全 文 ：书转录因子犇犚犈犅１犃基因和犅犪狉基因双价植物表达
载体的构建及对马铃薯遗传转化的研究
贾小霞１，齐恩芳１，王一航１，文国宏１，龚成文１，
王红梅２，李建武１，马胜１，胡新元１
（１．甘肃省农业科学院马铃薯研究所，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：马铃薯在生长发育过程中受各种生物和非生物胁迫的影响，干旱是其中最常见和危害最严重的非生物胁迫
因素之一，常常导致单产不高，总产不稳，严重影响着马铃薯产业的发展。本研究以改善马铃薯抗旱性为目的，采
用ＰＣＲ方法从拟南芥中克隆了转录因子ＤＲＥＢ１Ａ基因和诱导型启动子ｒｄ２９Ａ。利用ＤＮＡ重组技术成功构建了
诱导型启动子ｒｄ２９Ａ驱动转录因子ＤＲＥＢ１Ａ基因和ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动Ｂａｒ基因的双价植物表达载体ｐＢＩ１２１
ｒｄ２９ＢＤＲ，并通过农杆菌介导法对马铃薯进行遗传转化，ＰＰＴ筛选得到２２株抗性苗，ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测证明
ＤＲＥＢ１Ａ基因已整合到陇薯１０号马铃薯基因组中并在转基因植株中转录表达，有望提高转基因马铃薯的抗旱性。
目前，作者正在进行转基因马铃薯的抗旱性分析研究。
关键词：ＤＲＥＢ１Ａ基因；转录因子；ｒｄ２９Ａ启动子；抗旱性；马铃薯
中图分类号：Ｓ５３２．０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０３０１１００８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０３１２
马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）块茎营养丰富，不仅含有大量淀粉和优质蛋白，而且含有多种维生素和矿物质，
是宜粮、宜菜、宜饲、宜做工业原料等用途广泛的块茎类作物，其块茎形成与膨大期需要大量的水分供应。近年
来，我国大部分地区持续干旱，特别是在北方地区，干旱发生频率较高［１２］。干旱胁迫是限制马铃薯生长发育的重
要因子，严重影响着马铃薯产业的发展。因此，培育综合性状优良的抗旱品种非常迫切。转基因育种技术作为一
种强有力的工具，在不改变作物原有特性的基础上，将控制重要农艺性状的关键基因导入其中，从而实现品种改
良的目的。
目前，马铃薯的遗传转化中，绝大多数用ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动目的基因的表达，ＣａＭＶ３５Ｓ启动子是植物组
成型强启动子，它驱动外源基因在植物的各种组织和所有发育阶段都会表达［３５］，这不仅增加植株的代谢负担、浪
费大量的物质和能量，还改变植物的基因调控和代谢途径，导致植物的形态发生改变，从而影响植物正常的生长
发育。另一方面，植物的耐旱性是一个复杂的多基因控制系统［６］，通过转入单个功能基因改良的方式，作用单一，
很难奏效［７８］。
ｒｄ２９Ａ是ＤＲＥＢｌＳ调控的目的基因，在植物细胞缺水时能够大量表达。ｒｄ２９Ａ的启动子区域含有 ＡＢＲＥ
（ＡＢＡｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ，保守序列：ＣＡＣＧＴＧＧＣ／ＡＣＡＣＧＴＧＧＣ）顺式作用元件和ＤＲＥ核心序列。植物细胞
缺水时，植物产生的内源 ＡＢＡ通过信号传导产生与ｒｄ２９Ａ启动子的 ＡＢＲＥ序列结合的转录因子，可以启动
ｒｄ２９Ａ的表达，ＤＲＥＢ１Ｓ转录因子与ｒｄ２９Ａ启动子ＤＲＥ核心序列结合也可以诱导该基因的表达。在植物细胞
不缺水时，ｒｄ２９Ａ并不表达［９１１］，它是一个干旱诱导型启动子。
干旱响应转录因子可以调控一系列耐旱相关基因的表达，证明是一种更加有效地提高耐旱性的途径［１２１７］。
目前研究结果显示，转录因子ＤＲＥＢ１Ａ可以调控４０多个与干旱、高盐和低温胁迫有关的功能基因的表达［１８２１］。
因此，以ｒｄ２９Ａ启动子驱动ＤＲＥＢ１Ａ转录因子在转基因植物中表达，可以大大减小因基因组成型表达（如植物
１１０－１１７
２０１４年６月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２３卷 第３期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
收稿日期：２０１３０９２２；改回日期：２０１３１１０７
基金项目：国家自然科学基金（３１０６０２００）资助。
作者简介：贾小霞（１９７８），女，甘肃定西人，副研究员，博士。Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｘｘ０６０１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：８４４３７４９０５＠ｑｑ．ｃｏｍ
基因工程中常用的３５Ｓ启动子驱动下的表达）给转基因植株带来的不利影响，并避免转入单个功能基因作用单一
的局限性，提高植物抗逆性更有优势。本研究从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中克隆了ｒｄ２９Ａ 启动子和
ＤＲＥＢ１Ａ转录因子，利用ＤＮＡ重组技术构建了诱导型启动子ｒｄ２９Ａ驱动转录因子ＤＲＥＢ１Ａ基因和ＣａＭＶ３５Ｓ
启动子驱动Ｂａｒ基因的双价植物表达载体，并通过农杆菌介导法对马铃薯进行遗传转化，获得了转基因植株，为
改良马铃薯种质资源和薯类作物的抗逆性奠定了基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
植物材料：拟南芥为Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型，２０１０年１０月在甘肃省农业科学院生物技术研究所培养获得试管苗。
马铃薯陇薯１０号为２０１１年４月在甘肃省农业科学院马铃薯研究所种质资源和生物技术研究室脱毒扩繁的试管
苗。整个试验完成时间为２０１０年１０月到２０１３年８月。菌株和质粒：载体ｐＧＥＭＴｖｅｃｔｏｒ和大肠杆菌菌株
ＤＨ５ａ购自大连宝生物工程有限公司，其余菌株由本实验室保存。Ｔａｑ酶、各种限制性内切酶、氨卞青霉素、卡拉
霉素、ＩＰＴＧ、Ｘｇａｌ等试剂均购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＮＡ回收试剂盒购自上海
华舜生物工程有限公司；其他各种试剂均为国产分析纯。基因测序由赛百盛公司完成。
１．２ 拟南芥总基因组ＤＮＡ的提取和ＤＲＥＢ１Ａ基因及ｒｄ２９Ａ启动子的克隆
分别根据ＧｅｎＢａｎｋ中检索到的拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ基因序列（ｇｅｎｅｂａｎｋＩＤ：ＡＢ００７７８７），ｒｄ２９Ａ启动子原序列
（ｇｅｎｅｂａｎｋＩＤ：Ｄ１３０４４），利用ＰＣＲ技术从拟南芥基因组中分离ＤＲＥＢ１Ａ基因和ｒｄ２９Ａ启动子。通过分子生物
学分析软件Ｏｌｉｇｏ６．０设计合成了以下４条引物（北京赛百盛生物技术公司），ＤＲＥＢ１Ａ基因引物，Ｄ１：５′ＧＣＧ
ＧＧＡＴＣＣ犅犪犿ＨⅠＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＣ３′；Ｄ２：５′ＧＣＧＡＣＴＡＧＴ犛狆犲Ⅰ ＴＴＡＡＴＡＡＣＴＣＣＡ
ＴＡＡＣＧＡＴＡＣ３′。ｒｄ２９Ａ启动子引物，Ｒ１：５′ＧＣＧＡＡＧＣＴＴ犎犻狀ｄⅢ ＡＧＴＡＣＴＳｃａⅠ ＡＡＣＧＣＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴ
ＧＧＡＧＧＡ３′，Ｒ２：５′ＧＣＧＧＧＡＴＣＣ犅犪犿ＨⅠ ＣＴＴＴＣＣＡＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＴＣＡＡＡＣＣ３′。
１．３ ＮＯＳ终止子序列ＮＯＳ１ 和ＮＯＳ２ 的亚克隆
根据ＮＯＳ终止子序列，通过分子生物学分析软件Ｏｌｉｇｏ６．０设计合成了以下４条引物（北京赛百盛生物技
术公司），ＮＯＳ１ 序列引物，Ｎ１：５′ＧＣＧＧＧＡＴＣＣ犅犪犿ＨⅠＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴ３′，Ｎ２：５′ＧＣＧＧＡＧ
ＣＴＣ犛犪犮Ⅰ ＡＣＴＡＧＴ犛狆犲Ⅰ ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡ３′；ＮＯＳ２ 序列引物，Ｎ３：５′ＧＣＧＧＡＡＴＴＣ犈犮狅ＲⅠ
ＡＡＧＣＴＴ犎犻狀ｄⅢ ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴ３′，Ｎ４：５′ＧＣＧＣＡＣＡＡＡＧＴＧ犇狉犪 Ⅲ ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧ
ＴＡＡＣＡ３′。
１．４ 中间载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＡＤＲ的构建
用犛犪犮Ⅰ和犅犪犿ＨⅠ酶切植物表达载体ｐＢＩ１２１，回收大片段，将回收的大片段与ＮＯＳ１ 序列连接，构建成中
间载体ｐＢＩ１２１Ｎ１，再用犛狆犲Ⅰ和犅犪犿ＨⅠ双酶切ｐＢＩ１２１Ｎ１，回收大片段，将回收的大片段与基因ＤＲＥＢ１Ａ片
段相连接，构建成中间载体ｐＢＩ１２１ＤＲ，用犎犻狀ｄⅢ和犅犪犿ＨⅠ双酶切ｐＢＩ１２１ＤＲ，回收大片段，将回收的大片段
与ｒｄ２９Ａ启动子片段相连接，构建成中间载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＡＤＲ。
１．５ 双价植物表达载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ的构建
用犈犮狅ＲⅠ和犅犪犿ＨⅠ双酶切植物表达载体ｐＢＩ１２１，回收大片段，将回收的大片段与用同样酶切ｐＡＨＣ２５回
收的小片段连接，构建成中间载体ｐＢＩ１２１３５ＳＢａｒ（图１）。用犈犮狅ＲⅠ和犇狉犪Ⅲ双酶切ｐＢＩ１２１３５ＳＢａｒ，回收大片
段，将回收的大片段与ＮＯＳ２ 序列连接，构建成中间载体ｐＢＩ１２１３５ＳＮ２，用犎犻狀ｄⅢ单酶切ｐＢＩ１２１３５ＳＮ２，回收
酶切的小片段３５ＳＢａｒＮｏｓ，并与用同样酶切ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＡＤＲ所得的载体大片段相连接，构建成双价植物表达
载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ。
１．６ 马铃薯的遗传转化及其分子检测
１．６．１ 根癌农杆菌转化 载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ向根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４的直接转化参照文献［２２２３］。采用
液氮冻融法将ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ质粒导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４感受态细胞，涂布在含有５０ｍｇ／Ｌ利福平（ｒｉｆ
１１１第２３卷第３期 草业学报２０１４年
ａｍｐｉｃｉｎ，Ｒｉｆ）、５０ｍｇ／Ｌ链霉素（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｓｔｒ）和５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素（ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）的固体ＹＥＢ培养基
上培养。挑取单菌落进行ＰＣＲ检测，确定质粒导入农杆菌中，获得可用于植物遗传转化研究的工程农杆菌
ＬＢＡ４４０４（ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ）。
图１ 狆犅犐１２１狉犱２９犃犅犇犚载体
犉犻犵．１ 犛狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳狏犲犮狋狅狉狆犅犐１２１狉犱２９犃犅犇犚
１．６．２ 马铃薯外植体的转化及植株再生 将无菌试管苗切成０．５ｃｍ长，不带腋芽的茎段，在固体培养基（ＭＳ＋
２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２ｍｇ／ＬＧＡ３＋０．５ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ）制成的平板上预培养３ｄ，随后在制备好的农
杆菌工程菌中浸泡８ｍｉｎ，其间不断摇动，取出后用无菌滤纸吸干表面的菌液，转入附加羧卞青霉素（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｎ，Ｃｒｂ）５００ｍｇ／Ｌ的固体愈伤组织诱导培养基上，于２８℃黑暗共培养３ｄ。暗培养结束后，将茎段转移到附加草
丁膦（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ，ＰＰＴ）２ｍｇ／Ｌ和Ｃｒｂ５００ｍｇ／Ｌ的相同培养基上，经过抗性愈伤的初步筛选后转接到抗
性芽分化筛选培养基进行抗性芽的诱导和筛选，连续光照强度２０００ｌｘ、（２５±１）℃条件下诱导芽分化。至抗性芽
长至１～２ｃｍ时，将其切下转入附加ＰＰＴ２ｍｇ／Ｌ和Ｃｒｂ浓度逐渐减量的ＭＳ培养基上，进一步进行阳性转化植
株的抗性筛选和诱导生根。
１．６．３ 转基因植株的ＰＣＲ检测 参照杨锦芬等［２４］的方法，用十六烷基三乙基溴化铵（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉ
ｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法提取转基因马铃薯植株及未转基因马铃薯的叶片总ＤＮＡ。即在２ｍＬ离心管中，加入
５００μＬ的２×ＣＴＡＢ和２０μＬβ巯基乙醇，６５℃预热，取待检测试管苗植株叶片０．５ｇ，放入经液氮预冷的研钵
中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，混匀后置６５℃水浴中保温３０
ｍｉｎ，并不时轻轻转动试管，加等体积的氯仿／异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，移上清
至另一离心管中，向管中加入１／１００体积的ＲＮａｓｅＡ溶液，３７℃放置２０～３０ｍｉｎ，加入２倍体积的无水乙醇，会
出现絮状沉淀，－２０℃放置３０ｍｉｎ后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ回收ＤＮＡ沉淀，用７０％乙醇清洗沉淀２次，吹
干后溶于适量的灭菌ｄｄＨ２Ｏ中，用０．８％琼脂糖凝胶电泳检测基因组ＤＮＡ的完整性。以此ＤＮＡ为模板进行
ＰＣＲ检测。
１．６．４ ＲＴ－ＰＣＲ检测 参照郑琳琳等［２５］的方法，用３０％ＰＥＧ模拟干旱条件，对马铃薯胁迫３ｄ后分析目的基
因的表达情况。马铃薯总ＲＮＡ的提取使用ＲＮＡｐｒｅｐｐｕｒｅＰｌａｎｔＫｉｔ（ＴＩＡＮＧＥＮ）试剂盒。ｃＤＮＡ的合成采用
ＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ）试剂盒。以马铃薯犪犮狋犻狀基因为内标，其特异引物为 Ａ１：５′ＧＧＡ
ＧＡＡＡＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＡＣＡＴ３′，Ａ２：５′ＧＴＴＧＧＡＡＧＧＴＡＣＴＴＡＡＡＧＡＡＧＣＣ３′，扩增片段长度
为８０３ｂｐ。ＲＴ－ＰＣＲ反应体系２５μＬ：包括１０×ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ＴａｑＤＮＡ 聚合酶０．５μＬ （５Ｕ／μＬ），２０
ｍｍｏｌ／Ｌ上游引物１μＬ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ下游引物１μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２μＬ，ｃＤＮＡ０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补至２５
μＬ。ＰＣＲ循环参数：９６℃预变性５ｍｉｎ后，９５℃１ｍｉｎ，５３℃１ｍｉｎ、７２℃１．５ｍｉｎ，３５个循环后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
２ 结果与分析
２．１ ＤＲＥＢ１Ａ基因和ｒｄ２９Ａ启动子的克隆
以拟南芥总基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增（引物Ｄ１、Ｄ２），用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，扩增出１
条约７００ｂｐ的条带（图２），其大小与基因ＤＲＥＢ１Ａ的大小相符。将ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体上，然
后导入大肠杆菌筛选出阳性克隆并进行测序分析，将测序结果与 ＧｅｎＢａｎｋ中序列比较，结果其同源性达
９９．６９％。
利用ＰＣＲ克隆技术在拟南芥总基因组中分离ｒｄ２９Ａ启动子，结果显示，扩增出１条约１０００ｂｐ的特异性条
２１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
带（图３），回收特异片段并连接到ｐＧＥＭＴｅａｓｙ中，然后导入大肠杆菌筛选出阳性克隆并进行测序分析。将测
序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的ｒｄ２９Ａ序列比较，结果其同源性达到９９．４７％。整个序列与原序列有个别碱基不同，其
余完全吻合，并且其作为启动子的各个功能原件齐全。
２．２ 中间载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＡＤＲ的构建
２．２．１ 载体ｐＢＩ１２１Ｎ１的构建及检测 用犛犪犮Ⅰ和犅犪犿ＨⅠ酶切植物表达载体ｐＢＩ１２１，回收大片段，将回收的
大片段与ＮＯＳ１ 序列按１∶４混合，加入１０Ｕ的Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌ＤＨ５ａ中，筛
选重组子，并将重组子分别用犎犻狀ｄⅢ／犛狆犲Ⅰ，犎犻狀ｄⅢ／犛犿犪Ⅰ双酶切，分别得到了约１２００和９００ｂｐ的片段（图
４），与预期片段相符，表明ｐＢＩ１２１Ｎ１成功构建。
２．２．２ 载体ｐＢＩ１２１ＤＲ的构建及检测 用犛狆犲Ⅰ和犅犪犿ＨⅠ双酶切ｐＢＩ１２１Ｎ１，回收大片段，将回收的大片段
与ＤＲＥＢ１Ａ基因片段按１∶４混合，加入１０Ｕ的Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌ＤＨ５ａ中，
筛选重组子，将重组子用犅犪犿ＨⅠ／犛狆犲Ⅰ双酶切，以ｐＢＩ１２１ＤＲ质粒ＤＮＡ为模板，以Ｄ１、Ｄ２ 为引物进行扩增，
都得到了约７００ｂｐ的片段（图５），与预期片段相符，表明ｐＢＩ１２１ＤＲ成功构建。
图２ 基因犇犚犈犅１犃的犘犆犚结果
犉犻犵．２ 犌犲狀犲犇犚犈犅１犃犳狉犪犵犿犲狀狋犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔狆狉犻犿犲狉狊犇１，犇２
Ｍ：Ｄ２０００标记 Ｄ２０００ ｍａｒｋｅｒ；１，２：以 Ｄ１、Ｄ２ 为引物扩增的
ＤＲＥＢ１Ａ片段ＦｒａｇｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｏｆＤＲＥＢ１Ａｂｙ
ｐｒｉｍｅｒｓＤ１ａｎｄＤ２．
图３ 狉犱２９犃启动子的犘犆犚结果
犉犻犵．３ 犘狉狅犿狅狋犲狉狉犱２９犃犳狉犪犵犿犲狀狋犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔狆狉犻犿犲狉狊犚１，犚２
Ｍ：Ｄ２０００标记 Ｄ２０００ｍａｒｋｅｒ；１，２：以Ｒ１、Ｒ２ 为引物扩增的ｒｄ２９Ａ
启动子片段Ｆｒａｇｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｏｆｒｄ２９Ａｂｙｐｒｉｍｅｒｓ
Ｒ１ａｎｄＲ２．
图４ 载体狆犅犐１２１犖１酶切分析
犉犻犵．４ 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犅犐１２１犖１
Ｍ：Ｄ２０００标记Ｄ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：犎犻狀ｄⅢ／犛狆犲Ⅰ双酶切２号质粒产
物ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１Ｎ１ｂｙ犎犻狀ｄⅢ／犛狆犲Ⅰ；２：犎犻狀ｄⅢ／犛犿犪
Ⅰ双酶切ｐＢＩ１２１Ｎ１质粒产物ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１Ｎ１ｂｙ犎犻狀ｄ
Ⅲ／犛犿犪Ⅰ．
图５ 载体狆犅犐１２１犇犚鉴定结果
犉犻犵．５ 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犅犐１２１犇犚
Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ标记 ＭａｒｋｅｒⅢ；１：犅犪犿ＨⅠ／犛狆犲Ⅰ双酶切ｐＢＩ１２１ＤＲ
质粒产物 ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１ＤＲｂｙ犅犪犿ＨⅠ／犛狆犲Ⅰ；２：以
ｐＢＩ１２１ＤＲ质粒ＤＮＡ为模板，以Ｄ１、Ｄ２ 为引物的扩增产物 Ｆｒａｇｍｅｎｔ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｏｆｐＢＩ１２１ＤＲｂｙｐｒｉｍｅｒｓＤ１ａｎｄＤ２．
２．２．３ 载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＡＤＲ的构建及检测 用犎犻狀ｄⅢ和犅犪犿ＨⅠ双酶切载体ｐＢＩ１２１ＤＲ，回收大片段，将
回收的大片段与ｒｄ２９Ａ启动子按１∶４混合，加入１０Ｕ的Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌
ＤＨ５ａ中，筛选重组子，将重组子分别用犅犪犿ＨⅠ／犛狆犲Ⅰ、犎犻狀ｄⅢ／犅犪犿ＨⅠ双酶切，并以ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＡＤＲ质粒
ＤＮＡ为模板，以Ｄ１、Ｄ２，Ｒ１、Ｒ２ 为引物进行扩增，都分别得到了约７００和１０００ｂｐ的片段（图６）。
３１１第２３卷第３期 草业学报２０１４年
２．３ 双价植物表达载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ的构建
２．３．１ 载体ｐＢＩ１２１３５ＳＢａｒ的构建及检测 用犈犮狅ＲⅠ和犅犪犿ＨⅠ双酶切植物表达载体ｐＢＩ１２１，回收大片段，
将回收的大片段与用同样酶切ｐＡＨＣ２５回收的小片段按１∶４混合，加入１０Ｕ的Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，并将连
接产物导入大肠杆菌ＤＨ５ａ中，筛选重组子，分别用 犎犻狀ｄⅢ／犈犮狅ＲⅠ，犎犻狀ｄⅢ／犅犪犿ＨⅠ双酶切，分别得到了约
１８００和９００ｂｐ的片段，与预期片段相符（图７），表明ｐＢＩ１２１３５ＳＢａｒ成功构建。
２．３．２ 载体ｐＢＩ１２１３５ＳＮ２的构建及检测 用犈犮狅ＲⅠ和犇狉犪Ⅲ双酶切ｐＢＩ１２１３５ＳＢａｒ，回收大片段，将回收的
大片段与ＮＯＳ２ 序列按１∶４混合，加入１０Ｕ的Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌ＤＨ５ａ中，筛
选重组子，并将重组子用犎犻狀ｄⅢ单酶切，得到了约１７００ｂｐ片段（图８），与预期片段相符，表明ｐＢＩ１２１３５ＳＮ２成
功构建。
２．３．３ 植物表达载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ的构建及检测 用 犎犻狀ｄⅢ单酶切ｐＢＩ１２１３５ＳＮ２，回收小片段３５Ｓ
ＢａｒＮｏｓ，并与用同样酶切ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＡＤＲ所得的载体大片段按１∶４混合，加入１０Ｕ的Ｔ４ＤＮＡ连接酶连
接，并将连接产物导入大肠杆菌ＤＨ５ａ中，筛选重组子，并将重组子用 犎犻狀ｄⅢ单切，得到了约１７００ｂｐ片段（图
９），与预期片段相符，表明ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ成功构建。
２．４ 马铃薯的遗传转化及植株再生
经农杆菌浸染的马铃薯茎段通过共培养、选择培养和生根培养后，ＰＰＴ筛选到无菌抗性苗２２株，抗性苗诱
导过程见图１０。
图６ 载体狆犅犐１２１狉犱２９犇犚鉴定结果
犉犻犵．６ 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犅犐１２１狉犱２９犇犚
Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ标记 ＭａｒｋｅｒⅢ；１，２：分别为犅犪犿ＨⅠ／犛狆犲Ⅰ，犎犻狀ｄⅢ／
犅犪犿ＨⅠ双酶切ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＤＲ质粒产物ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１ｒｄ２９
ＤＲｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｂｙ犅犪犿ＨⅠ／犛狆犲Ⅰａｎｄ犎犻狀ｄⅢ／犅犪犿ＨⅠ；３，４：以ｐＢＩ１２１
ｒｄ２９ＢＤＲ质粒ＤＮＡ为模板，分别以Ｄ１／Ｄ２，Ｒ１／Ｒ２为引物的扩增产物
ＦｒａｇｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅｏｆｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｂｙ
ｐｒｉｍｅｒｓＤ１／Ｄ２ａｎｄＲ１／Ｒ２．
图７ 载体狆犅犐１２１３５犛犅犪狉鉴定结果
犉犻犵．７ 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犅犐１２１３５犛犅犪狉
Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ标记ＭａｒｋｅｒⅢ；１：犎犻狀ｄⅢ／犈犮狅ＲⅠ双酶切ｐＢＩ１２１３５Ｓ
Ｂａｒ质粒产物ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１３５ＳＢａｒｂｙ犎犻狀ｄⅢ／犈犮狅ＲⅠ；２：
犎犻狀ｄⅢ／犅犪犿ＨⅠ双酶切ｐＢＩ１２１３５ＳＢａｒ质粒产物 Ｄｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆ
ｐＢＩ１２１３５ＳＢａｒｂｙ犎犻狀ｄⅢ／犅犪犿ＨⅠ．
图８ 载体狆犅犐１２１３５犛犖２鉴定结果
犉犻犵．８ 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犅犐１２１３５犛犖２
Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ标记 ＭａｒｋｅｒⅢ；１：犎犻狀ｄⅢ单酶切ｐＢＩ１２１３５ＳＮ２质
粒的结果 ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１３５ＳＮ２ｂｙ犎犻狀ｄⅢ．
图９ 载体狆犅犐１２１狉犱２９犅犇犚鉴定结果
犉犻犵．９ 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犅犐１２１狉犱２９犅犇犚
Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ标记 ＭａｒｋｅｒⅢ；１：犎犻狀ｄⅢ单酶切ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ质
粒的结果ＤｉｇｅｓｔｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲｂｙ犎犻狀ｄⅢ．
４１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
图１０ 抗性苗诱导过程
犉犻犵．１０ 犐狀犱狌犮狋犻狅狀狅犳狉犲狊犻狊狋犪狀狋狊犲犲犱犾犻狀犵狊
Ａ：共培养３ｄ的马铃薯茎段Ｐｏｔａｔｏｓｔｅｍｓａｆｔｅｒ３ｄｆｒｏｍｃｏｃｕｌｔｕｒｉｎｇｗｉｔｈ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿；Ｂ：含ＰＰＴ２ｍｇ／Ｌ筛选培养基上的抗性愈伤组织Ｒｅ
ｓｉｓｔａｎｔｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｉｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｓｅｌｅｃｔｅｄｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ２ｍｇ／ＬＰＰＴ；Ｃ：含ＰＰＴ２ｍｇ／Ｌ筛选培养基上的抗性苗Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｅｅｄ
ｌｉｎｇｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｏｎｓｅｌｅｃｔｅｄｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ２ｍｇ／ＬＰＰＴ；Ｄ：含ＰＰＴ２ｍｇ／Ｌ生根培养基上的抗性苗Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｏｎｒｏｏｔｍｅｄｉｕｍ
ｗｉｔｈ２ｍｇ／ＬＰＰＴ．
２．５ 转基因马铃薯植株的ＰＣＲ检测
图１１ 以犇１／犇２ 为引物的转基因马铃薯的犘犆犚检测
犉犻犵．１１ 犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆狅狋犪狋狅狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狀狋
Ｍ：Ｄ２０００标记 ＭａｒｋｅｒⅢ；１：空白对照 ＡｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＤ１／Ｄ２ｏｆＨ２Ｏ；
２：阴性对照 Ｐｏｔａｔｏｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ；３：阳性对照（ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ）
Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ）；４～８：转化植株以Ｄ１／Ｄ２ 为引物扩
增结果ＡｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＤ１／Ｄ２ｏｆｐｏｔａｔｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ．
图１２ 转犇犚犈犅１犃基因植株的犚犜－犘犆犚检测
犉犻犵．１２ 犚犜－犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆狅狋犪狋狅狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狀狋
１：非转基因植株 Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；２～４：转基因植株 Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ．
以转录因子ＤＲＥＢ１Ａ基因的特异引物为引物进
行ＰＣＲ检测，结果阳性对照（质粒ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ）
和１８株抗性苗扩增出约７００ｂｐ的片段，而空白对照、
阴性对照（未转化马铃薯）和部分转化植株无扩增条带
（图１１为部分转化植株的检测结果）。图１１可以看
出，以转化植株４，５，６和８号的基因组ＤＮＡ为模板
扩增出了目的基因条带，而７号没有目的条带出现，说
明４，５，６和８号植株的基因组中有ＤＲＥＢ１Ａ基因的
整合，为转基因植株，而７号没有目的基因的整合，为
非转基因植株。
２．６ ＲＴＰＣＲ检测
对部分ＰＣＲ阳性植株进行ＲＴ－ＰＣＲ分析，以未
转化的陇薯１０号马铃薯为对照，以马铃薯犪犮狋犻狀基因
为内参，检测在３０％ＰＥＧ胁迫３ｄ后，ＤＲＥＢ１Ａ基因
在转基因植株中的表达情况（图１２所示为部分结果），
图１２可以看出基因ＤＲＥＢ１Ａ在转基因植株中得到了
表达，而在非转基因对照中并没有表达。进一步说明
ＤＲＥＢ１Ａ基因已经整合到陇薯１０号马铃薯基因组中并能够在转基因植株中转录表达。
３ 讨论
植物的耐旱性是复杂的生理适应，它不是单一基因控制的，通过单基因改良的方式很难奏效［７８］，与以往转单
个抗旱基因的思路不同，本研究从与抗旱相关的转录因子ＤＲＥＢ１Ａ入手构建植物表达载体。
目的基因表达的时间、空间和强度，在很大程度上是由启动子决定的［２６２８］。目前，马铃薯的遗传转化中，绝大
多数用ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动目的基因的表达［２６２７］，但大部分结果并不尽如人意。本研究用诱导型启动子ｒｄ２９Ａ
取代ＣａＭＶ３５Ｓ组成型强启动子，将会使外源基因在植物细胞缺水时大量表达，细胞不缺水时并不表达，这样既
可以满足植物分子育种的需要，又可以减少ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动目的基因在所有组织和所有发育阶段表达造
成的植株代谢负担，避免物质和能量的巨大浪费。
以往植物基因转化中一般采用抗生素作为筛选标记系统［２６２９］。由于转化细胞对抗生素的解毒作用导致的交
５１１第２３卷第３期 草业学报２０１４年
叉保护，高频率的未转化植株和嵌合体也通过了抗生素筛选，细胞产生的假转化体多，无疑增加了工作量。本研
究以Ｂａｒ基因替换了抗生素抗性基因，不但克服了抗生素筛选的局限性，而且使转基因马铃薯获得了对除草剂的
抗性，使用与抗除草剂基因相配的除草剂，能有效除去杂草，不仅有望解决大田的草荒问题，也可节省大量劳动
力。
从实验的结果分析来看，本研究克隆的ｒｄ２９Ａ启动子各个功能原件齐全，ＤＲＥＢ１Ａ基因与已注册的序列
（ｇｅｎｅｂａｎｋＩＤ：ＡＢ００７７８７）基本一致，构建的双价植物表达载体ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ理论上符合基因表达的要求，
可用于农杆菌介导ＤＲＥＢ１Ａ基因在植物中的诱导型表达。农杆菌介导法转化马铃薯的研究中，除草剂ＰＰＴ筛
选到了农艺性状良好的转基因植株，ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证明ＤＲＥＢ１Ａ基因已整合到陇薯１０号马铃薯基因组
中，并在转基因植株中转录表达，有望提高转基因马铃薯的抗旱性。目前，作者正在进行转基因马铃薯的抗旱性
分析研究。
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ｌｅｖｅｌｓｏｆｆｏｒｍａｔｅａｎｄａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｒａｌｉｎｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，
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犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犪犫犻狏犪犾犲狀狋狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狅犳犇犚犈犅１犃犪狀犱犅犪狉犵犲狀犲狊
犪狀犱狊狋狌犱犻犲狊狅犳犵犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳狆狅狋犪狋狅
ＪＩＡＸｉａｏｘｉａ１，ＱＩＥｎｆａｎｇ１，ＷＡＮＧＹｉｈａｎｇ１，ＷＥＮＧｕｏｈｏｎｇ１，ＧＯＮＧＣｈｅｎｇｗｅｎ１，
ＷＡＮＧＨｏｎｇｍｅｉ２，ＬＩＪｉａｎｗｕ１，ＭＡＳｈｅｎｇ１，ＨＵＸｉｎｙｕａｎ１
（１．ＰｏｔａｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＧａｎｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＧａｎｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｐｏｔａｔｏｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｈａｓｂｅｅｎｅｘｔｒｅｍｅｌｙａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ．Ｉｔｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｉｍ
ｐｒｏｖｅｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｐｏｔａｔｏｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｙｉｅｌｄｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｏｉｍｐｒｏｖｅｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆ
ｐｏｔａｔｏ，ｔｈｅｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＤＲＥＢＩＡｇｅｎｅａｎｄｒｄ２９Ａｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ犃狉犪犫犻
犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪ｂｙＰＣＲ．ＵｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅｂｉｖａｌｅｎｔｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１
ｒｄ２９ＢＤＲ，ｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｓｔｗｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｓ，ｒｄ２９ＡＤＲＥＢ１ＡＮＯＳａｎｄＣａＭＶ３５ＳＢａｒＮＯＳ，ｗａｓｓｕｃ
ｃｅｓｓｆｕｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｐｏｔａｔｏｓｔｅｍｓｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｅｘｃｉｓｅｄｓｔｅｍｓ（０．５－１．０ｃｍ）ｗｅｒｅｉｎ
ｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ＬＢＡ４４０４／ｐＢＩ１２１ｒｄ２９ＢＤＲ（ＯＤ６００＝０．５－０．８）ａｎｄｇｒｏｗｎｏｎａｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｍｅ
ｄｉｕｍｆｏｒ３ｄａｙｓｉｎｄａｒｋｎｅｓｓ，ｔｈｅｎｐｌａｃｅｄｏｎｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｐｌａｔｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ２ｍｇ／ＬＰＰＴａｎｄ２００
ｍｇ／Ｌｃｅｆｏｔａｘｉｍｅｆｏｒｃａｌｕｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｗｅｎｔｙｔｗｏｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＴｈｅＰＣＲａｎｄＲＴ－ＰＣＲ
ｔｅｓｔｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＤＲＥＢ１ＡｗａｓｎｏｔｏｎｌｙｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｔｈｅｐｏｔａｔｏＬｏｎｇｓｈｕ１０，ｂｕｔｗａｓａｌｓｏ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．Ｔｏｖｅｒｉｆｙｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｏｔａｔｏ，ａｎａｌｙｓｅｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ＤＲＥＢ１Ａｇｅｎｅ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ；ｒｄ２９Ａｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｐｏｔａｔｏ
７１１第２３卷第３期 草业学报２０１４年