全 文 ：书沉默犆犆犚和犆犃犇 基因培育低木质素
含量转基因多年生黑麦草
胡可１，２，严雪锋１，２，栗丹１，唐晓梅１，２，杨宏１，王艳１，邓洪渊１，马欣荣１
（１．中国科学院成都生物研究所，四川 成都６１００４１；２．中国科学院研究生院，北京１０００４９）
摘要：木质素作为维管植物的重要成分之一，主要存在于细胞的次生壁中。然而，木质素却是许多工农业加工过程
的限制因素，例如在化学制浆、牧草消化以及木质纤维转化为生物酒精等过程中。肉桂酰辅酶 Ａ还原酶（ＣＣＲ）和
肉桂醇脱氢酶（ＣＡＤ）是催化木质素单体生物合成最后两步的关键酶。本研究根据ＮＣＢＩ中黑麦草犆犆犚和犆犃犇 基
因序列设计特异引物并添加相应酶切位点，从野生型多年生黑麦草ｃＤＮＡ分离克隆犆犆犚和犆犃犇 基因片段，分别
构建了含正反方向目的片段的植物表达干扰载体ｐ２３ｉＣＣＲ和ｐ２３ｉＣＡＤ。通过根癌农杆菌ＥＨＡ１０５介导转入多
年生黑麦草胚性愈伤组织，经过巴龙霉素筛选和ＰＣＲ检测获得导入了干扰犆犆犚和犆犃犇 基因片段的转基因株系
ｉＣＣＲ和ｉＣＡＤ。常规方法测定相对木质素含量，结果显示，与对照相比，有９株ｉＣＣＲ植株和１１株ｉＣＡＤ植株木
质素含量显著降低，分别平均降低了３４．６７％，３３．８６％，且生长正常。本研究表明通过干扰犆犆犚和犆犃犇 基因表
达，可以获得低木质素含量的多年生黑麦草，为进一步培育易消化吸收的黑麦草提供了良好的种质资源。
关键词：木质素；肉桂酰辅酶Ａ还原酶；肉桂醇脱氢酶；多年生黑麦草；ＲＮＡｉ；遗传转化
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４６＋．６０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０５００７２１２
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０５０９　　
　　木质素是一种复杂的芳香族化合物多聚体，主要存在于植物细胞的次生壁，与纤维素和半纤维素共价结合，
赋予细胞壁强度和硬度，为植物组织提供机械支持，使得植株向上生长。木质素还使植物的脉管组织具有疏水
性，便于水分和营养物质的长距离运输［１］，还能保护植株避免病原体入侵［２］。在大多数被子植物中，木质素主要
由愈创木基木质素（Ｇｌｉｇｎｉｎ）和紫丁香基木质素（Ｓｌｉｇｎｉｎ）这两种木质素单体亚单位构成，它们分别来自松柏醇
和芥子醇，第三种木质素单体亚单位对羟基苯基木质素（Ｈｌｉｇｎｉｎ）来自香豆醇，它在单子叶植物中相对较多，而
在双子叶植物中较少［１］。图１为木质素合成途径［３，４］。
木质素作为维管束植物细胞壁的主要成分，长期以来被认为不利于饲料品质、造纸和纤维素燃料的生产［５］。
例如，在制浆造纸工业中，需通过严格的化学工艺从木材中去除木质素以获得纯的纤维素纤维［６］。在草料消化和
生产乙醇时木质素也是主要的限制因子［７］。因此，低木质素含量的牧草或者木材的培育，是育种的方向之一。如
今大部分研究主要是通过基因工程手段降低植株的木质素含量或者改变其组成。
木质素单体作为组成木质素的亚单位，产生于苯丙氨酸途径的一个分支（图１）［３，４］，肉桂酰辅酶 Ａ还原酶
（ｃｉｎｎａｍｏｙｌＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＣＣＲ）和肉桂醇脱氢酶（ｃｉｎｎａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＣＡＤ）是催化木质素单体生
物合成最后两步的关键酶。许多研究通过在不同植物中抑制这两种酶的表达降低了木质素含量或是改变了木质
素的组成［１］。
ＣＣＲ是木质素特异途径的关键酶之一，在木质素的生物合成中起着重要作用，它以５种羟基肉桂酸的ＣｏＡ
酯（对香豆酰辅酶Ａ、咖啡酰辅酶Ａ、阿魏酰辅酶Ａ、５羟基阿魏酰辅酶Ａ和芥子酰辅酶Ａ）作为底物催化生成相
应的肉桂醛。犆犆犚１基因表达受影响的拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）突变体，木质素含量降低的同时表现出外
形矮小、衰老延缓的性状［８］。犆犆犚 下调的转基因杨树（犘狅狆狌犾狌狊狋狉犲犿狌犾犪×犘狅狆狌犾狌狊犪犾犫犪）木质素含量可降低
７２－８３
２０１３年１０月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２２卷　第５期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
收稿日期：２０１２０５０７；改回日期：２０１２０６０６
基金项目：国家８６３计划项目（２００９ＡＡ１０Ｚ１０８，２００８ＡＡ１０Ｚ４０９）和国家自然科学基金项目（３０１７０５８９）资助。
作者简介：胡可（１９８６），男，四川江油人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｄｊｙｄｊｙ＿１２２＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｍａｘｒ＠ｃｉｂ．ａｃ．ｃｎ
图１　苯丙烷和木质素单体生物合成途径，重点显示了木质素单体的合成途径［３，４］
犉犻犵．１　犘犺犲狀狔犾狆狉狅狆犪狀狅犻犱犪狀犱犿狅狀狅犾犻犵狀狅犾犫犻狅狊狔狀狋犺犲狋犻犮狆犪狋犺狑犪狔狊犿犪犻狀犾狔狊犺狅狑犻狀犵犫犻狅狊狔狀狋犺犲狊犻狊狆犪狋犺狑犪狔狊狅犳犿狅狀狅犾犻犵狀狅犾狊
　ＰＡＬ：苯丙氨酸解氨酶Ｐｈｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅ；Ｃ４Ｈ：肉桂酸４羟化酶 Ｃｉｎｎａｍａｔｅ４ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；４ＣＬ：４羟基肉桂酰辅酶 Ａ连接酶４ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎ
ｎａｍｏｙｌＣｏＡｌｉｇａｓｅ；Ｃ３Ｈ：对香豆酸３羟化酶狆ｃｏｕｍａｒａｔｅ３ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；ＣＯＭＴ：咖啡酸／５羟基阿魏酸Ｏ甲基转移酶 Ｃａｆｆｅｉｃ／５ｈｙｄｒｏｘｙｆｅｒｕｌｉｃ
ａｃｉｄＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｆ５Ｈ：阿魏酸５羟化酶Ｆｅｒｕｌａｔｅ５ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；ＨＣＴ：羟基肉桂酸转移酶 Ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＣＣｏＡＯＭＴ：咖
啡酰辅酶Ａ甲基转移酶ＣａｆｆｅｏｙｌＣｏＡＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＣＣＲ：肉桂酰ＣｏＡ还原酶 ＣｉｎｎａｍｏｙｌＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＣＡＤ：肉桂醇脱氢酶 Ｃｉｎｎａｍｙｌ
ａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＳＡＤ：芥子醇脱氢酶Ｓｉｎａｐｙｌａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．芦丁７糖苷：Ｒｕｔｉｎ７ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ；芦丁：Ｒｕｔｉｎ；山奈酚二糖苷阿魏酸：
Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌｄｉｇｌｙｃｏｓｉｄｅｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ；山奈酚二糖苷丙二酸酯：Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌｄｉｇｌｙｃｏｓｉｄｅｍａｌｏｎａｔｅ；山奈酚Ｏ糖苷：ＫａｅｍｐｆｅｒｏｌＯｇｌｙｃｏｓｉｄｅ；黄酮类化
合物：Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ；苯丙氨酸：Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；肉桂酸：Ｃｉｎｎａｍｉｃａｃｉｄ；对香豆酸：ｐｃｏｕｍａｒｉｃａｃｉｄ；咖啡酸：Ｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄ；阿魏酸：Ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ；５羟基
阿魏酸：５Ｈｙｄｒｏｘｙｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ；芥子酸：Ｓｉｎａｐｉｃａｃｉｄ；对香豆酰辅酶Ａ：ｐｃｏｕｍａｒｏｙｌＣｏＡ；香豆酰莽草酸：Ｃｏｕｍａｒｏｙｌｓｈｉｋｉｍｉｃａｃｉｄ；香豆酰奎尼
酸：Ｃｏｕｍａｒｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ；咖啡酰辅酶Ａ：ＣａｆｆｅｏｙｌＣｏＡ；阿魏酰辅酶Ａ：ＦｅｒｕｌｏｙｌＣｏＡ；５羟基阿魏酰辅酶Ａ：５ｈｙｄｒｏｘｙｆｅｒｕｌｏｙｌＣｏＡ；芥子酰辅酶
Ａ：ＳｉｎａｐｏｙｌＣｏＡ；对香豆醛：ｐｃｏｕｍａｒａｌｄｅｈｙｄｅ；咖啡醛：Ｃａｆｆｅｏｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ；松柏醛：Ｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ；５羟基松柏醛：５ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ；
芥子醛：Ｓｉｎａｐａｌｄｅｈｙｄｅ；对香豆醇：ｐｃｏｕｍａｒｙｌａｌｃｏｈｏｌ；松柏醇：Ｃｏｎｉｆｅｒｙｌａｌｃｏｈｏｌ；５羟基松柏醇：５ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｎｉｆｅｒｙｌａｌｃｏｈｏｌ；芥子醇：Ｓｉｎａｐｙｌａｌ
ｃｏｈｏｌ；过氧化物酶／漆酶：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ／ｌａｃｃａｓｅ；Ｈ型木质素：Ｈｌｉｇｎｉｎ；Ｇ型木质素：Ｇｌｉｇｎｉｎ；Ｓ型木质素：Ｓｌｉｇｎｉｎ．
３７第２２卷第５期 草业学报２０１３年
５０％，其中Ｓｌｉｇｎｉｎ比Ｇｌｉｇｎｉｎ减少得更多，另外半纤维素、果胶和木聚糖的合成也减少，外层木质部表现出橙棕
色且着色不均，并且伴随着纤维素比例的增加，改善了制浆特性［９］。犆犆犚下调的烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）木质
素含量降低，而犆犃犇下调植株的木质素中含有更多的醛类物质，转录和代谢研究表明木质素合成途径与其他代
谢途径相关联［１０］。玉米（犣犲犪犿犪狔狊）犆犆犚１基因插入突变体（犣犿犮犮狉１），犆犆犚１基因的表达量只有野生型的
３１％，其木质素含量有所下降且结构明显改变，Ｈｌｉｇｎｉｎ含量明显下降，Ｓ／Ｇ略有上升，并且消化性能提高，但未
影响植株的生长发育［１１］。另外，由于苯丙氨酸代谢途径不仅生成木质素，还生成其他的植物次生代谢物，如类黄
酮、羟基苯乙烯、单宁酸等酚类化合物，因此，可通过降低木质素的生物合成来促进有益的可溶性酚类化合物生
成。在干扰犆犆犚基因的转基因番茄（犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）中，木质素含量降低，同时茎和叶中可溶性酚类物
质的总含量增加，组分分析显示绿原酸和芦丁等含量增加，果实中酚类物质总量没有增加，但是组分发生改变，相
应地提高了番茄提取物的抗氧化能力［１２］。
ＣＡＤ催化木质素单体生物合成的最后一步，将３种肉桂醛（对香豆醛、松柏醛和芥子醛）还原生成相应的３
种肉桂醇。Ｓａａｔｈｏｆｆ等［１３］通过ＲＮＡｉ下调柳枝稷（犘犪狀犻犮狌犿狏犻狉犵犪狋狌犿）中犆犃犇 表达，发现这些植株茎中催化松
柏醛和芥子醛的ＣＡＤ活性下降，总木质素含量和表皮素含量也明显降低，且经过氢氧化铵预处理和纤维素酶消
化的研磨样品释放出的葡萄糖也多于野生型对照。Ｆｏｒｎａｌé等［１４］利用ＲＮＡｉ下调玉米犆犃犇基因表达，结果显示
在不同组织中犆犃犇下调的程度不同，转基因植株细胞壁的成分发生变化，茎的细胞壁总木质素含量未受影响，
Ｓ／Ｇ比例稍有下降，并且积累了更多的纤维素和木聚糖，而中脉的细胞壁总木质素含量和多糖含量下降，转基因
植株与野生型相比表型没有改变，但更容易降解，乙醇产量也较高。ＲＮＡｉ下调亚麻（犔犻狀狌犿狌狊犻狋犪狋犻狊狊犻犿狌犿）中的
犆犃犇后，木质素前体物质含量显著提高，木质素、果胶和半纤维素含量降低，转基因植株的弹性增加［１５］。ＲＮＡｉ
下调犆犃犇１的转基因烟草，植株生长发育正常，木质素含量未受影响，仅Ｇｌｉｇｎｉｎ略有减少［１６］。还有研究将拟南
芥２种犆犃犇基因（犆犃犇犆和犆犃犇犇）的突变体和犆犆犚１的突变体杂交后发现其木质素含量比野生型减少了
３１％，木质素结构也发生改变，但植株严重矮化并伴有雄性不育症状［１７］。
综上所述，利用ＲＮＡｉ技术并结合转基因方法，在多种植物中，可以通过降低木质素合成途径中相应酶的表
达而获得木质素含量降低或者木质素组成改变的转基因植物。ＲＮＡｉ是由双链ＲＮＡ 分子介导的、在 ｍＲＮＡ 水
平关闭相应基因表达的过程。因为ＲＮＡｉ技术简单易行，抑制基因表达效率高，已被广泛应用于真核生物基因功
能的研究［１８］。
多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）是禾本科黑麦草属（犔狅犾犻狌犿）植物，是优良的牧草和草坪草，但自交不亲和，
传统育种困难而复杂。随着现代生物技术的发展，转基因技术已成为黑麦草遗传改良的有力工具，可通过ＲＮＡｉ
方法和转基因技术获得木质素含量降低的黑麦草［４］。
本研究在本实验室已建立的多年生黑麦草转化体系上［１９］，优化转化方法，通过根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿
狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）介导的ＲＮＡｉ技术，降低多年生黑麦草中犆犆犚、犆犃犇基因表达，以期获得低木质素含量的多年生黑
麦草新材料，为进一步培育高消化利用率的多年生黑麦草提供种质资源。
１　材料与方法
１．１　材料
多年生黑麦草品种“雅晴”，由百绿草业公司惠赠。本实验在中国科学院成都生物研究所于２０１０年９月至
２０１２年４月期间进行并完成。根癌农杆菌ＥＨＡ１０５由本实验室保存。植物表达载体ｐ２３５５由中国科学院成都
生物研究所马欣荣实验室在ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１基础上构建，外源基因由多克隆位点区插入；中间载体ｐＳＫｉｎｔ由四
川省农业科学院黄维藻博士惠赠。载体示意图见图２。
１．２　犆犃犇和犆犆犚 基因片段的分离克隆
根据ＮＣＢＩ中的黑麦草犆犃犇（登录号：ＡＦ４７２５９１．１）和犆犆犚（登录号：ＡＦ２７８６９８．１）基因ｃＤＮＡ序列，选取其
中约２００～３００ｂｐ的片段，应用Ｐｒｉｍｅｒ６．０软件，分别设计犆犃犇和犆犆犚 正、反向目的片段的上下游２对引物（表
１），正向片段和反向片段引物的扩增序列相同，而酶切位点不同，以使目的片段定向插入载体中。
预期犆犃犇片段长度２５６ｂｐ，加酶切位点１２ｂｐ，共计２６８ｂｐ；犆犆犚片段长度１９４ｂｐ，加酶切位点１２ｂｐ，共计
２０６ｂｐ。
４７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
图２　载体结构简图
犉犻犵．２　犜犺犲犮犪狊狊犲狋狋犲狅犳狏犲犮狋狅狉狊
　Ａ：中间载体ｐＳＫｉｎｔ结构简图。ｐＳＫｉｎｔｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｄｉａｇｒａｍ．Ｂ：植物表达载体ｐ２３５５表达盒示意图。Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐ２３５５．Ｃ：重组植物表达载体ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ干扰片段表达盒示意图。Ｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐ２３ｉＣＡＤａｎｄｐ２３ｉＣＣＲｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｒａｇｍｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｄｉａｇｒａｍ．
　
表１　用于扩增犆犃犇、犆犆犚正、反向片段的寡核苷酸引物
犜犪犫犾犲１　犛犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳狅犾犻犵狅狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狆狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犳狅狉犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犃犇，犆犆犚犳狉犪犵犿犲狀狋狊
引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ 酶切位点Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ 扩增片段Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｃａｄ１ ＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣ 犅犪犿ＨＩ ＣＡＤ正向片段（预期长度２６８ｂｐ）。ＣＡＤｆｏｒ
ｗａｒｄｆｒａｇｍｅｎｔ（ｅｘｐｅｃｔｅｄｌｅｎｇｔｈ２６８ｂｐ）．ｃａｄ２ ＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴ 犎犻狀ｄＩＩＩ
ｃａｄ３ ＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣ 犛犪犮Ｉ ＣＡＤ反向片段（预期长度２６８ｂｐ）。ＣＡＤｒｅ
ｖｅｒｓｅｆｒａｇｍｅｎｔ（ｅｘｐｅｃｔｅｄｌｅｎｇｔｈ２６８ｂｐ）．ｃａｄ４ ＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴ 犈犮狅ＲＩ
ｃｃｒ１ ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣ 犅犪犿ＨＩ ＣＣＲ正向片段（预期长度２０６ｂｐ）。ＣＣＲｆｏｒ
ｗａｒｄｆｒａｇｍｅｎｔ（ｅｘｐｅｃｔｅｄｌｅｎｇｔｈ２０６ｂｐ）．ｃｃｒ２ ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣ 犎犻狀ｄＩＩＩ
ｃｃｒ３ ＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣ 犛犪犮Ｉ ＣＣＲ反向片段（预期长度２０６ｂｐ）。ＣＣＲｒｅ
ｖｅｒｓｅｆｒａｇｍｅｎｔ（ｅｘｐｅｃｔｅｄｌｅｎｇｔｈ２０６ｂｐ）．ｃｃｒ４ ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣ 犈犮狅ＲＩ
　下划线部分为酶切位点。
　Ｔｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｓｉｔｅｓｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ．
　　提取新鲜的野生型黑麦草叶片总ＲＮＡ，用 ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒（ＴａＫａＲａ）反转录成ｃＤＮＡ，作为扩增目的片段
的模板。用引物ｃａｄ１和ｃａｄ２、ｃｃｒ１和ｃｃｒ２分别ＰＣＲ扩增出犆犃犇 和犆犆犚 的正向片段（表１）。扩增条件为
９４℃５ｍｉｎ；９４℃４５ｓ，５５℃４５ｓ，７２℃４５ｓ，（３５个循环）；７２℃７ｍｉｎ。扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳，切下目
的条带用ＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（上海生工）回收后与ｐＭＤ１９Ｔ载体（ＴａＫａＲａ）连接，筛选重组子并测序（上海
生工），测序结果用ＤＮＡＭＡＮ（版本５．２．２）软件进行分析。
以含有犆犃犇或犆犆犚 正向片段的重组ｐＭＤ１９Ｔ载体为模板，分别以ｃａｄ３和ｃａｄ４、ｃｃｒ３和ｃｃｒ４为引物，
ＰＣＲ扩增出犆犃犇和犆犆犚 的反向片段（表１），再分别克隆到ｐＭＤ１９Ｔ载体中，筛选重组子，酶切验证并测序分
析。
１．３　ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ植物表达载体构建
含有正向目的片段的重组ｐＭＤ１９Ｔ载体分别经犅犪犿ＨＩ和犎犻狀ｄＩＩＩ双酶切，分别回收小片段，与经相同酶
切的中间载体ｐＳＫｉｎｔ连接，筛选重组子并酶切验证。再将含犆犃犇或犆犆犚 反向片段的重组ｐＭＤ１９Ｔ载体分别
用犈犮狅ＲＩ和犛犪犮Ｉ双酶切后，回收小片段分别插入已经含有犆犃犇或犆犆犚 正向片段的重组中间载体相应位点，筛
选重组子，酶切验证。分别获得含有干扰片段的中间载体ｐＳＫｉＣＡＤ和ｐＳＫｉＣＣＲ，具有发卡结构的干扰片段分
别称为ｉＣＡＤ和ｉＣＣＲ。
将重组中间载体分别用犅犪犿ＨＩ和犛犪犮Ｉ双酶切后，分别获得ｉＣＡＤ或ｉＣＣＲ目的片段。将目的片段分别插
５７第２２卷第５期 草业学报２０１３年
入ｐ２３５５载体相应位点，利用变性碱裂解法和双酶切法鉴定重组子。构建的携犆犃犇 或犆犆犚 目的片段反向重复
结构的植物表达载体，分别命名为ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ，干扰片段由花椰菜花叶病毒３５Ｓ启动子（ＣａＭＶ３５Ｓｐ）
驱动。
１．４　遗传转化
热激法将载体ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ分别导入根癌农杆菌ＥＨＡ１０５感受态细胞中，保存于液氮备用。
选取成熟的多年生黑麦草“雅晴”种子，经过表面灭菌后接种于 ＭＳ基本培养基［２０］中萌发生长。无菌苗可以
通过组织培养快速繁殖并长期保存，每１５ｄ转接１次，培养基为 ＭＳ＋６ＢＡ１ｍｇ／Ｌ。待试管苗生长到一定长
度、分蘖达１０个以上时，取茎节分生区并纵切后置于ＭＳ＋２，４Ｄ５ｍｇ／Ｌ愈伤组织诱导培养基中，诱导愈伤组织
生长，并每隔１５ｄ继代１次，共继代４次。
将分别含有ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ的根癌农杆菌ＥＨＡ１０５均匀涂布在含有５０ｍｇ／ＬＫｍ和２０ｍｇ／ＬＲｉｆ
的ＬＢ平板上，待长出菌苔后，刮取适量菌体接种于含２００μｍｏｌ／ＬＡＳ的液体愈伤组织诱导培养基中，２８℃，２００
ｒ／ｍｉｎ培养３ｈ左右，ＯＤ６００为０．２～０．５即可用于转化。愈伤组织预先用细胞凋亡抑制剂ＣＨＯ（１００μｍｏｌ／Ｌ）处
理３ｈ。侵染前，菌液中加入适量（１０μＬ／ｍＬ）１０％非离子去污剂Ｆ６８水溶液。愈伤组织于菌液中浸没５ｍｉｎ后，
置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，然后转入含滤纸（每皿加１３４μＬ灭菌水）的培养皿进行共培养，２２℃。共培养
３ｄ后，将愈伤组织接入含２００ｍｇ／Ｌ抗生素Ｔｉｍｅｎｔｉｎ的除菌诱导培养基中，２４～２６℃培养。７ｄ后，将愈伤组织
接入含５０ｍｇ／Ｌ巴龙霉素（ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）的筛选继代培养基（ＭＳ＋２，４Ｄ３ｍｇ／Ｌ）中，２４～２６℃培养，１４ｄ筛选
继代１次，共３次。上述培养均为暗培养，培养基配方参见文献［１９］。
之后将生长良好的愈伤组织接入含２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、２０μｇ／Ｌ２，４Ｄ、２５ｍｇ／Ｌ巴龙霉素的分化培养基。待长
出苗后，移入含５０ｍｇ／Ｌ巴龙霉素的１／２ＭＳ培养基生根培养。待长出根后，移入含 ＭＳ＋０．１ｍｇ／ＬＩＡＡ＋５０
ｍｇ／Ｌ巴龙霉素的筛选培养基进行最后一轮筛选。分化再生培养条件为２４～２６℃，１６ｈ光／８ｈ暗培养。２周之
后将发育良好的植株移出，大棚盆栽。
愈伤组织诱导、继代、分化，以及植株再生培养基，均参见本实验室配方并优化［１９］。在共培养及选择、分化培
养过程中，均添加５ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３。共培养后Ｔｉｍｅｎｔｉｎ持续添加至再生苗移入盆钵前。
１．５　转基因植株鉴定
使用ＣＴＡＢ法提取植株叶片总ＤＮＡ作为模板，ＰＣＲ鉴定犆犃犇、犆犆犚基因目的片段。扩增目的片段上游引
物在ＣａＭＶ３５Ｓ启动子上，下游引物分别为ｃａｄ２和ｃｃｒ２，产物为正向片段并包括部分启动子序列。预期扩增片
段长度分别约为犆犃犇４００ｂｐ，犆犆犚３００ｂｐ。
ＣａＭＶ３５Ｓ启动子上的引物３５Ｓ１：ＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣ。反应条件与１．２相同。
１．６　转基因黑麦草相对木质素含量测定
根据ＰＣＲ鉴定结果，选取ＰＣＲ阳性植株和野生型植株，采用紫外分光光度法测定其相对木质素含量［２１］。
取各独立的转基因植株全叶片，置于５０℃干燥过夜后研磨成粉末，每株分成３份，每份０．００６ｇ，分别放入１０ｍＬ
离心管中，加入２５％溴乙酰乙酸溶液 （ｗ／ｗ）０．５ｍＬ和高氯酸０．０２ｍＬ，盖紧管口，于８０℃恒温水浴４０ｍｉｎ，
每隔１０ｍｉｎ振荡试管。将反应液完全移入已装有２ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ１ｍＬ和２．５ｍＬ冰乙酸混合液的１０ｍＬ容量
瓶内，振荡，充分混匀，并用冰乙酸定容至１０ｍＬ。以冰乙酸为空白溶液，用多功能读数仪（ＶａｒｉｏｓｋａｎＦｌａｓｈｓｐｅｃ
ｔｒａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｕｌｔｉｍｏｄｅｒｅａｄｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ公司）在波长２６０ｎｍ测定吸光度。利用２６０ｎｍ处木质素的吸光度作
为相对木质素含量。采用数据学软件ＳＰＳＳ１２进行统计学分析。
Ｌｉｇｎｉｎ％＝Ａｂｓ×Ｌｉｔｅｒｓ×１００％／（Ｗｓａｍｐｌｅ×Ａｓｔａｎｄａｒｄ）［２１］
式中，Ａｂｓ为样品溶液木质素吸光度，Ｌｉｔｅｒｓ为样品溶液定容体积（Ｌ），Ｗｓａｍｐｌｅ为样品的绝干重量（ｇ），Ａｓｔａｎ
ｄａｒｄ为黑麦草木质素标准吸光率。根据公式可知，木质素含量与其吸光度呈正相关。
２　结果与分析
２．１　犆犃犇、犆犆犚正向片段分离克隆
以多年生黑麦草“雅晴”ｃＤＮＡ为模板扩增获得的目的片段，经克隆测序，结果表明，片段长度与预期有差异。
６７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
犆犃犇片段，预期长度是２５６ｂｐ，实际长度为３６７ｂｐ，与预期相差１１１ｂｐ；犆犆犚预期长度是１９４ｂｐ，实际长度为２９６
ｂｐ，相差１０２ｂｐ。均不包括添加的酶切位点。
通过ＤＮＡＭＡＮ（版本５．２．２）软件对测序结果与ＮＣＢＩ中的黑麦草犆犃犇基因序列（登录号：ＡＦ４７２５９１．１）和
犆犆犚基因序列（登录号：ＡＦ２７８６９８．１）进行比对，并分析结构，结果表明获得的片段均包含一段内含子序列。内
含子序列长度即是差异的长度，分别为１１１和１０２ｂｐ。去掉内含子，ｃＤＮＡ序列与ＮＣＢＩ数据库中目的基因片段
序列同源性分别为９２．１９％和９９．４８％（图３和图４）。获得的犆犃犇 基因与ＮＣＢＩ中ＡＦ４７２５９１．１序列存在一定
差异，氨基酸序列比对分析，同源性为８７．０６％。结果表明获得的片段为犆犃犇和犆犆犚 基因片段。
图３　犆犃犇片段同源性分析 （１０２～２１２为内含子）
犉犻犵．３　犜犺犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犆犃犇犳狉犪犵犿犲狀狋（１０２—２１２犻狀犱犻犮犪狋犲狋犺犲犻狀狋狉狅狀）
　
图４　犆犆犚片段同源性分析 （９３～１９４为内含子）
犉犻犵．４　犜犺犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犆犆犚犳狉犪犵犿犲狀狋（９３—１９４犻狀犱犻犮犪狋犲狋犺犲犻狀狋狉狅狀）
　
２．２　植物表达载体ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ的鉴定
获得的目的片段分别以正反方向插入到载体ｐＳＫｉｎｔ质粒内含子两侧，构建了重组中间载体ｐＳＫｉＣＡＤ和
ｐＳＫｉＣＣＲ。用犅犪犿ＨＩ／犛犪犮Ｉ分别双酶切ｐＳＫｉＣＡＤ和ｐＳＫｉＣＣＲ，回收目的片段ｉＣＡＤ和ｉＣＣＲ，分别插入相同
酶切的ｐ２３５５载体相应位点，构建了含干扰片段的植物表达载体ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ。ｉＣＡＤ片段长９０９ｂｐ
（正向片段３７３ｂｐ、内含子１６３ｂｐ、反向片段３７３ｂｐ，其中包含酶切位点１２ｂｐ），ｉＣＣＲ片段为７６７ｂｐ（正向片段
３０２ｂｐ、内含子１６３ｂｐ、反向片段３０２ｂｐ，其中包含酶切位点１２ｂｐ），由ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动。
用犅犪犿ＨＩ／犛犪犮Ｉ双酶切ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ分别得到９０９和７６７ｂｐ长的目的片段（图５），表明犆犃犇和
犆犆犚基因正、反向目的片段已经插入到ｐ２３５５质粒的相应位点，植物表达载体ｐ２３ｉＣＡＤ和ｐ２３ｉＣＣＲ构建完成
（图２）。
２．３　黑麦草的遗传转化
选择生长状态良好、质地致密均一的黑麦草愈伤组织（图６Ａ）经过农杆菌浸染（图６Ｂ），再通过３轮巴龙霉素
７７第２２卷第５期 草业学报２０１３年
共计６周筛选后（图６Ｃ），进行分化（图６Ｄ）和生根培养
图５　狆２３犻犆犃犇和狆２３犻犆犆犚重组子
犅犪犿犎犐和犛犪犮犐双酶切验证
犉犻犵．５　犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆２３犻犆犃犇犪狀犱狆２３犻犆犆犚
犫狔犲狀狕狔犿犪狋犻犮犱犻犵犲狊狋犻狅狀
　　　Ａ．Ｍ，λＥｃｏＴ１４标记；１，ｐ２３ｉＣＡＤ重组子；２，双酶切ｐ２３ｉＣＡＤ重
组子。Ａ．Ｍ，λＥｃｏＴ１４Ｍａｒｋｅｒ；１，ｐ２３ｉＣＡＤｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ；２，Ｉｄｅｎｔｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐ２３ｉＣＡＤ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｂ．Ｍ，
ＤＬ２０００标记；１，ｐ２３ｉＣＣＲ重组子；２，双酶切ｐ２３ｉＣＣＲ重组子。Ｂ．
Ｍ，ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ；１，ｐ２３ｉＣＣＲｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ；２，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｐ２３ｉＣＣＲｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．
（图６Ｅ），检测鉴定获得转基因植株（图６Ｆ）。
携ｐ２３ｉＣＡＤ质粒农杆菌转化多年生黑麦草，从
约３６００个共培养的愈伤组织中，获得６５株正常生长
的抗性植株，１３８个未分化的抗性愈伤组织，以及３０
株抗性白化苗。携ｐ２３ｉＣＣＲ质粒农杆菌转化多年生
黑麦草，从约３６００个共培养的愈伤组织中，获得７８
株正常生长的抗性植株，１４５个未分化的抗性愈伤组
织，以及３２株抗性白化苗。未分化的抗性愈伤组织和
白化苗没有应用价值，淘汰，未进行后续研究。
观察显示，转基因植株与野生型相比，外观表型上
没有明显差异，生长正常（图６Ｆ）。
２．４　转基因黑麦草ＰＣＲ鉴定
利用抗性植株叶片总ＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ
验证，由于犆犃犇 和犆犆犚 克隆片段分别比预期多出
１１１和１０２ｂｐ内含子序列，因此扩增片段亦比预期分
别长１１１和１０２ｂｐ。扩增ＣＡＤ基因正向目的片段的
引物为上游ＣａＭＶ３５Ｓ启动子引物５５１和ｃａｄ２，片段
长度约为５００ｂｐ（图７）；扩增ＣＣＲ基因正向目的片段
的引物为上游ＣａＭＶ３５Ｓ启动子引物３５５１和ｃｃｒ２，片段长度约为４００ｂｐ（图８）。
图６　多年生黑麦草的遗传转化
犉犻犵．６　犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犿犲犱犻犪狋犲犱狆犲狉犲狀狀犻犪犾狉狔犲犵狉犪狊狊狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
　Ａ．胚性愈伤组织；Ｂ．农杆菌浸染后共培养，共培养过程中大部分愈伤组织褐化；Ｃ．转化后在选择培养基上，非抗性褐化，愈伤组织上抗性细胞生
长；Ｄ．抗性愈伤组织分化；Ｅ．生根培养基上的抗性苗；Ｆ．大棚种植的转基因植株和对照。Ａ．Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｉ；Ｂ．Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻
狌犿，ｍｏｓｔｏｆｔｈｅｃａｌｉｇｅｔｔｉｎｇｂｒｏｗｎ；Ｃ．Ｉｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ，ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｅｌｓｇｒｏｗｉｎｇ，ｏｔｈｅｒｓｇｅｔｔｉｎｇｂｒｏｗｎ；Ｄ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｌｉｉｎｓｈｏｏｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｍｅｄｉｕｍ；Ｅ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓｉｎｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ；Ｆ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｎｄｗｉｌｄｃｏｎｔｒｏｌｐｌａｎｔｓｇｒｏｗｉｎｇｉｎｐｏｔｓ．
８７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
图７　犘犆犚检测抗性植株犻犆犃犇片段
犉犻犵．７　犇犲狋犲犮狋犻狀犵犻犆犃犇犳狉犪犵犿犲狀狋狅犳狉犲狊犻狊狋犪狀狋狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狀狋犫狔犘犆犚
　Ｍ，ＤＬ２０００标记；１，ｐ２３ｉＣＡＤ质粒；２，野生型对照；５－９、１３－１５，ｉＣＡＤ阳性植株；３、４、１０－１２、１６－１８，假阳性植株。Ｍ，ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；
１，ｐ２３ｉＣＡＤ；２，Ｗｉｌｄｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ；５－９，１３－１５，ｉＣＡＤｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；３，４，１０－１２，１６－１８，ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．
　
图８　犘犆犚检测抗性植株犻犆犆犚片段
犉犻犵．８　犇犲狋犲犮狋犻狀犵犻犆犆犚犳狉犪犵犿犲狀狋狅犳狉犲狊犻狊狋犪狀狋狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狀狋犫狔犘犆犚
　Ｍ，ＤＬ２０００标记；１，ｐ２３ｉＣＣＲ质粒；２，野生型对照；３、６、７、９－１２、１４－２２，ｉ－ＣＣＲ阳性植株；４、５、８、１３，假阳性植株。Ｍ，ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；
１，ｐ２３ｉＣＣＲ；２，Ｗｉｌｄｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ；３，６，７，９－１２，１４－２２，ｉＣＣＲｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；４，５，８，１３，ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．
　
　　获得的干扰犆犃犇基因的转基因株系命名为ｉＣＡＤ，干扰犆犆犚基因的命名为ｉＣＣＲ。
２．５　转基因黑麦草相对木质素含量测定
根据ＰＣＲ验证结果，分别对ＰＣＲ阳性植株和野生型对照进行相对木质素含量测定。目前对ｉＣＡＤ阳性和
ｉＣＣＲ阳性各测定了２０个独立的转基因植株。提取叶片木质素，在２６０ｎｍ测定吸光度（图９）。由于木质素含
量与吸光度呈正相关，因此以野生型的吸光度作为对照，转基因植株的吸光度与之相比较，测定相对木质素含量。
结果显示，其中，ｉＣＡＤ植株有１１株、ｉＣＣＲ植株有９株木质素含量明显降低。图９分别显示了９个木质素含量
降低的植株。
图９　转基因黑麦草相对木质素含量比较
犉犻犵．９　犜犺犲犮狅犿狆犪狉犲狅犳狉犲犾犪狋犻狏犲犾犻犵狀犻狀犮狅狀狋犲狀狋狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狉狔犲犵狉犪狊狊　
与野生型对照相比，犆犃犇干扰植株木质素含量降低了２６．４０％～４５．０４％，平均降低了３３．８６％；犆犆犚干扰
植株木质素含量降低了２８．５８％～５０．１８％，平均降低了３４．６７％。经过方差分析，犆犃犇干扰植株和犆犆犚 干扰植
株的相对木质素含量与野生型相比差异极显著（犘＜０．０１），表明ＲＮＡ干扰木质素合成途径中的犆犃犇、犆犆犚后，
转基因植株叶片总木质素含量明显降低。
观察表明，木质素降低的转基因植株与对照相比，外观形态上没有明显差异，生长正常（图６Ｆ），但是触摸感
觉较柔软。
９７第２２卷第５期 草业学报２０１３年
３　讨论
多年以来人们都是通过化学和生化角度来研究木质素潜在的合成途径，而如今则更多的是利用经典的正向
遗传筛选和有针对性的反向遗传学方法。目前在知道基因或者基因组序列的情况下，反向遗传学技术更加广泛
地应用在基因功能研究及新材料的创制中，例如ＲＮＡｉ、反义抑制、插入突变体的表征分析等手段来进行研究［２２］。
其中，ＲＮＡｉ可以高效、特异性地使目的基因转录后沉默或抑制目标基因表达，从而获得功能丧失性突变个体用
于基因功能的研究，这已成为研究基因功能及转基因育种的重要方法。在植物基因功能研究中，利用含有目标基
因正向和反向重复序列片段能形成发卡结构的ＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）来沉默内源基因，是应用于转基因诱导基因沉默
最高效的方法［２３］。这种ＲＮＡ干扰方法效率高、作用持久、可稳定遗传给子代［２４］。
本研究中，预期扩增的片段为ｃＤＮＡ序列，但是结果获得的片段含有一段约１００ｂｐ的内含子。可能是提取
的ＲＮＡ中混有ＤＮＡ，因此扩增出了含有内含子的片段。通过对木质素含量的测定，表明含有内含子的干扰片
段没有影响对目的基因表达的沉默，亦有可能参与了对目的基因的沉默作用。近年来的研究表明，内含子也参与
了基因的表达调控［２５］。构建的载体正、反向片段中均包含目的基因内含子，内含子片段在ＲＮＡｉ过程中也会配
对形成双链互补的小分子ＲＮＡ，可能会对目标基因调控产生影响。获得的犆犃犇基因片段的外显子与ＮＣＢＩ中
参考的序列 ＡＦ４７２５９１．１核苷酸序列同源性为９２．１９％，差异相对较大，氨基酸序列比对分析，同源性为
８７．０６％。推测获得的片段可能是犆犃犇基因家族中１个基因的片段。由于植物木质素合成酶系存在多基因家
族现象［２６］，其中犆犃犇是典型的以家族形式出现［２７］。ＮＣＢＩ数据库中目前已公布了３个黑麦草犆犃犇的ｃＤＮＡ序
列（登录号：ＡＦ０１０２９０．１、ＡＦ４７２５９１．１、ＡＦ４７２５９２．１）和１个黑麦草犆犆犚的ｃＤＮＡ序列（登录号：ＡＦ２７８６９８．１）。
干扰该基因的表达，在转基因植株中，导致了木质素含量的显著降低。因此，本研究获得的犆犃犇 片段可能是该
家族中一个基因的片段。
由于黑麦草属于单子叶禾本科植物，并非农杆菌的天然受体，遗传转化较为困难，愈伤组织再生频率低［２８］，
因此需要对受体材料和转化方法加以改进。有研究利用黑麦草幼苗分蘖处分生区诱导获得的愈伤组织作为受体
获得了较高的遗传转化效率［２９］。还有研究通过改进转化方法，极大地提高了二穗短柄草（犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊
狋犪犮犺狔狅狀）［３０］和假俭草（犈狉犲犿狅犮犺犾狅犪狅狆犺犻狌狉狅犻犱犲狊）［３１］的转化效率。在此基础上，并结合本实验室建立的方法，再
次优化了转化方法。在农杆菌侵染愈伤组织前，还用细胞凋亡抑制剂ＣＨＯ对愈伤组织进行预处理，以减轻农杆
菌侵染愈伤组织后对其造成的褐化坏死，并在侵菌时加入非离子去污剂Ｆ６８，以利于农杆菌的附着和增加细胞膜
的通透性。
黑麦草作为优良的牧草和草坪草在我国的种植和应用越来越广泛，新材料的培育具有重要意义。降低黑麦
草木质素含量，有利于提高饲草的利用率和消化率。因此本研究应用ＲＮＡｉ技术分别抑制了多年生黑麦草木质
素合成途径中的关键酶ＣＣＲ和ＣＡＤ，以获得木质素降低的转基因黑麦草。结果显示，通过导入干扰犆犆犚 和
犆犃犇 基因的片段，能获得木质素显著降低的转基因植株，表明ＣＣＲ、ＣＡＤ在黑麦草木质素合成途径中起关键作
用，同时也表明可以通过ＲＮＡｉ技术培育低木质素含量的多年生黑麦草。获得的转基因植株生长发育正常，未出
现倒伏、褐化等异常，表明利用ＲＮＡｉ技术适度抑制黑麦草木质素合成，能够得到生长发育正常的转基因植株。
本结果与Ｔｕ等［４］的研究报道相似。Ｔｕ等［４］ＲＮＡｉ下调ＣＣＲ（与本研究不同的干扰片段）或ＣＯＭＴ（咖啡酸３
Ｏ甲基转移酶）的转基因多年生黑麦草在温室和田间均表现出总木质素含量和Ｇｌｉｇｎｉｎ、Ｓｌｉｇｎｉｎ、Ｈｌｉｇｎｉｎ三种
单体的含量同时降低，但Ｓ／Ｇ没有明显下降，这些木质素含量降低的转基因植株的消化品质得到改善并且未对
生长发育产生明显不利影响。当木质素正常合成代谢途径受阻时，可能有其他次生代谢物填充于木质素构架中，
使得植物体内的生理功能不受影响［３２］。
本研究获得的转基因植株中，约５０％的植株总木质素含量显著降低，其余的与对照相比，未见明显降低。许
多研究表明，外源基因的导入，常有表达发生沉默的现象［３２］。而且木质素生物合成途径极其复杂，受时间、空间
和环境因素影响较大［３２］，因此有部分转基因植株木质素含量没有变化。在进一步进行育种研究中，需筛选木质
素含量降低的植株为育种材料。
当木质素正常合成代谢途径受阻时，会有其他次生代谢物产生［３２］。一些研究显示，降低木质素含量，能增加
０８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
转基因杨树［９］、柳枝稷［１３］、玉米［１４］等纤维素含量。最新研究发现，在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）中转入拟南芥的一种转
录因子ＳＨＩＮＥ（ＳＨＮ），使得木质素含量降低了４５％，组分也发生变化，并且纤维素含量增加了３４％，但植株表
型和强度却没有改变［３４］。推测木质素含量降低，可能产生一种补偿作用，而使纤维素含量增加，使植株仍然保持
一定的强度。本研究获得的木质素含量降低的转基因多年生黑麦草，是否会增加纤维素含量，有待研究。
但是某些问题值得关注，木质素能保护植株避免病原体入侵，木质素降低可能会引起植株对病原菌的抗性降
低［５］。我们获得的转基因低木质素含量的植株抗病能力是否改变，有待进一步研究。
同时，一些问题也需要进一步探讨，例如在黑麦草转化株总木质素含量降低的同时，木质素的组成结构是否
也发生改变；抑制木质素的合成是否会引起其他生理组成的变化；转基因植株后代的表型是否正常；如何进一步
提高遗传转化效率等等。相信随着木质素生物代谢途径研究的不断深入和生物技术的发展，人们能更好地对其
加以利用，以利于工农业的发展。
缩写：ＭＳ培养基：ＭＳｍｅｄｉｕｍ；ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ培养基：ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇｍｅｄｉｕｍ；２，４Ｄ：二氯苯氧
乙酸２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ；６ＢＡ：６苄氨基嘌呤６Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ；ＩＡＡ：吲哚乙酸Ｉｎｄｏｌｅ３ａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄ；ＡＳ：乙酰丁香酮 Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ；Ｋｍ：硫酸卡那霉素 Ｋａｎａｍｙｃｉｎ；Ｒｉｆ：利福平Ｒｉｆａｍｐｉｎ；Ｔｉｍｅｎｔｉｎ：特美汀，
青霉素替卡西林钠－克拉维酸钾 ＴｉｃａｒｃｉｌｉｎＤｉｓｏｄｉｕｍＰｏｔａｓｓｉｕｍＣｌａｖｕｌａｎａｔ。
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犌犲狀犲狋犻犮犻犿狆狉狅狏犲犿犲狀狋狅犳狆犲狉犲狀狀犻犪犾狉狔犲犵狉犪狊狊狑犻狋犺犾狅狑犾犻犵狀犻狀犮狅狀狋犲狀狋
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ＨＵＫｅ１，２，ＹＡＮＸｕｅｆｅｎｇ１，２，ＬＩＤａｎ１，ＴＡＮＧＸｉａｏｍｅｉ１，２，ＹＡＮＧＨｏｎｇ１，
ＷＡＮＧＹａｎ１，ＤＥＮＧＨｏｎｇｙｕａｎ１，ＭＡＸｉｎｒｏｎｇ１
（１．ＣｈｅｎｇｄｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ；
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犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｌｉｇｎｉｎ，ｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｖａｓｃｕｌａｒｐｌａｎｔｓ，ｉｓｍａｉｎｌｙｐｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅｗａｌｓｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｉｌｙ
ｔｈｉｃｋｅｎｅｄｃｅｌｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔｉｓａｌｉｍｉｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｉｎａｎｕｍｂｅｒｏｆａｇｒｏｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｓｕｃｈａｓｃｈｅｍｉｃａｌｐｕｌ
ｐｉｎｇ，ｆｏｒａｇｅｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｌｉｇｎｏｃｅｌｕｌｏｓｉｃｔｏｂｉｏｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．ＣｉｎｎａｍｏｙｌＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＣＣＲ）ａｎｄ
ｃｉｎｎａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＣＡＤ）ａｒｅｔｗｏｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓｔｈａｔｃａｔａｌｙｓｅｔｈｅｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅａｎｄｕｌｔｉｍａｔｅｓｔｅｐｓ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅ犆犆犚ａｎｄ犆犃犇 ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌ
ｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）ｆｒｏｍＮＣＢＩ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏａｄｄａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ
ｓｉｔｅｓｔｏａｍｐｌｉｆｙａｎｄｃｌｏｎｅｔｈｅｔｗｏｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍｃＤＮＡｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓ．ＴｗｏＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ
（ＲＮＡｉ）ｖｅｃｔｏｒｓ（ｐ２３ｉＣＣＲａｎｄｐ２３ｉＣＡＤ）ｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇｉｎｖｅｒｓｅｒｅｐｅａｔｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ
ｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｉｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｂｙ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈ
ＥＨＡ１０５．ＴｈｅｙｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｕｓｉｎｇｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲ，ａｎｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉＣＣＲａｎｄｉＣＡＤ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂｙｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ．
Ｔｈｅｌｉｇｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｃｏｎｔｒｏｌｓｉｎ９ｐｌａｎｔｓｏｆｉＣＣＲａｎｄ１１ｐｌａｎｔｓ
ｏｆｉＣＡＤｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．ＴｈｅｌｉｇｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｓｅｉＣＣＲａｎｄｉＣＡＤｐｌａｎｔｓｗａｓｒｅｄｕｃｅｄｂｙ３４．６７％ａｎｄ
３３．８６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｈａｄｎｏｒｍａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｇｒｅｗｗｅｌ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ
ｌｏｗｌｉｇｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｓｉｌｅｎｃｉｎｇ犆犆犚ａｎｄ犆犃犇ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｈａｓｐｒｏ
ｖｉｄｅｄｎｏｖｅｌｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｆｏｒｂｒｅｅｄｉｎｇｄｉｇｅｓｔｉｂｌｅａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｒｙｅｇｒａｓｓ．
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