全 文 ：书狼尾草属牧草狉犇犖犃的犐犜犛序列分析
陈志彤１，２，黄勤楼２，潘伟彬２，３，黄毅斌１，２
（１．福建农林大学生命科学学院，福建 福州３５０００２；２．福建省农业科学院农业生态研究所 福建省山地草业工程技术
研究中心，福建 福州３５００１３；３．闽西职业技术学院资源工程系，福建 龙岩３６４０２１）
摘要：对来自福建、江苏、海南等１５份狼尾草属牧草的５．８ＳｒＤＮＡ、ＩＴＳ１及ＩＴＳ２片段进行克隆及序列分析，并登
录于ＧｅｎＢａｎｋ数据库，采用ＤＮＡＭＡＮ、ＣＬＵＳＴＡＬＸ、ＭＥＧＡ等软件分析其遗传关系聚类图。结果显示，克隆的
目的片段长度为５７３～５８６ｂｐ，聚类结果总体能较好地反应狼尾草属牧草之间的遗传距离，其中杂交狼尾草和细茎
杂交狼尾草可能存在着同种异名的现象。
关键词：狼尾草；ＩＴＳ；牧草
中图分类号：Ｓ５４４＋．３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１０）０４０１３５０７
　 狼尾草属（犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿）牧草是热带、亚热带和温带地区的重要牧草，它是一年生或多年生禾本科牧草，全世
界约８０种，多数原产于非洲［１］。我国人工栽培利用的种主要有多年生的象草（犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿）、一年生的美洲狼
尾草（犘．犪犿犮狉犻犲犪狀狌犿）以及象草与美洲狼尾草的杂交种，即杂交狼尾草（象草♂×美洲狼尾草♀）和热研４号王
草（象草♀×美洲狼尾草♂）［２］。杂交狼尾草兼有象草的高产和美洲狼尾草的品质优、适口性好等优点，并且适应
性强、生长迅速、寿命长、营养丰富［３］，干物质中含粗蛋白１１％，粗脂肪２．３％，粗纤维３０％，无氮浸出物４５．８％，
粗灰分１０．２％，并含有大量的钙、磷等。作为牧草产生的经济效益是明显的，就杂交狼尾草而言，其草期长，产量
高，每公顷产鲜草１０００ｋｇ，甚至高达２５００ｋｇ，营养丰富且适口性好，可饲养牛、羊、鹅、兔、草鱼等［４］。深受广大
养殖场主的欢迎，是福建省乃至热带、亚热带地区重要的刈割型优良牧草。
福建地区种植多种狼尾草属牧草，其形态特征略有不同，随着当地农民的广泛种植，加上野生狼尾草草种。
人们对狼尾草属牧草的种质背景了解不清，进而影响到狼尾草属牧草在草食畜牧业上的应用。为了更好地研究
福建当地多种狼尾属牧草，在前期品比试验的基础上，本试验对福建当地狼尾草属牧草以及省内外引进的狼尾草
进行了ＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ）分子标记研究，以期从不同水平上对优良的狼尾草属牧草进行鉴定，更
好地指导狼尾草在当地畜牧业上的生产应用。
伴随着分子生物学技术的成熟，ＤＮＡ分子标记技术由于操作简单、成本低、分析量大、省时省力、分析速度快
等特点再加上用ＤＮＡ分子作为遗传信息的直接载体不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，
因而以ＤＮＡ分子特征进行物种鉴别其结果更加准确可靠，已被大量地用于种质鉴定及相关方面的研究［５８］。由
于核糖体ＤＮＡ中包含了进化速度不等的编码区、非编码转录区和非转录区，如ＩＴＳ是核糖体ＤＮＡ中介于１８Ｓ
和５．８Ｓ之间（ＩＴＳ１）以及５．８Ｓ和２６Ｓ之间（ＩＴＳ２）的非编码转录间隔区，进化速度快且片段长度不大，加上ＩＴＳ
序列变化与进化距离相适应，目前该技术已成为在序列水平上探讨科内属间及属下种间关系十分有效的手
段［９１１］，国内已对中间偃麦草（犈犾狔狋狉犻犵犻犪犻狀狋犲狉犿犲犱犻犪）［１２］、仲彬草属（犓犲狀犵狔犻犾犻犪）［１３］、山羊草属（犃犲犵犻犾狅狆狊）［１４］等禾
本科植物进行了ＩＴＳ间区系统发育分析，但尚无对于狼尾草属牧草进行ＩＴＳ序列方面的研究。本研究通过对狼
尾草ＩＴＳ扩增片段进行序列上的分析，以期有效地区别福建当地种质混杂的狼尾草属牧草，为狼尾草的栽培、繁
育和质量评价提供分子水平的依据，避免盲目引种，更好地指导青饲料生产，促进草地畜牧业的发展。
第１９卷　第４期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１３５－１４１
２０１０年８月
 收稿日期：２００９０６２２；改回日期：２００９０９０７
基金项目：国家科技支撑计划项目（２００８ＢＡＤＢ３Ｂ０８），农业部“引进国际先进农业科学技术”项目［２００６Ｇ８（４）２０４］，福建省科技厅重点项目
（２００８Ｎ００１８）和福建省科技厅公益型专项资助。
作者简介：陈志彤（１９７９），男，福建安溪人，助理研究员，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｃｒｃｚｔ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｅｃｏｈｙｂ＠１６３．ｃｏｍ
１　材料与方法
１．１　供试样品
采集的狼尾草属牧草品种有来自江苏省农业科学院、中国热带农业科学院以及福建当地种植的地方品种（包
括细茎杂交狼尾草、台农２号、南牧１号，南牧２号、牧草蔗、闽牧６号）共１５个，详见表１。
表１　供试狼尾草样品
犜犪犫犾犲１　犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿狊狆犲犮犻犲狊犻狀狋狉犻犪犾
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
狼尾草品种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
样品来源
Ｓｐｅｃｉｅｓｓｏｕｒｃｅ
１ 杂交狼尾草犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿 江苏省农业科学院ＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＪＡＡＳ）
２ 细茎杂交狼尾草犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｓｌｉｍｓｔｅｍ 福州北峰Ｂｅｉｆｅｎｇ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ
３ 紫象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｐｕｒｐｌｅ 江苏省农业科学院ＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＪＡＡＳ）
４ 矮象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｄｗａｒｆ 江苏省农业科学院ＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＪＡＡＳ）
５ 红象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｒｅｄ 中国热带农业科学院ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＴＡＳ）
６ 象草（Ｎ５１）犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎ５１ 江苏省农业科学院ＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＪＡＡＳ）
７ 象草（Ｎ８５）犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎ８５ 江苏省农业科学院ＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
８ 台农２号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｔａｉｎｏｎｇ２ 福州北峰Ｂｅｉｆｅｎｇ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ
９ 南牧１号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎａｎｍｕ１ 福州北峰Ｂｅｉｆｅｎｇ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ
１０ 南牧２号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎａｎｍｕ２ 南平市农业科学研究所ＮａｎｐｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
１１ 桂牧１号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｇｕｉｍｕ１ 中国热带农业科学院ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＴＡＳ）
１２ 台湾 甜 草 犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿 ｃｖ．Ｔａｉｗａｎ
ｓｗｅｅｔｇｒａｓｓ
中国热带农业科学院ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＴＡＳ）
１３ 热研４号王草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿×犘．犪犿犲狉犻犮犪狀犪ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．４ 中国热带农业科学院ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＴＡＳ）
１４ 牧草蔗犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｓｕｇａｒｃａｎｅ 福建省农业科学院甘蔗所ＳｕｇａｒｃａｎｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦｕｊｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
１５ 闽牧６号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｍｉｎｍｕ６ 福建省农业科学院农业生态研究所 ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｃｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，
ＦｕｊｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
１．２　ＤＮＡ的提取
采用改进的ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，十六烷基三甲基溴化铵）法［１５］。对基因组ＤＮＡ
的质量要求去除ＲＮＡ无降解的ＤＮＡ即可，无特殊要求。
１．３　目的片段ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２ｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增
ＰＣＲ反应体系总体积为２５μＬ，其中包含：ＤＮＡ模板５０ｎｇ；ｄＮＴＰ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）２．５μＬ；１０×ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ；
ＭｇＣｌ２２μＬ；Ｔａｑ酶０．２μＬ（５Ｕ／μＬ）；引物（５ｐｍｏｌ／μＬ）２μＬ，引物 Ｗ１序列为５′ＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴ
ＧＡＡＣ３′，５′ＴＡＴＧＣＴＴＡＡＡＣＴＣＡＧＣＧＧＧ３′［１６］。ＰＣＲ扩增程序为 ９５℃预变性３ｍｉｎ；９４℃，５ｓ；５８℃，１
ｍｉｎ；７２℃，９０ｓ；３５个循环，７２℃ 延伸１０ｍｉｎ；最后用含ＥＢ（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，溴化乙锭）的１．５％琼脂糖凝胶电
泳检测扩增结果，在ＧｅｌＤｏｃ２０００凝胶成像系统上观察并贮存图像。
１．４　ＩＴＳ目的片段的克隆与测序
由于ＩＴＳＰＣＲ扩增片段直接测序会导致较大的测序错误，因此必须将ＩＴＳ扩增片段进行克隆方可测序。目
的片段的克隆采用大连宝生物ｐＭＤ１８Ｔ载体试剂盒提供的方法进行，并对阳性转化菌鉴定［１７］，将阳性转化菌
交由上海生工公司测序，采用正反向同时测序，以确保测序的准确性。
１．５　序列分析
将１５个样品的目的片段测序结果经过ＧｅｎＢａｎｋ数据库比对分析后，登录于美国国家生物技术信息中心
６３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ数据库上，其序列号见表２。序列结果运用ＤＮＡＭＡＮ计算品种同源性（表２），并转化碱基，用
ＣＬＵＳＴＡＬＸ，１．８１版进行碱基排序和比对，再用 ＭＥＧＡ软件以邻位连接（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ）和Ｋｉｍｕｒａ为计算
式进行同源性分析，得出系统进化树［１８］。
２　结果与分析
２．１　目的片段ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２ｒＤＮＡ片段扩增结果
使用引物对狼尾草基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，获得单一清晰的ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２ｒＤＮＡ片段图谱，大
小大约在５００～６００ｂｐ（图１）。
２．２　１５个样品目的片段ＧｅｎＢａｎｋ序列号
测试的１５个狼尾草ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２ｒＤＮＡ片段长度在５７３～５８５ｂｐ，其ＧＣ（鸟嘌呤＋胞嘧啶）含量在
５７．７％～５８．８％（表２），说明这段序列含有高的ＧＣ含量（＞５０％）。１５条测试序列登录于ＧｅｎＢａｎｋ数据库里。
图１　犐犜犛１－５．８犛－犐犜犛２狉犇犖犃片段扩增图
犉犻犵．１　犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狆狉狅犳犻犾犲狊狅犳犐犜犛１－５．８犛－犐犜犛２犳狉犪犵犿犲狀狋狊狅狀犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿
Ｍ、１～１５、ＣＫ分别代表分子标记、试验材料１～１５、空白对照 Ｍ，１－１５，ＣＫｒｅｆｅｒｔｏｍａｒｋｅｒ
（ＧｅｎｅＲｕｌｅｒＴＭ１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒｐｌｕｓ），ｓａｍｐｌｅ１－１５，ｃｈｅｃｋ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
表２　供试狼尾草样品目的片段犌犲狀犅犪狀犽序列号
犜犪犫犾犲２　犅犪狊犲犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狅犳犐犜犛１－５．８犛－犐犜犛２狉犲犵犻狅狀狊狅犳犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿狊狆犲犮犻犲狊
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
品种
Ｓｐｅｃｉｅｓ
片段长度
Ｌｅｎｇｔｈｏｆｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔ（ｂｐ）
ＧＣ含量
Ｃｏｎｔｅｎｔ（％）
序列号
ＧｅｎＢａｎｋｎｕｍｂｅｒ
１ 杂交狼尾草犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿 ５８５ ５８．３ ＦＪ６２６３５２
２ 细茎杂交狼尾草犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｓｌｉｍｓｔｅｍ ５８５ ５８．３ ＦＪ６２６３５３
３ 紫象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｐｕｒｐｌｅ ５８５ ５８．３ ＦＪ６２６３５４
４ 矮象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｄｗａｒｆ ５８５ ５８．３ ＦＪ６２６３５５
５ 红象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｒｅｄ ５７３ ５８．１ ＦＪ６２６３５６
６ 象草（Ｎ５１）犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎ５１ ５８５ ５８．３ ＦＪ６２６３５７
７ 象草（Ｎ８５）犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎ８５ ５８５ ５８．８ ＦＪ６２６３５８
８ 台农２号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｔａｉｎｏｎｇ２ ５８５ ５８．３ ＦＪ６２６３５９
９ 南牧１号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎａｎｍｕ１ ５８５ ５７．９ ＦＪ６２６３６０
１０ 南牧２号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎａｎｍｕ２ ５８５ ５８．１ ＦＪ６２６３６１
１１ 桂牧１号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｇｕｉｍｕ１ ５８５ ５７．９ ＦＪ６２６３６２
１２ 台湾甜草犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｔａｉｗａｎｓｗｅｅｔｇｒａｓｓ ５８５ ５８．１ ＦＪ６２６３６３
１３ 热研４号王草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿×犘．犪犿犲狉犻犮犪狀犪ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．４ ５８６ ５７．７ ＦＪ６２６３６４
１４ 牧草蔗犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｓｕｇａｒｃａｎｅ ５８５ ５８．５ ＦＪ６２６３６５
１５ 闽牧６号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｍｉｎｍｕ６ ５８６ ５７．７ ＦＪ６２６３６６
７３１第１９卷第４期 草业学报２０１０年
２．３　同源性比对结果
序列结果运用ＤＮＡＭＡＮ计算品种同源性，品种间的同源性均大于９７．１％，说明品种间的同源性较高
（表３）。
表３　供试狼尾草样品同源性比对结果
犜犪犫犾犲３　犚犲狊狌犾狋狊狅犳犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狋犺犲犐犜犛狊犲狇狌犲狀犮犲狊 ％
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
狼尾草品种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５
１ 杂交狼尾草犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿
２ 细茎杂交狼尾草犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．
ｓｌｉｍｓｔｅｍ
１００
３ 紫象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｐｕｒｐｌｅ ９８．８９８．８
４ 矮象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｄｗａｒｆ １００ １００ ９８．８
５ 红象草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｒｅｄ ９７．９９７．９９７．９９７．９
６ 象草（Ｎ５１）犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎ５１ ９９．３９９．３９８．５９９．３９７．６
７ 象草（Ｎ８５）犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎ８５ ９９．１９９．１９９．０９９．１９８．４９８．８
８ 台农２号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｔａｉｎｏｎｇ２９９．３９９．３９９．５９９．３９８．３９９．０９９．５
９ 南牧１号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎａｎｍｕ１ ９９．０９９．０９８．８９９．０９７．９９８．６９９．１９９．３
１０ 南牧２号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｎａｎｍｕ２ ９８．６９８．６９８．８９８．６９７．７９８．３９８．８９９．３９９．０
１１ 桂牧１号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｇｕｉｍｕ１ ９９．３９９．３９８．８９９．３９７．９９９．０９９．１９９．３９９．０９８．６
１２ 台湾甜草犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｔａｉｗａｎ
ｓｗｅｅｔｇｒａｓｓ
９９．１９９．１９９．３９９．１９８．１９８．８９９．３９９．８９９．１９９．１９９．１
１３ 热研４号王草犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿×犘．犪犿犲狉犻犮犪狀犪ｃｖ．Ｒｅｙａｎ
Ｎｏ．４
９７．４９７．４９７．３９７．４９９．１９７．１９７．９９７．８９７．４９７．１９７．４９７．６
１４ 牧草蔗犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｓｕｇａｒｃａｎｅ ９９．１９９．１９８．６９９．１９７．７９８．８９９．０９９．１９８．８９８．５９９．５９９．０９７．３
１５ 闽牧６号犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｍｉｎｍｕ６ ９７．４９７．４９７．３９７．４９９．１９７．１９７．９９７．８９７．４９７．１９７．４９７．６９９．７９７．３
２．４　系统进化树
系统进化树显示（图２），１５个狼尾草品系可分为Ⅰ、Ⅱ两大簇。其中红象草、皇竹草、闽牧６号被分为一簇，
而另外１２个品系则被归为另一簇。系统进化树统计结果与所测得目的片段ＤＮＡ序列同源性相比，在反映品种
间的进化关系上基本一致，其中１号杂交狼尾草、２号细茎杂交狼尾草和４号矮象草在ＩＴＳ序列上完全一致，从
而显示了三者之间较近的亲缘关系，结合狼尾草形态学品比试验（包括对产量、株高、草层高、分蘖数、粗蛋白、粗
脂肪、粗纤维等指标的分析）来看，矮象草在株型上较矮，与１号、２号相差较大，而１号和２号之间在形态学指标
上则相差不多，从而判断二者有可能存在同种异名的现象。１３号皇竹草与１５号闽牧６号在ＩＴＳ序列上仅相差２
个碱基，与牧草育种结果相符，因闽牧６号是福建省农业科学院农业生态研究所通过皇竹草选育而来，从而也反
证了ＩＴＳ分子标记技术的可靠性。然而３号紫象草与５号红象草却被分别划在了２个簇中，显示出较远的亲缘
性，而从形态学上分析，１５个狼尾草品系里只有３号和５号叶色为红色，从而在形态学与分子标记之间产生了冲
突。通过仔细研究发现，５号红象草的ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２ｒＤＮＡ片段长度为５７３个碱基，比对结果显示红象草
缺失了一段碱基序列为ＴＣＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴ的１２个碱基，从而与其他品种显示出差异性。
３　讨论
目前，越来越多的分子标记技术被应用于研究生物遗传多样性、杂种鉴定、分类与系谱等研究领域上，随着近
年来分子生物学技术在草业研究上的应用，一些传统的以及新兴的分子标记技术被应用于禾本科牧草的研究上，
如詹秋文等［１９］应用ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）及ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）技术构建了４２
８３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
图２　１５种狼尾草属牧草的系统进化树
犉犻犵．２　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳１５犳狅狉犪犵犲犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊狅犳犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿犱犲犱狌犮犲犱犳狉狅犿犐犜犛１－５．８犛－犐犜犛２狊犲狇狌犲狀犮犲
分支处数字代表支持强度Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ（１０００ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）ｖａｌｕｅｓａｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄａｂｏｖｅｂｒａｎｃｈｅｓ
份高梁（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）和苏丹草（犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲）品种资源ＤＮＡ指纹图谱，并成功鉴定了杂交种。薛丹丹
等［２０］应用ＳＲＡＰ－ＰＣＲ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）技术对３７份结缕草属（犣狅狔犻狊犪）植物进行了杂
种鉴定。此外，ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＩＳＳＲ（ｉｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｐｅａｔ）、ＳＳＲ等技
术也被成功地应用于燕麦（犃狏犲狀犪狊犪狋犻狏犪）［２１］、柱花草（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊）［２２］、披碱草（犈犾狔犿狌狊）［２３］等草本植物研究上。
这些分子标记技术各有各的特点，也存在着一些不足，包括重复性差、引物设计成本、操作的复杂性等问题。ＩＴＳ
分子标记技术目前被广泛应用于科内属间及属下种间的进化关系上，有其自身独特的优点，比如ＩＴＳ１和ＩＴＳ２
作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，承受的选择压力较小，进化速度较快，核苷酸序列变化较大，且其变
异以相互独立的点突变为主，是ｒＤＮＡ中的中度保守区，可为属下水平的研究提供较丰富的变异位点和信息位
点的系统学信息［２４］，加上ＩＴＳ１和ＩＴＳ２片段长度不大，包括５．８ＳｒＤＮＡ在内，总长度只有６００～７００ｂｐ，而且
ＩＴＳ１、ＩＴＳ２两侧的结构基因１８Ｓ、５．８Ｓ、２６ＳｒＤＮＡ的序列非常保守，这样就可以利用与它们序列互补的通用引
物对ＩＴＳ区进行ＰＣＲ扩增和测序。这使ＩＴＳ序列十分适宜进行各种分子操作，从而被应用于被子植物系统发
育和进化研究上［２５２７］。
本试验将ＩＴＳ标记技术应用于狼尾草属牧草上，试验结果能较好地反应狼尾草属牧草的亲缘关系，由于ＩＴＳ
标记技术直接用于测序上，其试验结果比起其他分子标记手段就显得更为可信，加上ＩＴＳ片段扩增引物一般较
长，使试验重复性良好，易于操作。但对于品种间亲缘关系的综合判断，还需结合形态学指标等进行合理分析，包
括ＩＴＳ序列的统计软件选择上，也会对统计结果产生影响。本试验台农２号（８号）与台湾甜草（１２号）仅相差１
个碱基，ＤＮＡＭＡＮ计算同源性为９９．８％，紫象草（３号）与台湾甜草（１２号）相差４个碱基，ＤＮＡＭＡＮ计算同源
性为９９．３％，然而系统进化树却显示紫象草（３号）与台湾甜草（１２号）亲缘关系更近。从品比试验指标来看，台
农２号与台湾甜草在总干重上无显著差异，而此二者与紫象草则都有显著差异，三者在其他方面的指标（包括粗
蛋白、粗脂肪、ＮＤＦ、ＡＤＦ等）无太大差异，综合分析品比试验的结果，台湾甜草与台农２号的遗传距离要比紫象
草来得近些，这与测序结果相吻合。因此，对于种属间亲缘进化关系上的判断，应该综合应用多项有效手段，包括
不同的试验手段、分析方法，从而找出最合适的结合点，使试验结果更为客观、合理、准确。
参考文献：
［１］　林洁荣，刘建昌，苏水金．福建南亚热带狼尾草属牧草品比试验［Ｊ］．福建农林大学学报（自然科学版），２００３，３２（１）：１１０
９３１第１９卷第４期 草业学报２０１０年
１１２．
［２］　王栋．牧草学各论（新１版）［Ｍ］．任继周，王槐三，卢得仁，修订．南京：江苏科学技术出版社，１９８９：１２１．
［３］　白淑娟，丁成龙，顾洪如，等．美洲狼尾草资源的鉴定与评价［Ｊ］．国外农学———杂粮作物，１９９７，（４）：２６２９．
［４］　韦文科．优质牧草———杂交狼尾草栽培与利用［Ｊ］．农家之友，２００３，（２１）：２５．
［５］　刘忠，汪小全，陈之端，等．五味子科的系统发育：核糖体ＤＮＡＩＴＳ区序列证据［Ｊ］．植物学报，２０００，４２：７５８７６１．
［６］　汪小全，李振宇．ｒＤＮＡ片段的序列分析在苦苣苔亚科系统学研究中的应用［Ｊ］．植物分类学报，１９９８，３６（５）：４０３４１０．
［７］　ＫｏｎｇＨＺ，ＣｈｅｎＺＤ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙｉｎｃｈｌｏｒａｎｔｈｕｓｓｗａｒｔｚ（Ｃｈｌｏｒａｎｔｈａｃｅａｅ）ｉｎｆｅｒｒｅｄｆｒｏｍｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｒＤＮＡＩＴＳｒｅｇｉｏｎ［Ｊ］．
ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０００，４２：７６２７６４．
［８］　ＨｓｉａｏＣ，ＣｈａｔｔｅｒｔｏｎＮＪ，ＡｓａｙＫＨ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆｔｈｅｍｏｎｇｅｎｏｍｉｃｓｐｅｃｉｅｓｏｆｗｈｅａｔｔｒｉｂｅ，Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ（ｐｏａｃｅ
ａｅ），ｉｎｆｅｒｒｅｄｆｒｏｍｎｕｃｌｅａｒｒＤＮＡ（ＩＴＳ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，９０：３８９３９８．
［９］　ＢａｌｄｗｉｎＢＧ，ＳａｎｄｅｒｓｏｎＭＪ，ＰｏｔｒｅｒＪＭ，犲狋犪犾．ＴｈｅＩＴＳｒｅｇｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ：Ａｖａｌｕａｂｌｅｓｏｕｒｃｅｏｆｅｖｉｄｅｎｃｅｏｎ
ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｐｈｙｌｏｇｅｎｙ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆｔｈｅＭｉｓｓｏｕｒｉＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｒｄｅｎ，１９９５，８２：２４７２７７．
［１０］　ＳｃｈａａｌＢＡ，ＬｅａｒｎＧＨ．ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｖａｒｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎａｎｄａｍｏｎｇｐｌａｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆｔｈｅＭｉｓｓｏｕｒｉＢｏｔａｎｉｃａｌ
Ｇａｒｄｅｎ，１９９８，７５：１２０７１２１６．
［１１］　ＳｏｌｔｉｓＰＳ，ＫｕｚｏｆｆＲＫ．ＩＴＲＳｓｅｑｕｅｎｃｅｖａｒｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎａｎｄａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆ犔狅犿犪狋犻狌犿犵狉犪狔犻ａｎｄ犔．犾犪犲狏犻犵犪狋狌犿［Ｊ］．
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，１９９３，２：１６６１７０．
［１２］　李大勇，茹岩岩，张学勇．中间偃麦草（犜犺犻狀狅狆狔狉狌犿犻狀狋犲狉犿犲犱犻狌犿）１８Ｓ－５．８Ｓ－２６ＳｒＤＮＡ位点在染色体上的分布及对其
核ＩＴＳ序列异质性的分析［Ｊ］．植物学报（英文版），２００４，４６（１０）：１２３４１２４１．
［１３］　张利，周永红，丁春邦，等．基于ＩＴＳ序列分析仲彬草属植物的亲缘关系［Ｊ］．西北植物学报，２００７，２７（３）：４９０４９６．
［１４］　施苏华，王建波．山羊草属二倍体物种核ｒＤＮＡＩＴＳ区序列及其系统发育关系分析［Ｊ］．植物学报（英文版），２０００，４２（５）：
５０７５１１．
［１５］　陈志彤，黄毅斌，应朝阳，等．ＲＡＰＤ技术在狼尾草属牧草上的应用［Ｊ］．热带农业科学，２００８，２８（４）：７１０．
［１６］　ＭａｒｔｅｌＥ，ＰｏｎｃｅｔＶ，ＬａｍｙＦ，犲狋犪犾．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｎｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆ犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿ｓｐｅｃｉｅｓ（Ｐｏａｃｅａｅ）：ＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＩＴＳｐｈｙｌｏｇｅｎｙ［Ｊ］．
ＰｌａｎｔＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００４，２４９：１３９１４９．
［１７］　陈志彤，陈坚，郑伟文．泽泻１８Ｓ－２６ＳｒＲＮＡ及其ＩＴＳ片断的克隆及序列分析［Ｊ］．闽西职业大学学报，２００４，６（２）：１１１
１１５．
［１８］　刘春卉，瞿伟菁，张雯，等．药用真菌金耳的ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析与鉴别［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００７，１９（２）：２１６２２０．
［１９］　詹秋文，李杰勤，汪保华，等．４２份高梁与苏丹草及其２个杂交种ＤＮＡ指纹图谱的构建［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（６）：
８５９２．
［２０］　薛丹丹，郭海林，郑轶琦，等．结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定———ＳＲＡＰ分子标记［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（１）：
７２７９．
［２１］　刘欢，赵桂琴，耿小丽，等．燕麦ＡＦＬＰ反应体系的建立与优化［Ｊ］．草业科学，２００８，２５（２）：８４８９．
［２２］　唐燕琼，胡新文，郭建春，等．柱花草种质遗传多样性的ＩＳＳＲ分析［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（１）：５７６４．
［２３］　严学兵，王，周禾，等．不同来源ＳＳＲ标记在我国披碱草属植物的通用性和效率评价［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（６）：１１２
１２０．
［２４］　王建波，张文驹，陈家宽．核ｒＤＮＡ的ＩＴＳ序列在被子植物系统与进化研究中的应用［Ｊ］．植物分类学报，１９９９，３７（４）：
４０７４１４．
［２５］　ＫｏｈＮ，ＣｈｕｎｇＳＷ，ＧｏｒｏＫ，犲狋犪犾．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓｏｆｔｈｅｍｏｎｏｔｙｐｉｃｇｅｎｕｓＨａｙａｔａｅｌａ（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）ｅｎｄｅｍｉｃｔｏＴａｉ
ｗａｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＲｅｓｅａｒｃｈ，２００６，１１９：６５７６６１．
［２６］　ＮｏｂｕｏＫ，ＤａｉｋｉＭ，ＡｋｉｒａＮ，犲狋犪犾．Ａｔｔａｉｎｉｎｇｉｎｔｅｒｓｕｂｇｅｎｅｒｉｃｈｙｂｒｉｄｓｉｎｆｒａｇｒａｎｔａｚａｌｅａｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｔｈｅｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆｏｒ
ｇａｎｅｌｅＤＮＡ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００８，１５９（１）：６７７２．
［２７］　ＴｏｕｌｏｕｍｅｎｉｄｏｕＴ，ＢａｋｋｅｒＦＴ，ＡｌｂｅｒｓＦ．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｙｏｆ犕狅狀狊狅狀犻犪Ｌ．（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ，２００７，２６４：１１４．
０４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
犛犲狇狌犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲狉犇犖犃犐犜犛狉犲犵犻狅狀狅犳犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿狊狆犲犮犻犲狊（犘狅犪犮犲犪犲）
ＣＨＥＮＺｈｉｔｏｎｇ１，２，ＨＵＡＮＧＱｉｎｌｏｕ２，ＰＡＮ Ｗｅｉｂｉｎ２，３，ＨＵＡＮＧＹｉｂｉｎ１，２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｃｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦｕｊｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ／Ｆｕｊｉａｎ
ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＨｉｌｙＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｕｚｈｏｕ３５００１３，
Ｃｈｉｎａ；３．ＭｉｎｘｉＶｏｃａｔｉｏｎａｌａｎｄＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，ＲｅｓｏｕｒｃｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｌｏｎｇｙａｎ３６４０２１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）ｒｅｇｉｏｎｓｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｆｒｏｍ１５ｓｐｅｃｉｅｓｏｆ犘犲狀狀犻狊犲
狋狌犿 （Ｐｏａｃｅａｅ）ｆｒｏｍａｒｅａｓｓｕｃｈａｓＦｕｊｉａｎ，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｈａｉｎａｎｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｎｄｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏｔｈｅ
Ｇｅｎｂａｎｋｄａｔａｂａｓｅ．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆｔｈｅ１５ｓｐｅｃｉｅｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙＣＬＵＳＴＡＬＸａｎｄＭＥＧＡ
ｓｏｆｔｗａｒｅ．ＴｈｅｉｒｌｅｎｇｔｈｏｆｎｒＤＮＡＩＴＳｒｅｇｉｏｎｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ５７３ｔｏ５８６ｂｐ．犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ａｎｄ
犘．犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿×犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．ｓｌｉｍｓｔｅｍｍａｙｂｅｔｈｅｓａｍｅｖａｒｉｅｔｙｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎａｍｅｓ．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｒａｍ
ｔｒｅｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｒＤＮＡＩＴＳｒｅｇｉｏｎｓｉｓａｇｏｏｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿；ＩＴＳ；ｆｏｒａｇｅ
１４１第１９卷第４期 草业学报２０１０年