全 文 ：第 8 卷第 1 期
19 8 6年 8月
于 南 大 予 李 报 v o工。 S N o 。 1
J o u r o a l o f y… a . U . i v e r s泛t l M a r 1 9 8 6
思茅松毛虫核型多角体病毒病的研究
杨大智
( 云南大学生物系 )
王用贤 李燕青
(云南省林业厅营林处 )
关键词 思茅松毛虫 , 核型多角体病毒 , 形态学 , 感染致病力
摘 要 本文报道思茅松毛虫核型多角体病毒 ( D e n d r o l i nr u s K ik u e h i i M a t -
s 。 m u r a N u 。 l e a : P 。 ly h e d r o s i s v i r u s ) 的形态学及其感染致病死亡率的试验研究 .
思茅松毛虫核型多角体病毒 ( D K M N P V ) 的多角体呈不规则的多边形 , 有三角形 , 四
边形 , 五边形及六边形等多种形态 . 多角体大小不一 , 其直径为 1 . 3 ~ 3 微米 , 平均直径 1 · 8
微米 . 病毒粒子单个或成束存在 . 单个病毒粒子大小为 41 。士 1 0 x 40 士 3 毫微米 . 病毒束平
均直径为 1 96 毫微米 . 根据 1 9 7 5年第三届国际病毒学会议上提出的病毒分类系统 , 这种病毒
应属于杆状病毒科 , A 亚群 ( 属 ) 的一个种 。
生物测定结果表明 D K M N P V 对 3 龄思茅松毛虫的幼虫有感染致病力 . 其致病死亡率为
4 3
.
9 3 ~ 6 8
.
2 1%
, 半致死 中浓度 L D 。 。为 1 x 10 “ ` “ 多角体 /毫升 . 幼虫的感染死亡率 , 随多
角体浓度的增大而增加 .
思茅松毛虫属于鳞翅目枯叶蛾科的一个种 ( D en d lo c枷 : : k f无讹币1 M a t s u m ur a ) , 分布于
台湾 、 云南 、 四川 、 广东 、 广西 、 湖南 、 江西 、 浙江和安徽等省 . 主要为害思 茅 松 、 云南
松 、 云南油杉 , 海南松及马尾松等用材树种 〔川 “ ’ . 在云南的思茅 、 普洱 、 景东 、 景谷 、 墨江 、
澜沧 、 曲靖 、 陆良及昆明西山 , 安宁等地区 . 泛滥成灾 , 猖撅危害 . 严重地影响我国主 要用
材树种 的速生丰产及群众的生产和生活 . 由于 长期使用化学农药 , 使害虫产生抗药性 , 杀灭
害虫灭敌 , 导致害虫为害周期缩短 . 化学农药污染环境 , 影响人民健康及家禽家畜的安全 .
为寻找对松毛虫的有效防治途径和开发利用昆 虫病毒资源 , 开展了昆虫病毒的研究 .
材 料 和 方 法
一 、 材料来源
思茅松毛虫病毒材料 , 系王用 贤同志于 1 9 8 0年 9 月在曲靖地区海寨材场 , 下东山林区采
到的 自然催病虫尸标本 , 经室内扩大繁殖后分离提取 . 感染试验幼虫 , 系野外采集思茅松毛
虫卵块 , 经表面消毒后 , 室内孵化 、 饲养到 3 龄 。
1 0 5
二 、 方法
1
、 多角体病毒的分离与提纯 :将催病死亡的思茅松毛虫幼虫虫尸 , 置于试管内 , 加入
适量无菌水 、 静置 , 待其组织 自然腐解释放出多角体后 . 用双层纱布过滤 , 除去组织残块 .
滤液经 2 5 0 0一 4 0 0 0 转 /分 , 离心 30 一60 分钟 , 去上清液 . 沉淀加入适量无菌水或 50 %甘油 ,
反复离心洗涤数次 , 获得初步提纯的多角体 . 其进一步提纯 , 采用蔗糖密度梯度法 . 多角休
含量 , 可 用血球计数器测定 .
2
、 核型多角体鉴别 : 取感病幼虫 , 进行腹足放血涂片 , 用什维佐娃法染色镜检 .
3
、 感染力试验 : 取多角体悬液 , 按其含量稀 释成所需浓度 , 加入 20 %吐温 一 20 作粘着
剂 。 用笔涂于油杉叶片上 , 晾干后饲 虫 。 24 小时后换无病毒新叶 。 逐 日记录幼虫感染死亡情
况 . 为证实幼虫是否属于病毒感染死亡 , 需腹足放血涂片镜检 . 有多角体者 , 计为病毒感染
死亡 。 每个浓度重复 3 次业设对 r 飞。 对照用无菌水加 20 %吐温同法饲虫 。
结 果
一 、 病症
感病初期 , 幼虫无明显症状 。 中期 , 幼虫出现明显症状 , 表现为行动迟缓 , 食欲减退 ,
反应迟钝 , 腹足内侧出现暗红色斑点 . 感病后期 , 幼虫爬上枝梢 , 停止取食 , 逐渐死去 , 死
亡幼虫多数以尾足抓住小枝 , 倒挂于枝梢上 . 体色由淡黄变为深褐色 . 腹部及腹足变为紫红
色 . 躯体柔软 , 内部组织液化 , 体壁变脆 , 触之即破 , 流出黄褐色液体 . 初死幼虫无臭味 .
感病幼虫个体较健康幼虫落后 1 一 2 个龄期 .
二 、 多角体存在于宿主细胞核内
取感病濒死幼虫的中肠及气管基质作超薄切片 , 电镜下观察 , 两种组织的细胞核内 , 都
充满了多角体 , 且细胞核明显膨大【图 5 ]
三 、 病毒形态特征
多角体 : 』恩茅松毛虫核型多角体病毒的多角体呈不规则的大小不等的立方多面体 . 在透
射电镜下 , 多角体呈不规则的多边形 , 其大小不等 . 有三角形 , 四边形 , 五边形及六边形等
多种形态 . 最小多角体直径为 1 . 3微米 , 最大为 3 微米 , 平均直径为 1 . 8微米L图 1 ] . 多角体
折光性很强 , 在暗视野及相差显微镜下观察 , 很明亮 , 轮廊清晰 。 多角体经伊红染色后 , 在
光学显微镜下呈现粉红 色 。
病毒 : 在透射电镜下观察感病的思茅松毛虫的中肠及气管的超薄切片 , 病毒粒子呈杆状
包埋于组织细胞的细胞核内多角体中 , 病毒束分单粒包埋与多粒包埋 . 最少的病毒束内有 1
个病毒粒子 , 最多的一个病毒束内有 9 个病毒粒子 。 一般为 2 一 8 个病毒粒子 . 单粒包埋与
多粒包埋病毒束同时存在一个多角体内 . 病毒粒子被两层膜所包围 . 最外层为外膜 , 最内一
层为紧身膜 ( 内膜 ) . 多粒包埋的病毒粒子 , 它们有共同的外膜 . 最小病毒束直径为 13 6 毫
微米 , 最大的病毒束直径为 2 38 毫微米 . 平均直径为 19 6毫微米 . 包埋在多角体病毒束内的病
1 0 6
毒粒子 , 杆状 , 长为 40 0一42 0毫微米 , 宽为 3 7一43 毫微米 . 平均大小为4 10 士 10 丫 4 0士` 3毫微
米 t图 2 、 3 、 4 ] .
四 、 感染力
病原性是各种病原微生物的一个很重要的特性 . 昆虫病毒感染致病率在害虫的防治实践
上具有很重要的意义 . 用 1 x 10 1 义 1 0 X 1 0
毒 , 对 3 龄室内饲养的思茅松毛虫幼虫 ,
重复 3 次共 1 50 条幼虫 . 业 设对照 3 0 条 ,
进行感染试验 ,
1 x l o
, 多角体 /毫升核型多角 体 病
4 个浓度共 6 0 条幼虫 . 每个浓度
结果表明 , 思茅松毛虫核型多角体病毒对幼虫感染
致病死亡率为 4 3 . 9一 68 . 2% . 致死 中浓度 L D 。 。为 1 x 10 5 ’ 。 多角体 /毫升〔表 1 〕 .
表 1 思茅松毛虫核型多角休病毒感染力试验
试虫数 活虫数 死虫数 总活虫数总死 虫数 死亡 %
( 3 次重复 )
1 x 1 0 7 4 8 0 4 8 3 8 1 1 2 7 4
。
6 7 6 8
。
2 1
4 8 1 8 3 0
5 4 2 0 3 4
I X 1 0
6 5 0 2 1 忿7 6 0 9 0 6 0 。 0 0 4 9 。 8
4 2 2 1 2 1
5 0 18 3 2
1 x l 0
5 5 0 2 4 2 6 6 6 8 4 1 5 6
.
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… 4 4 。 85 0 2 2 2 8
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讨 论
根据电镜观察结果表明 , J思茅松毛虫多角体病毒与 1 9 7 5年第三届国际病毒学会议上提出
李Q7
的昆虫病毒分类系统 中 , 杆状病毒科 A 亚群 `属 ) 的一些特征相符〔表 2 〕.
表 2 思茅松毛虫核型多角体病毒与杆状病毒科 A 亚属特征比较
病 毒 毒粒 子形状
杆状病毒科 A 亚属
钟娜弊 ( :青袒吐 l’ .畔奸赞 ( _毫微半
0
.
5一 1 5
思茅松毛虫核
角体病毒
型多 …3一 3
细胞核内 } 4 0一 7 0 “ “ 5 0一 4 0 0
— - 一 ! 一一 - - - - 一 - - 一细胞核内
1
37一` 3 · ` 0 0一` 2 0
杆 状
杆 状
关于昆虫病毒 的分类 , 高尚荫教授和史密斯 ( S m iht , K . M . ) 等 {。 l指出 , 根据包涵体的
有无 , 形态和生成部位等特点 , 大体上可将昆虫病毒分为五大类 . 这种分类方法是在研究昆
虫病理学时 , 病毒只作为病原体对待而历史地形成的 , 然而随着昆虫病毒种类和数量增加及
电镜技术使用和分子生物学的进展 , 对昆 虫病毒的性状有了更多的了解 , 这就为昆虫病毒的
分类创造了必要条件 . 1 9 7 0年国际病毒分类命名委员会 ( I C N V ) 根据病毒粒子核酸的化学
性质 , 核衣壳对称性及囊膜的有无和立体对称病毒的介面作分类标准 , 将昆 虫病毒分为六个属
与一个质型多角体病毒组 。 其中 , 杆状病毒属又分为 A 亚组 (核型多角体病毒 ) 及 B 亚组
(颗粒体病毒 ) ! ’ ,川 . 1 9 7 5年第三届国际病毒分类委员会根据该会提 出第二个报告 , 将昆虫病
毒分为七个科 . 其中核型多角体病毒科下设三个亚群 (属 ) , 除核型多角体病毒和颗粒体病
毒外 , 另增加了 C亚群 ( 非包含体病毒 ) 〔` 。 1 . 根据这个分类系统 , 杆状病毒科 A亚群 ( 属 )
核型多角体病毒的特点是 : 包涵体呈多角形 , 直径为 .0 5一 15 微米 , 每个多角体内含有多个
病毒粒子 . 病毒粒子杆状 , 其大小为 40 一70 x 2 50 一 4 0 毫微米 , 外有衣壳 , 内有电子致密的
髓核 , 多角体寄生在宿主细胞核内 . 而思茅松毛虫病毒的包涵体呈多角形 , 直径是 1 . 3一 3微
米 . 病毒粒子包埋在多角体的病毒束中 , 外有两层衣壳所包围 . 病毒束内含有 1 一 9 个病毒
粒子 , 病毒粒子杆状 , 大小为 4 10 士 1 0 又 40 士 3 毫微米 , 多角体寄生在思茅松毛虫幼虫体内
细胞核内 , 其他特征均相一致 . 据此 , 思茅松毛虫病毒应属于杆状病毒科 A 亚群 ( 属 ) 的一
个种 。
昆虫病毒是一类能引起昆虫致病而导致死亡的一种病原体 . 在自然界 , 由于病毒的传染
流行而造成害虫的成片或大面积死亡 , 在大发生年代 , 可将害虫抑制到为害程度 以下 . 若能
人为地加以利用 , 向有害虫的林间引入病毒或让林间存留相当数量的病毒原 , 就能控制害虫
的危害 . 特别是昆虫病毒产量可高达虫体干重的2\0 一 30 % 以上 『6 ’ , 象思茅松毛虫这一类个体
极大的害虫 , 用土法就地人工感染致病后 , 收集虫尸 . 经捣碎 , 加适量水稀释过滤后 . 滤液
就能直接用于防治害虫 。 生产容易 , 、 使用方便 , 成本低廉 。 一般林场均能办到 .
昆虫病毒不仅是一种很理想的生物杀虫剂而且昆虫病毒是生命有机体的原始形态 , 开展
昆虫病毒研究可以加深对生命现象的理解 . 特别是昆虫病毒的种类多 , 产量高 , 实验 昆虫采
用人工饲料 , 可以廉价大量繁殖 , 随时可以提供大量的病毒材料 , 是分子生物学基础理论研
究的极好材料 . 云南地形气候复杂 , 昆虫种类繁多 , 昆虫病毒 资源丰富 . 因此开展对昆虫病
毒的开发利用研究 , 不仅实践上而且在理论上也具有重 要意义 .
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。
K E Y W O R D S
: D e n d r o l i m u s K ik u e h i i M a 之s s u m u r a ; n u e l e a r p o l了h e d r o s i s
v i r u s ; M o r p h o l o g y , i n f e e t i o u s l e t h a l i t y
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· 毕业生优秀论文摘要 ·
一种新的电化学分析方法一海洛因的快速微量分析
化学系85 届学生 王红华 周红娇 , 指导教师 王昌益
获奖等级 : 校级学生优秀论文
摘 要 有机胺中的氨基 ( 一 N H : ) 若 氮上的孤对 电子不能离域形成共扼 体系则此氮呈
碱性 , 可 以进行酸碱滴定 . 海洛因 ( h er io n , 即二乙酞吗啡 ) 属于此类物质 , 利用一种新的
电化学分析法一介面 电化学法 , 在非水界质中用苦味酸对海洛因行酸碱滴定 , 测定海洛因的
含量 . 仪器用江苏 电分析仪器厂生产的 D D一 ZB 型电极电位仪和电磁 搅 拌 器 , 还 有 微 量
( 1 0 0川 ) 注射器 。 试剂用苦味酸 ( A 。 R 。 ) 、 辛可宁 ( A . R . ) 或阿托品 ( A . R 。 ) 、 氯 仿
( A
.
R
.
)
. 操作方法 : ①称取约 0 . 215 9 苦味酸 ( 含水 35 % ) 用氯仿溶于 50 m l 容量瓶中稀 释
至刻度 . ②准确称取约 2 m g 辛 可宁 , 用 7m l 氯仿溶解于小烧杯中 , 然后用注射器每次注 入
10 0时苦味酸氯仿液 . 用第二阶导数法求得终点体积 . ③准确称取海洛因 2 m g 左 右 , 溶 于
7 m l 氯仿中 , 用标准苦味酸氯仿溶液 ( N 苦 ) 进行电位滴定 , 按第二阶导数法求得 终 点 体
积 V e 。 海洛因的含量 W 可用公式 W = N 苦 V e E 海洛 因计算 。 ( 王元平摘 )