全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"%#$$" $+
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!!文章编号!$##$($)*&""#$%##%(#$"(#
油桐尺蛾核型多角体病毒广西株全基因组序列
罗!辑$!"! 周国英$!! 朱积余"
"$2中南林业科技大学林学院!湖南 长沙!)$###)* "2广西壮族自治区林业科学研究院!广西 南宁!%,###"#
收稿日期$ "#$)($#("#
基金项目$ 国家自然科学基金项目",$)##%)*#*中国博士后科学基金资助项目""#$)C%%"%,,j-#*广西博士后专项资助项目*广西林
科院基金项目"林科 "#$)#$ 号#
作者简介$ 罗!辑"$*&%)#!男!湖南长沙人!博士后!主要从事森林病虫害研究(
!
通讯作者$ 教授!博士生导师!3(4567$:T?@>W"$$&<$,2=>4
摘要!油桐尺蛾核型多角体病毒广西株基因组序列由 M59:PB测序的方法得到( 拼接后获得了 $"$ "& AU 序列!LE
含量为 ,2+g( 以长度不小于 %# 55的序列认定为功能基因!共预测到 $,$ 个开放阅读框!通过 -75DO比对!其中
&+ 个能注释到功能基因( 对基因组序列进重复序列分析!共发现 MM0位点 $+) 个!同源重复序列 $ 个( 在 MM0位
点中!包含 种长度的重复基序!且以富含.F的重复基序为主( 同源重复序列两端为一 %* AU 片段或其一部分组
成的重复序列!两端分别重复 $" 次和 + 次!中间则为一段与重复片段无关的 ", AU片段( 与武汉株相比!广西株病
毒在 ,+ 个核心基因中有 ) 个存在蛋白序列长度上的差异!而在其他非核心基因中有 个基因仅存在于一个病毒株
中!另有 $, 个基因存在蛋白序列长度上的差异(
关键词!油桐尺蛾*核型多角体病毒*株系*基因组*重复序列
中图分类号!M+,2, 文献标识码!.
2H%D(I#,%1%4%)(I%(.768693 16::9)1139"3 @58,%(#(,-H%/$(J$5&
45+)3"61$+)
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4PO@>R2F@PD6?P>QO@P:P9>4P6D$"$ "& AU 86O@ ,2+g LaE=>9OP9O2NO=>9O569D$,$ @TU>O@PO6=57>UP9 BP5R(
69:QB54PD"b0^D# O@5OU>OP9O657TP9=>RP5O7P5DO%# 5469>5=6RDBPDUP=O6VP7T2&+ b0^D8PBP599>O5OPR AT-75DO2
$+) MM0D6OPD59R >9P@>4>7>:>WDBPUP5OPR DPXWP9=P"Z0M# 8PBPQ>W9R 69 O@P:P9>4P2F@PMM0D6OPD=>9O569PR
OTUPD>QBPUP5OD! 59R 4>DO>QO@P48PBP.F(B6=@ DPXWP9=PD2Z0M =>9O569PR $" BPUP5OD5O%. P9R 59R + BPUP5OD5O
,. P9R2F@PBPUP5O85D%* AU >BOBW9=5OPR2-PO8PP9 %. P9R 59R ,. P9R B5UP5OD!O@PBP85D5", AU DPXWP9=P86O@
9>>AV6>WDQP5OWBPD2E>4U5BPR 86O@ dW@59 DOB569! ) :P9PD54>9:,+ =>BP:P9PD8PBPR6QPBP9O69 UB>OP69 7P9:O@ 59R
9>9(=>BP:P9PD8PBPQ>W9R >97T69 >9PDOB569! 59R 59>O@PB$, :P9PD8PBPR6QPBP9O69 UB>OP69 7P9:O@2
9%- :($/&$ S4H4#( %4GG#$%(#,(* 9W=7P>U>7T@PRB>V6BWD* DOB569* :P9>4P* BPUP5ODPXWP9=P
油桐尺蛾"S4H4#( %4GG#$%(#,(#是近年来危害桉
树的重要灾害性食叶害虫! 其为害率和为害面积均
呈快速上升的趋势,$- ( 油桐尺蛾核型多角体病毒
"S4H4#( %4GG#$%(#,( 9W=7P5BU>7T@PRB>D6DV6BWDPD!
-D1Gm#属于杆状病毒科"0@5AR>V6B6R5P#核型多角
体病毒属"64)2$"G"21*$3#"I,#4%#!能专一性的侵染油
桐尺蛾!对其起到生物防治的作用!是很有潜力的生
物农药(
昆虫病毒是专性侵染节肢动物的一类微生物!
包括核型多角体病毒颗粒体病毒质型多角体病
第 % 期 罗!辑!等$油桐尺蛾核型多角体病毒广西株全基因组序列
毒痘病毒虹彩病毒等很多类群!已报道的有 $ ##
多种!分属 $, 科 "$ 属,"- ( 但研究较为深入的并不
多!仅有不到百种!多为模式种或有较大应用价值的
种类( 而在基因组学方面的研究就更少!在 1E-N
上有报道的核型多角体病毒仅有 )$ 种,, J)- (
-D1Gm湖北武汉株的基因组序列由 h@W 等人,)-在
"#$) 年 $ 月报道!这是 -D1Gm基因组的首次报道(
近期-D1Gm广西株的基因组序列已经完成测序!本
文在分析其序列的基础上对病毒的结构及重复序列
进行了分析!并与武汉株进行了比较!以期寻找不同
株系之间的差异(
$!材料与方法
;2;<供试病毒
油桐尺蛾核型多角体病毒从广西南宁市六里林
场采集的油桐尺蛾上分离保存(
;2><方法
$2"2$!病毒的增殖!选取生长状态相同的油桐尺
蛾四龄幼虫!单条置于培养皿中饥饿 ") 小时!用喷
有上述保存的油桐尺蛾核型多角体病毒悬液的桉树
叶饲喂!待其发病死亡后收集虫尸(
$2"2"!病毒的纯化!将收集的虫尸置于研钵中!加
适量G-M"GZ+2)#缓冲液研磨( 用夹有一层棉花的
纱布过滤!)K差速离心!收集沉淀( 沉淀用 #2$g
M/M洗涤后!用少量 G-M 重悬( 再用 ,#g %g蔗
糖连续梯度离心!收集病毒带!G-M洗涤后 )K保存(
$2"2,!病毒/1.提取!向病毒悬液中加入等体积
碱解液"#2$ 4>7+HJ$ 15
"
Eb
,
!#2$+ 4>7+H
J$
15E7!
#2#$ 4>7+H
J$
3/F.!UZ$#2&#!,+K保温至澄清(
加入 $#gM/M 至终浓度为 #2%g!加入蛋白酶 S!至
终浓度 #2"% 4:+4HJ$!%%K保温 , 小时( 酚氯仿
抽提后溶于F3中!置于J"#K备用(
$2"2)!GE0扩增!在 1E-N上搜索所有已报道的
-D1Gm的序列!在序列两端合成F
4
值在 #K以上的
引物"表 $#!根据ZW等人,%-在 $**&年报道的-D1Gm
基因组部分序列确定这些基因的相对位置!对基因间
序列进行长片段 GE0扩增( 待测序拼接完成后!根
据测序结果设计引物扩增验证已知序列部分(
表 ;序列名称 LP9P-59e号 基因组中方向 引物名称 引物序列 扩增片段编号!
U@ j+#&))2$ a
U@(WU E...F.EEL..LE.E....E....EFL.F $#
U@(R>89 .L.LF...FFFEE..FFELFE.F..LEE.L $
U$# .^ #,))$#2$ J
U$#(WU E..LE....ELEE..FF.L...FEE...E "
U$#(R>89 ELEELF.FF.E......LEEE.EF..E..F $
)# .^ #%&*"*2$ J
)#(WU .LELLFEFEL.FFFE..LE.FE.E.EFLL ,
)#(R>89 ...FE.FEFLL...EFLLELLLL...E.F "
* /l",$,))2$ J
*(WU FFF.LFFL.L.F.FLFFLLL.FLLEL.LF )
*(R>89 .EFELEE.FEEE..E.F.FEFE..EF... ,
& /l",$,),2$ a
&(WU ELFFFFEEFELFE.E.E.F.FELFFFFEF )
&(R>89 F.FELEELE.E.FFELFEFE..E..E... %
RU>7 .^#&$&)2$ a
RU>7(WU L.L.EEELE.E..FFF.E.EL.E..FFE %
RU>7(R>89 LE...LLFF.E....FLLEFEFFL....E
65U .^ #)%*,2$ J
65U(WU F.E..FELLLFFEFLLF...LLE.E.E.FE +
65U(R>89 FF....FLF.LEEEFE..FE.E.LF.LL.
7PQ _$$%)2$ J
7PQ(WU L.FFFLFFF.FF.L.E.LFL.ELLFFFEE. &
7PQ(R>89 F.ELEE.FLFEFLEEE.FFFLFFFLLF.F +
$$* .^ #%&*"&2$ J
$$*(WU ..FFF.FE.LFFFL.L.FFELFE.FFFLEE *
$$*(R>89 EE.FFFLF..FEF.FFELFLEE.LLFF... &
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P:O(WU LEELFEFE.EFFFFF.F.FLFE.EE...F $#
P:O(R>89 LELFFFF.EFFFFFF.EF.FFFFEELF.LL *
!!
!
$片段编号相同的为扩增该片段时的上下游引物
GE0体系为病毒 /1."# 9:!引物"$#
!
4>7+
H
J$
#各 $2
!
H!R1FG""2%44>7+H
J$
P5=@#)
!
H!
F@PB4>M=6P9O6Q6=H>9:GE039?T4PC6Y#2%
!
H!配套
$#"-WQPB%
!
H!反应体系 %#
!
H( 反应条件按说明书
中对应预计片段长度的程序设置( $2%g琼脂糖凝胶
电泳后切胶回收后送上海立菲生物技术公司测序(
$2"2%!基因组分析!测序后获得的原始序列用
/1.DO5B软件的 DPX459 工具进行序列拼接!得到
-D1Gm广西株的全基因组序列( 再利用 M>QOAPBT网
站 L^313Mm# " @OU$\\8882D>QOAPBT2=>4\572@O4#
对其功能基因进行预测!将含有起始密码子和终止
密码子且氨基酸序列长度不小于 %# 55的序列认定
,$
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
为功能基因( 对预测的功能基因用 1E-N的 -75DOU
工具预测基因的功能( 利用 MM0ZW9OPB软件对该序
列内的 MM0位点进行检索!检索标准为$含一二
三四五和六核苷酸类型的简单序列重复基序的最
小重复数分别为 &),,, 和 , 次( 本文中主要搜
索完全重复型 MM0位点!循环排列或成反相互补的
MM0被当作同一种!例如 E.F重复基序包括 E.F
.FEFE..FLFL.和L.F(
"!结果与分析
>2;<基因组基本特征
油桐尺蛾核型多角体病毒广西株基因组"LP9(
-59e .==PDD6>9 1>2SC*&&&"#全长 $"$ "& AU!LE
含量为 ,2+g"图 $#( 对基因组序列进行功能基
因预测!共预测到 $,$ 个开放阅读框"b0^ #!基因组
中b0^ 区域的LE含量为 ,&2"+g!与整体LE含量
相近( 对这些b0^ 进行功能注释后!将注释为多角
体蛋白"U>7T@PRB69#的基因标注为 b0^($!其起始密
码子的.位点标注为基因组的 $ 号位!并将其转录
方向定为基因组正链!后续基因顺序编号( 将能够
注释的基因编号用注释的基因名替换!没有注释到
的基因仍使用基因编号( 最终获得了 &+ 个可以注
释到的基因!占总基因数的 2)g(
图 $!油桐尺蛾核型多角体病毒基因组物理图谱
)$
第 % 期 罗!辑!等$油桐尺蛾核型多角体病毒广西株全基因组序列
广西株基因组中绝大部分基因都是顺序排列在
环状/1.上!基因间有一定的间距!但其中有 "" 处
存在重叠的区域( 重叠区域可以分为两类!一类是
相邻的两个基因位于/1.同一条链上!由于阅读框
的差异形成的重叠!这样的区域有 $# 处*另一类是
相邻的两个基因分别位于/1.正负两条链上!由于
转录方向的差异形成的重叠!这样的区域有 $" 处(
值得一提的是!在 $" 处分别位于两条链上的重叠
中!有 " 处是完全重叠!即一条链上的基因完全包含
在另一条链上对应位置的基因中( 而这两处完全重
叠的区域均表现为一个较长的基因是已知的功能基
因!另一个较短的基因为功能未知的基因(
>2><重复序列分析
在杆状病毒基因组中存在两种重复序列!一种
为简单重复序列"D64U7PDPXWP9=PBPUP5OD!MM0#!其
为 $ 个核苷酸为重复基序的重复序列*另一种
为同源重复序列 " @>4>7>:>WDBPUP5OPR DPXWP9=PD!
Z0M#!其是由一个或几个长的重复基序连续或间隔
或反向排列而成的重复序列(
在油桐尺蛾核型多角体病毒的基因组中!共搜
索到符合条件的 MM0位点 $+) 个"表 "#( 其中包括
单核苷酸重复基序 个!二核苷酸重复基序 "% 个!
三核苷酸重复基序 ++ 个!四核苷酸重复基序 " 个!
五核苷酸重复基序 , 个!六核苷酸重复基序 $ 个(
这些序列中最多的重复基序是 .\F!然后依次是
.FF\..F!FLF\.E.!E.F\.FL和 .F\F.!这些重
复基序占总数的 &$2g( 三个及以下核苷酸重复
基序占 MM0位点总数的绝大多数!达到 *2g*而
四个及以上核苷酸重复基序总共仅有 个!占总数
,2)g( 在所有 MM0位点中!重复基序的碱基组成存
在一定的碱基偏好性!在六类重复基序中均以富含
.F的重复基序为主( 特别是单核苷酸四核苷酸及
六核苷酸基序!均为 .F两种核苷酸组成( 从重复
基序的重复次数上看!这些 MM0的重复度并不高!单
核苷酸的重复次数为 & $# 次!二核苷酸的重复次
数为 ) $$ 次!三核苷酸的重复次数为 , $$ 次!
四核苷酸的重复次数均为 , 次!五核苷酸的重复次
数为 , ) 次!六核苷酸的重复次数为 , 次(
在油桐尺蛾核型多角体病毒基因组中只有一处
Z0M位点!其位于"#F<--K 和G,F<- 基因之间"$#$ #+#
J$#" ,$+#!长度 $ ")& AU!LE含量仅有 ,#2#)g!
低于基因组的整体水平( 通过对其序列的分析发
现!此段序列的两端为一 %* AU片段或其一部分组
表 ><油桐尺蛾核型多角体病毒66A类型及数量
MM0重复基序 MM0数量 重复基序的比例
单核苷酸 ,+2*g
.\F $##g
二核苷酸 $)2)g
.F\F. $% #g
.E\LF * ,g
LE\EL $ )g
三核苷酸 ))2,g
.FF\..F "& ,2)g
FLF\.E. $+ ""2$g
E.F\.FL $ "#2&g
LLE\LEE + *2$g
FLE\LE. ) %2"g
FEL\EL. , ,2*g
LLF\.EE " "2g
四核苷酸 $2$g
FFF.\F... " $##g
五核苷酸 $2+g
F.FFF\...F. $ ,,2,g
..FFE\L..FF $ ,,2,g
..FFF\...FF $ ,,2,g
六核苷酸 #2g
.F.F..\FF.F.F $ $##g
成的重复序列!各重复序列顺序相连"图 "5#( %.端
有 $" 个重复序列!,.端有 + 个重复序列( 此段序列
并不是完全重复序列!在 %* AU 的片段中!有 * 个位
点存在一定的变异!但这些位点的变异大多都只有
两种碱基的差异( 虽然每个差异位点的变异较少!
而组合成重复片段后则变异较多!也就是说每个差
异位点的变化并不与其他差异位点相关!在具有完
整序列的 $% 个重复片段中!有 $# 种不同的重复
序列(
位于Z0M中部的一段序列"$#$ +") J$#$ *%*#!
并不是由上述重复片段组成!而是由一段与重复片
段无关的 ", AU 片段组成( 此片段的首尾各有 $,
AU的片段为反向互补序列!且序列中有多处 , +
AU的反向互补序列!因此其可能形成一结构较为稳
定的发卡结构"图 "A#!如形成预测的结构其自由能
可达J)+2$ e=57+4>7J$(
,!讨论
核型多角体病毒的核酸为双链环状 /1.!大小
一般在 &# $&# eA之间( 与其他生物相比!其基因
组很小!因此基因在基因组中的排列较为紧凑( 相
对于真核细胞生物存在大量的内含子和非编码
/1.
,-
!杆状病毒的基因组中仅有少量的非编码区!
而绝大部分序列都是基因的编码区,+ J&- ( 油桐尺蛾
%$
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
5$重复序列的比对"黑色为同源性大于 +#g的碱基!灰色为同源性大于 %#g的碱基#*
A$Z0M中部非重复序列部分二级结构预测
图 "!油桐尺蛾核型多角体病毒基因组Z0M位点结构
核型多角体病毒的基因组也不例外!无论是用高通
量测序的方法获得的武汉株,)- !还是本研究用 M59(
:PB测序获得的广西株!都具有相同的特点(
经过前人的研究发现!杆状病毒虽然种类繁多!
不同种类的基因数量基因种类基因分布也不尽相
同!但有 ,+ 个基因是这些基因中的核心基因!在不
同杆状病毒中都存在!并且起着相同的作用,* J$#- (
这些基因参与病毒生命循环的一些关键环节!包括
病毒经宿主吞服后的侵染过程与宿主细胞的相互
作用核酸复制与转录病毒粒子的包装组装释放
等( 与文献中的核心基因比对后发现油桐尺蛾核型
多角体病毒中这 ,+ 个基因均存在!但其在基因组中
的分布并不均匀!有超过一半的核心基因分布于基
因组 )# &$ eA之间!其余基因在基因组中基本上
均匀分布( 由于这些基因是病毒的核心基因!所以
其在不同种类间具有一定的差异!而在相近种类间
相对保守!因此可以用这些核心基因作为构建进化
树的序列!分析不同杆状病毒间的亲缘关系( 通过
相同种类不同地理株系之间的序列比较发现!即便
是这些参与重要过程的核心基因!其不同地理株系
间仍存在一定的差异,$$- ( 与武汉株相比!广西株油
桐尺蛾核型多角体病毒虽然基因组同源性高达
*&c+"g!但其核心基因也存在着一定的差异$有 )
个核心基因出现了蛋白长度上的差异!包括 2$F$
第 % 期 罗!辑!等$油桐尺蛾核型多角体病毒广西株全基因组序列
I2F<-"#F<..2$F的差异( 在这 ) 个核心基因中!I2F<-"#F<.. 两个基
因分别与武汉株仅相差 , AU 和 * AU!差异不大*而
2$F差 $", AU!后者则相差 "#) AU( 序列比对后发现I2F<
-"#F<.. 以及2$F简单重复序列的插入与缺失造成的!而前两者是分
别差异一个和三个三核苷酸基序!2$F核苷酸重复基序中相差一个基序!从而导致的移码
突变( 2$F缺失!而这一段序列并没有类似于发卡重复等的特
殊结构(
除了这些相对保守的核心基因外!杆状病毒的
其他基因则表现出较大的差异!这很大程度上归因
于病毒的高适应性以及快速的进化!而这样的特点
在以鳞翅目幼虫为宿主的杆状病毒中表现得尤为突
出,$" J$)- ( 即便是同一个基因!在侵染同属宿主的不
同杆状病毒中也可能存在着较大的差异( 以多角体
蛋白基因为例!在甜菜夜蛾核型多角体病毒" BG"<
3"G&$#( $V,A4( 1Gm!MP1Gm#草地贪夜蛾核型多角
体病毒"BG"3"G&$#( F#4A,G$#3( 1Gm!MB1Gm#以及海灰
翅夜蛾核型多角体病毒"BG"3"G&$#( 2,&"#(2,%1Gm!M7(
1Gm#中就有较大差异,$% J$+- ( 此三种病毒侵染的宿
主同属于灰翅夜蛾属!但据其多角体蛋白基因构建
进化树后发现!M71Gm与其他两种病毒并不位于进
化树的同一分支上!而且相距较远( 差异也不仅仅
存在于不同种类间!在同种病毒的不同株系间也会
存在差异( 对比家蚕核型多角体病毒的 个株系!
在预测到的 $,% 个基因中有 )% 个基因至少有一个
株系存在蛋白长度上的差异!而差异最大的基因相
差 "$# AU,$$- ( 油桐尺蛾核型多角体病毒广西株与
武汉株之间也存在这样的差异!其中有 个基因仅
在一个株系中存在!另外!存在蛋白长度差异的基因
达 $, 个!差异最大的达 ,# AU( 这些差异的存在一
方面可能是由于病毒宿主的地理差异!另一方面可
能是由于病毒与宿主间协同进化过程中的相互作用
导致的(
参考文献!
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的取食选择性初探,k-2广西林业科学! "#$$! )#")#$ ,"& J
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,,- 罗!辑! 周国英! 朱积余2核型多角体病毒基因组学研究进展
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