活率。说明黄酮类化合物具有提高细胞活性的功
能。在本试验中，添加苜蓿黄酮具有改善奶牛乳腺上皮细胞活性的趋势。原因可能是热应激导致细胞产生
ＲＯＳ，而黄酮通过释放的 Ｈ＋与活性氧ＲＯＳ相结合，直接清除氧自由基［１５１６］，从而降低氧自由基对细胞的损伤，
提高细胞活性。
一般情况下，细胞内自由基的产生和清除处于平衡状态，不会对细胞造成伤害。然而，当细胞内大量自由基
积累，会产生大量 ＭＤＡ，促使细胞解体，最终导致细胞死亡［９］。牟瑛等［１７］研究二羟异黄酮和三羟异黄酮处理过
氧化氢诱导的中国仓鼠卵巢细胞，发现细胞的ＬＤＨ释放量和 ＭＤＡ的含量降低。刘英华等［１８］发现，大豆异黄酮
能够升高氧化损伤的血管内皮细胞的ＳＯＤ和ＧＳＨＰｘ的活性及ＮＯ的浓度。余薇等［１９］发现，葛花总黄酮预处
理能够提高缺氧／复氧心肌细胞的ＳＯＤ活性，降低培养液中ｉＮＯＳ释放量及胞内 ＭＤＡ含量。陈静［１４］研究表明，
槲皮素能上调细胞ＳＯＤ活性，下调ＭＤＡ含量及胞外ＬＤＨ活性。在本试验中，苜蓿黄酮提高奶牛乳腺上皮细胞
的ＧＳＨＰｘ的活性，降低ＬＤＨ活性和 ＭＤＡ的含量。说明苜蓿黄酮能够通过提高抗氧化酶的活性来减缓氧化
应激，进而保护细胞免受损伤，抑制细胞死亡。
在热应激下，细胞的ＲＯＳ活性升高，其在细胞内的积累会导致Ｂａｘ表达、Ｃａｓｐａｓｅ活化等现象［２０］。Ｃａｓｐａｓｅｓ
家族成员大多数是凋亡的启动子或效应子，在细胞凋亡过程中发挥重要作用。其中 Ｃａｓｐａｓｅ３被认为是凋亡的
关键蛋白酶，一旦被激活，凋亡就不可避免［２１］。在本试验中，添加２５～７５μｇ／ｍＬ苜蓿黄酮组的犆犪狊狆犪狊犲３基因
表达均显著低于未添加组，说明在热应激下，苜蓿黄酮可能通过清除细胞内的ＲＯＳ来抑制Ｃａｓｐａｓｅ蛋白的活化，
进而抑制细胞的凋亡。犅犮犾２可能是通过影响内质网内Ｃａ２＋的释放、抑制氧自由基的产生以及和Ｂａｘ等结合形
成异构二聚体来抑制细胞凋亡［２２］。张锦等［２３］研究发现，黄酮类化合物通过上调Ｂｃｌ２蛋白的表达和抑制Ｂａｘ蛋
白的表达来抑制小鼠心肌细胞的凋亡。在本试验中，苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞的犅犮犾２基因表达没有显著影响。
与其不同可能是物种不同以及黄酮的种类不同造成的。Ｐ５３能够激活细胞凋亡受体Ｆａｓ，而Ｆａｓ与ＦａｓＬ相结合
产生三聚体Ｆａｓ复合体，就能诱导细胞凋亡［２４２５］。在本试验中，７５μｇ／ｍＬ组细胞的犘５３基因表达降低，说明苜
蓿黄酮可能通过抑制犘５３的表达来抑制细胞凋亡。然而在本试验中犉犪狊基因表达未降低，可能是因为ＤＮＡ损
伤而诱导的犉犪狊表达具有组织特异性，并不需要犘５３参与［２６］。在本试验中，犉犪狊基因表达无显著性变化，说明苜
蓿黄酮可能不通过调节犉犪狊的表达来抑制细胞凋亡。信号传递与转录激活因子１（Ｓｔａｔ１）通过激活犘５３、Ｃａｓｐａｓ
ｅｓ和ＴＮＦα凋亡蛋白，抑制抗凋亡犅犮犾２和犅犮犾狓基因的表达来促进细胞凋亡［２７］。从本试验结果来看，苜蓿黄
酮对细胞犛狋犪狋１基因表达影响不大。热应激能够促进细胞因子ＩＬ６的分泌，ＩＬ６刺激细胞产生活化的Ｓｔａｔ３，进
而诱导Ｓｏｃｓ１的生成。Ｓｏｃｓ１能够干扰细胞中ＩＬ６信号转导子ｇｐ１３０和Ｓｔａｔ３的酪氨酸激酶磷酸化，从而抑制凋
亡［２８］。犛狅犮狊３的过表达，会抑制Ｓｔａｔ３信号路与ＮＦκＢ信号在细胞核内存在信号交联，促进细胞凋亡［２９］。从本
试验结果来看，在热应激下，苜蓿黄酮可能通过促进犛狅犮狊１的表达和抑制犛狅犮狊３的表达来调节犛狋犪狋３的表达，进而
抑制细胞凋亡。
４ 结论
在热应激下，添加低剂量的苜蓿黄酮能够提高体外培养奶牛乳腺上皮细胞的活性；苜蓿黄酮能够提高细胞的
ＧＳＨＰｘ的活性，降低ＬＤＨ活性和 ＭＤＡ的含量，从而改善细胞的抗氧化能力；苜蓿黄酮可能通过抑制犆犪狊狆犪狊
犲狊３的表达以及通过促进犛狅犮狊１的表达和抑制犛狅犮狊３的表达来调节犛狋犪狋３的表达，进而抑制细胞凋亡。从本试验
结果来看，添加７５μｇ／ｍＬ组的效果较好。
３６１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
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５６１第２５卷第４期 草业学报２０１６年