全 文 :书犖犪犆犾胁迫对芨芨草苗期脯氨酸代谢的影响
董秋丽,夏方山,董宽虎
(山西农业大学动物科技学院,山西 太谷030801)
摘要:以芨芨草为试验材料,在不同浓度NaCl胁迫下,对芨芨草叶片与根系脯氨酸(proline,Pro)、鸟氨酸δ氨基转
移酶(ornithineoxoacidtransaminase,δOAT)、吡咯啉5羧酸合成酶(pyrroline5carboxylatesynthetase,P5CS)、
脯氨酸脱氢酶(prolinedehydragenase,ProDH)进行测定。结果表明,NaCl胁迫下,芨芨草Pro的积累主要以谷氨
酸途径为主;随NaCl浓度的增加,芨芨草叶片和根系Pro含量逐渐增加,500mmol/LNaCl时达最大,分别为
585.77和303.36μg/gFW;δOAT活性呈降低趋势,均显著低于对照(犘<0.05);在同一浓度胁迫下,芨芨草根系
P5CS活性均显著高于叶片(犘<0.05),300mmol/LNaCl时,芨芨草叶片与根系P5CS活性均达到最大,分别为
7.44和20.81U/mg蛋白;叶片ProDH活性高于对照,最大为对照的1.7倍,根系ProDH活性变化不明显。
关键词:芨芨草;脯氨酸;鸟氨酸δ氨基转移酶;吡咯啉5羧酸合成酶;脯氨酸脱氢酶
中图分类号:S543+.903.4;Q945.78 文献标识码:A 文章编号:10045759(2010)05007106
土壤盐渍化是人类面临的世界性问题,全球约有100多个国家存在不同类型盐碱地,占陆地面积的10%左
右[1],其引起的渗透胁迫已对植物的生长和产量造成了很大的影响。在渗透胁迫下,植物能否保持正常生长状
况,关键在于能否维持体内的水分平衡,而这正是通过积累一定量的溶质,降低植物体内的水势实现的[2]。脯氨
酸是公认的在细胞中起着无毒渗透保护作用的细胞相溶性物质,它被广泛的积累在各器官中,Pro的积累受多种
因素的调控,如:它自身的合成、分解,用于蛋白质的合成及在不同器官中的运输[3]。植物的Pro合成、累积及代
谢是一个受非生物胁迫和细胞内Pro浓度调控的生理生化过程[4,5]。已证明植物体内存在2条Pro合成途径,根
据起始氨基酸命名为Glu途径和Orn途径,P5CS和δOAT分别是这2个途径的关键酶。支立峰等[6]用飞蛾豆
(犞犻犵狀犪犪犮狅狀犻狋犻犳狅犾犻犪)中的P5CS基因转化水稻(犗狉狔狕犪犵犾犪犫犲狉狉犻犿犪),再用250mmol/LNaCl胁迫处理后,转基因
细胞的Pro含量提高,同时转基因细胞的耐盐性比野生型增强。陈吉宝等[7]发现胁迫下普通菜豆幼苗叶和根中
脯氨酸合成酶基因PvP5CS2的转录水平快速上升,随着胁迫时间的延长,转录水平逐渐下降;在逆境胁迫下,幼
苗叶和根中Pro大量积累,高峰出现在PvP5CS2基因表达高峰之后。徐春波等[8]将P5CS去除反馈抑制的突变
型P5CS-F129A基因转入冰草(犃犵狉狅狆狔狉狅狀)导致植物体中Pro含量成倍增加。这些结果均说明,PvP5CS2基
因的表达受干旱、高盐和冷胁迫诱导,Pro积累受PvP5CS2基因转录水平的调控。Roosens等[9]发现转δOAT
基因烟草合成的Pro在无胁迫时比对照高3倍,且组成型超表达δOAT基因并没有影响植物在正常条件下的生
长;在0.2mol/LNaCl或等渗的甘露醇胁迫下,转基因株系积累的Pro比对照高1.5倍,而且有更高的生物量和
萌发率。有研究表明,不同植物、不同组织、不同生理条件下2条途径对Pro积累的贡献大小存在差异[10]。Pro
合成过程中究竟是哪一条途径居于主导地位,还有待进一步研究。
芨芨草(犃犮犺狀犪狋犺犲狉狌犿狊狆犾犲狀犱犲狀狊)属禾本科芨芨草属旱中生多年草本植物,也是一种泌盐植物,具有很强的
抗盐碱性[11,12]。目前,对于芨芨草耐盐性的研究很少[12,13],多见于种植芨芨草生态经济效益方面的研究。而通
过生物措施进行盐碱地改良是经济长久的方法,牧草在盐碱地改良利用中具有重要作用和利用前景[14]。因此,
研究芨芨草盐胁迫下的生理变化及耐盐性机理,对于改良盐碱草地具有重要的实践意义。对其苗期盐胁迫下
Pro代谢途径进行研究,明确在盐胁迫下芨芨草的Pro代谢途径及在不同器官中的运输,以期为盐碱地植被恢复
与改良提供科学依据。
第19卷 第5期
Vol.19,No.5
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA
71-76
2010年10月
收稿日期:20100118;改回日期:20100210
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划课题(2007BAD56B01)资助。
作者简介:董秋丽(1985),女,山西阳泉人,在读硕士。Email:d394875786@126.com
通讯作者。Email:dongkuanhu@126.com
1 材料与方法
1.1 供试草种及来源
试验用芨芨草种子于2008年10月13日采自山西省偏关县天峰坪镇梨园村的农田地埂,海拔1018m,111°
22′19.1″E,39°27′56.8″N。
1.2 试验方法
本试验在山西农业大学草业科学系日光能温室进行。将种子(100粒/盆)播种于蛭石与珍珠岩体积比为
1∶1的塑料盆中(直径25cm、高20cm),插入PVC管以便浇水及营养液,置于昼夜温度为25/17℃,相对湿度为
65%~80%的温室条件下进行培养。出苗后,每隔2d用Hoagland营养液浇灌1次,处理于17:00-20:00时进
行。其余时间用蒸馏水补充失水,以称重法确定失水量,当苗龄达2~3周时每盆定苗60株。当出苗7周后对其
进行盐分胁迫,以0(CK),100,200,300,400和500mmol/LNaCl6个浓度的营养液为处理液,隔天按100
mmol/L梯度进行递增,直至达到指定浓度,对照只灌完全营养液,3次重复,采用随机区组设计。每组盐胁迫1
周后,分别采集其叶片和根系,置于-80℃冰箱保存,进行相关指标的测定。
1.3 测定方法
1.3.1 Pro含量的测定 按照Bates等[15]的方法。
1.3.2 P5CS的测定 P5CS的抽提方法按照KaviKishor等[16]的方法进行。蛋白含量以牛血清蛋白为标准蛋
白质,按照Bradford[17]的方法。P5CS活性测定按照GarciaRios等[18]的方法进行。
1.3.3 δOAT活性的测定 粗酶提取按照Roosens等[19]的方法进行,蛋白含量以牛血清蛋白为标准蛋白质,
参照Bradford[17]的方法。
δOAT活性的测定参照Kim等[20]的方法,略做改动。反应体系为:50mmol/L的磷酸缓冲液、35mmol/L
L鸟氨酸、5mmol/Lα酮戊二酸和0.05mmol/L磷酸吡哆醛混合,总体积为0.9mL,再加入0.1mL酶液,在
25℃条件下反应20min后加入0.3mL3mol/L的高氯酸终止反应,然后加入0.2mL2%茚三酮沸水中加热20
min染色,冷却后10000r/min离心弃去上清液;用1.5mL无水乙醇溶解红色沉淀物,离心后取上清液510nm
测定吸光值。产物吡咯啉5羧酸(P5C)与茚三酮生成的红色物质摩尔消光系数为16.5L/(mmol·cm)。以每
min生成0.001mmolP5C的量为1个δOAT活性单位(U)。
1.3.4 ProDH的测定 参照Lutts等[21]方法提取,略做改动。样品加4倍体积提取缓冲液(w/v)于冰浴中研
磨,提取缓冲液为0.1mol/LNa2HPO4-KH2PO4(pH7.8),内含1mmol/LEDTA,10mmol/L巯基乙醇。匀
浆液经3层纱布过滤后3898r/min离心15min。上清液加TritonX100至终浓度0.15%,涡悬后于冰浴中放置
30min,后于19491r/min离心20min,上清液测酶活性。
活性测定反应混合液体积为2.5mL,内含0.15mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH10.3)缓冲液1.6mL,0.2
mL0.1mol/LLPro,0.2mL0.9mmol/L2,6二氯酚靛酚。30℃水浴中保温5min,加入0.5mL(0.8mg蛋
白/mL)酶提取液,混合均匀后加入0.2mL吩嗪硫酸甲酯试剂PMS(9mg/mL,现配),摇匀后立即于600nm下
检测光密度变化。以每minA600减少0.001为1个ProDH酶活单位(U)。
1.4 统计分析
试验数据采用Excel2003及SAS8.0统计软件进行分析处理。
2 结果与分析
2.1 NaCl胁迫对芨芨草Pro含量的影响
随着NaCl浓度的增加,芨芨草植株根系与叶片中Pro的含量均呈上升趋势(表1),且均显著高于对照(犘<
0.05);在同一浓度胁迫下,芨芨草叶片中Pro的含量均显著高于根系(犘<0.05),为根系的1.93~7.92倍;当
NaCl浓度为500mmol/L时,芨芨草植株根系与叶片中Pro含量均达到最大值,为303.36和585.77μg/gFW
(鲜重),分别是对照的74和18倍。随着NaCl浓度的增加,芨芨草根系中Pro含量上升的幅度大于叶片。芨芨
草植株根系与叶片中Pro含量的急剧上升,说明芨芨草对NaCl胁迫的适应能力较强。
27 ACTAPRATACULTURAESINICA(2010) Vol.19,No.5
表1 犖犪犆犾胁迫下芨芨草根系与叶片犘狉狅含量的变化
犜犪犫犾犲1 犆犺犪狀犵犲狊狅犳狆狉狅犾犻狀犲犮狅狀狋犲狀狋犻狀犃.狊狆犾犲狀犱犲狀狊狌狀犱犲狉犖犪犆犾狊狋狉犲狊狊 μg/gFW
部位Part
NaCl浓度 NaClconcentration(mmol/L)
0(CK) 100 200 300 400 500
叶片Leaves 32.31±0.32Fa 65.53±2.50Ea 151.84±5.11Da 195.96±1.51Ca 357.13±0.57Ba 585.77±2.01Aa
根系Roots 4.08±0.16Fb 22.78±1.04Eb 27.36±0.51Db 62.90±1.91Cb 134.05±3.16Bb 303.36±1.50Ab
注:同行不同大写字母表示差异显著(犘<0.05);同列不同小写字母表示差异显著(犘<0.05)。
Note:Meansinthesamerowwithdifferentcapitallettersaresignificantdifferent(犘<0.05),inthesamecolumnwithdifferentsmallettersare
significantlydifferent(犘<0.05).
2.2 NaCl胁迫对P5CS活性的影响
图1 犖犪犆犾胁迫下芨芨草根系与叶片犘5犆犛活性的变化
犉犻犵.1 犆犺犪狀犵犲狊狅犳犘5犆犛犻狀犃.狊狆犾犲狀犱犲狀狊狌狀犱犲狉犖犪犆犾狊狋狉犲狊狊
不同大写字母表示不同NaCl浓度差异显著(犘<0.05);不同小写字母
表示同一浓度下,叶片与根系间差异显著(犘<0.05)。下同Barswithdif
ferentcapitallettersaresignificantlydifferentamongdifferentNaClcon
centration(犘<0.05);Thesmallettersaresignificantlydifferentamong
leavesandrootsunderthesameconcentration(犘<0.05).Thesamebelow
除200mmol/LNaCl浓度胁迫时,芨芨草根系
与叶片P5CS活性差异不显著外(犘>0.05),其他浓
度胁迫下,芨芨草根系中的P5CS活性均显著高于
叶片(犘<0.05)。在不同浓度NaCl胁迫下,除200
mmol/L浓度胁迫时,芨芨草根系中的P5CS活性
与对照差异不显著外(犘>0.05),其余浓度胁迫下,
芨芨草根系中 P5CS活性均显著高于对照(犘<
0.05);NaCl浓度为300mmol/L时,芨芨草叶片中
P5CS活性显著高于对照外(犘<0.05),其他浓度胁
迫下,芨芨草叶片中P5CS活性均显著低于对照(犘
<0.05)。当NaCl浓度为300mmol/L时,芨芨草
叶片与根系中P5CS活性均达到最大值,为7.44和
20.81U/mg蛋白,分别为对照的1.1和6.3倍。
在NaCl的胁迫下,随着盐浓度的增加,芨芨草叶片
P5CS的活性呈“降-升-降”的趋势(图1)。
2.3 NaCl胁迫对δOAT活性的影响
在NaCl胁迫下,芨芨草根系中的δOAT活性显著高于叶片中的(犘<0.05);芨芨草叶片与根系中的δ
OAT活性均显著低于对照(犘<0.05),但在不同浓度的NaCl胁迫下,δOAT活性的变化幅度不大。随着盐浓
度的增加,叶片与根系中的δOAT活性均呈先下降后上升的趋势。当NaCl浓度为300和400mmol/L时,芨芨
草根系与叶片中的δOAT活性降至最低,较对照分别降低45.87%和72.24%(图2)。这说明NaCl胁迫下,芨
芨草中δOAT活性受到抑制,所以Pro含量的急剧上升可能不是通过鸟氨酸途径合成的。
2.4 NaCl胁迫对ProDH活性的影响
在NaCl胁迫下,芨芨草叶片中ProDH酶的活性均显著高于根系中的(犘<0.05),且均显著高于对照(犘<
0.05)。随着NaCl浓度的增加,芨芨草叶片中ProDH 的活性呈先上升后下降的趋势,当 NaCl浓度为200
mmol/L时,ProDH活性达到最大值,为66.04U/gFW,是对照的1.7倍。芨芨草根系中的ProDH 活性随着
NaCl浓度的增加变化不明显,在浓度为100mmol/L时,芨芨草根系中ProDH 的活性上升到最大值为30.47
U/gFW,且显著高于对照外(犘<0.05),其他浓度胁迫下,均差异不显著(犘>0.05)。当 NaCl浓度为300
mmol/L时,芨芨草根系中ProDH活性最小,为21.95U/gFW,是对照的86.30%(图3)。
3 讨论
3.1 NaCl胁迫对芨芨草植株不同器官Pro含量的影响
在盐胁迫下,Pro是公认的渗透保护剂,各组织中游离Pro含量的多少,直接关系到其抗逆性的强弱。Pro能
37第19卷第5期 草业学报2010年
图2 犖犪犆犾胁迫下芨芨草根系与叶片δ犗犃犜活性的变化
犉犻犵.2 犆犺犪狀犵犲狊狅犳δ犗犃犜犻狀犃.狊狆犾犲狀犱犲狀狊狌狀犱犲狉犖犪犆犾狊狋狉犲狊狊
图3 犖犪犆犾胁迫下芨芨草根系与叶片犘狉狅犇犎活性的变化
犉犻犵.3 犆犺犪狀犵犲狊狅犳犘狉狅犇犎犻狀犃.狊狆犾犲狀犱犲狀狊狌狀犱犲狉犖犪犆犾狊狋狉犲狊狊
防止水分散失,保护膜结构的完整性,所以细胞内Pro的升高可作为植物抗性的指标[22]。近年来对盐胁迫下植
物的生理代谢调节方面的研究表明,在盐胁迫的条件下胞质内产生大量的渗透调节物质,在正常生长条件下,植
物体内的游离Pro含量较低,但在盐碱胁迫下,游离Pro的含量明显增加[23]。陈托兄等[24]也指出:抗盐植物中游
离Pro多集中于代谢旺盛的光合器官和生殖器官,其Pro的含量是其他部位的数倍到数十倍,在盐逆境下植物优
先保护其光合器官和生殖器官,这是植物对盐渍生境的一种生态适应对策。张金林等[25]研究表明:NaCl胁迫
下,湖南稷子(犈犮犺犻狀狅犮犺犾狅犪犮狉狌狊犵犪犾犾犻)地上部的游离Pro是根中的10倍多。吴欣明等[26]研究表明:随NaCl浓度
的升高,7份羊茅属(犉犲狊狋狌犮犪)植物叶绿素和光合速率呈递减趋势,Pro呈增高趋势。孟林等[27]同样证实了NaCl
胁迫下,34份偃麦草属(犈犾狔狋狉犻犵犻犪)植物种质材料叶片的Pro随胁迫浓度的增加而呈递增趋势,这与本试验研究
结果一致(表1)。芨芨草叶片中的Pro含量显著高于根系中的,可能是由于在盐逆境下植物为优先保护其光合
器官和生殖器官,将根系中合成的Pro运输到叶片。这与全先庆等[28]得出的Pro大多在植物的根中合成,而产
物大部分被运输到地上部分的研究结果一致。造成芨芨草植株地上部Pro积累的原因还可能与植株地上部光呼
吸乙醇酸途径的激活和Glu脱氢酶的活化相关[15],还有待进一步的研究。Pro含量的大量增加,提高了缓解渗
透胁迫的能力,从而增强了芨芨草植株在NaCl胁迫下的抗逆性。
3.2 NaCl胁迫对芨芨草植株脯氨酸代谢途径的影响
根尖部位是感知胁迫最敏感部位,植株受到的胁迫往往最先由根部感知,在此状况下,其生理反应可能与叶
片的生理反应不尽相同[4]。在 NaCl胁迫下,除根系P5CS的活性显著高于对照外(犘<0.05),芨芨草叶片中
P5CS的活性、根系与叶片δOAT的活性均显著低于对照(犘<0.05)。由此可见,芨芨草Pro的积累主要在根系
中以谷氨酸途径合成。研究表明,在渗透胁迫和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位,而在非胁迫条件及高氮条件
下鸟氨酸又居于主导地位[29]。黄诚梅等[30]的研究也表明,渗透胁迫下,甘蔗(犛犪犮犮犺犪狉狌犿狅犳犳犻犮犻狀犪狉狌犿)幼苗叶
片Pro生物合成以谷氨酸-Pro途径为主。这与本试验结论相一致。当NaCl的浓度高于300mmol/L时,叶片
P5CS的活性开始下降,可能是由于Pro浓度的大量增加,其活性受到Pro含量的反馈抑制[31]。ProDH 是植物
体内控制Pro降解的关键酶,在渗透胁迫时其表达活性受到抑制[30]。在NaCl胁迫下,芨芨草叶片中的ProDH
的活性显著高于根系(犘<0.05),主要是由于ProDH 基因被Pro诱导而被渗透胁迫抑制[2]。可见,芨芨草Pro
含量的积累是由合成和降解综合作用的结果。
4 结论
NaCl胁迫下,芨芨草植株叶片的Pro含量显著高于根系,芨芨草Pro含量随NaCl胁迫浓度的增加而增加,
当NaCl浓度达500mmol/L时,Pro含量最大。
芨芨草植株根系P5CS活性显著高于对照,在同一浓度胁迫下,根系活性均高于叶片;随着 NaCl浓度的增
加,δOAT活性呈降低趋势,均显著低于对照;叶片ProDH活性高于对照,而根系ProDH活性较对照变化不太
47 ACTAPRATACULTURAESINICA(2010) Vol.19,No.5
明显。
NaCl胁迫下,芨芨草植株内Pro的积累主要以谷氨酸途径为主。
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57第19卷第5期 草业学报2010年
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犈犳犳犲犮狋狊狅犳犖犪犆犾狊狋狉犲狊狊狅狀狆狉狅犾犻狀犲犿犲狋犪犫狅犾犻狊犿狅犳犃犮犺狀犪狋犺犲狉狌犿狊狆犾犲狀犱犲狀狊狊犲犲犱犾犻狀犵
DONGQiuli,XIAFangshan,DONGKuanhu
(ColegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:UndervaryinglevelsofNaClstress,theproline(Pro),pyrroline5carboxylatesynthetase(P5CS),
ornithineoxoacidtransaminase(δOAT),andprolinedehydragenase(ProDH)amongleavesandrootsof犃犮犺
狀犪狋犺犲狉狌犿狊狆犾犲狀犱犲狀狊weredetermined.Theresultsshowedthattheprolinemetabolismsynthesispathwayof
the犃.狊狆犾犲狀犱犲狀狊seedlingismainlyonthepathwayofGlutamate.Theprolinecontentincreasedwiththein
creaseofNaCl,andtheprolinecontentinleavesandinrootswerethehighestthatcouldbeupto585.77and
303.36μg/gFWrespectivelyattheconcentrationof500mmol/LNaCl.TheactivityofδOATwassignificant
lylowerthanthatincontrol(犘<0.05),anddeclinedwiththeincreasingoftheNaClconcentration.Theactivi
tyofP5CSfromtherootsof犃犮犺狀犪狋犺犲狉狌犿狊狆犾犲狀犱犲狀狊wassignificantlyhigherthanleavesunderthesamecon
centration(犘<0.05).Attheconcentrationof300mmol/LNaCl,theP5CSactivityinleavesandrootsreached
the7.44and20.81U/mgProteinrespectively.TheactivityofProDHinleaveswerehigherthanincontrol,
andcouldbeupto1.7timesthanthecontrol,butdidn'tchangesignificantlyinroots.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犃犮犺狀犪狋犺犲狉狌犿狊狆犾犲狀犱犲狀狊;proline(Pro);ornithineoxoacidtransaminase(δOAT);pyrroline5car
boxylatesynthetase(P5CS);prolinedehydragenase(ProDH)
67 ACTAPRATACULTURAESINICA(2010) Vol.19,No.5