全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(6): 971−979 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31171578), 黑龙江省高校科技创新团队建设计划(2011TD005), 国家高技术研究发展计划(863计划)
项目(2008AA10Z153)和黑龙江省科技厅重大攻关项目(GA06B103)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 朱延明, E-mail: ymzhu2001@neau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: wangzhenyu128@163.com
Received(收稿日期): 2011-11-17; Accepted(接受日期): 2012-02-22; Published online(网络出版日期): 2012-04-06.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120406.0947.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00971
野生大豆 GsGST19基因的克隆及其转基因苜蓿的耐盐碱性分析
王臻昱 1,2,3 才 华 1 柏 锡 1 纪 巍 1 李 勇 1 魏正巍 1 朱延明 1,*
1东北农业大学植物生物工程研究室, 黑龙江哈尔滨 150030; 2 中国科学院东北地理与农业生态研究所, 吉林长春 1300112; 3 中国科学
院研究生院, 北京 100049
摘 要: 谷胱甘肽 S-转移酶对植物抵御逆境胁迫和解除细胞毒素起着重要作用。本研究从野大豆盐碱胁迫基因表达
谱中筛选并克隆得到 GsGST19 基因, 将其转化苜蓿, 获得超量表达的转基因苜蓿, 并对转基因苜蓿进行耐盐碱性分
析。结果显示在正常培养条件下, 转基因苜蓿株系 19-4和 19-9的 GST酶活性分别是非转基因株系的 1.52倍和 1.49
倍。在 100 mmol L–1 NaHCO3处理 14 d后转基因株系生长状态良好, 而非转基因对照株系明显萎蔫、失绿、甚至死
亡; 转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性显著低于非转基因株系(P<0.05), 而叶绿素含量和根系活力显著高于
非转基因对照(P<0.05), 说明超量表达 GsGST19基因增强了苜蓿的耐盐碱能力。
关键词: 谷胱甘肽 S-转移酶(GST); 转基因苜蓿; 野大豆; 耐盐碱性
Isolation of GsGST19 from Glycine soja and Analysis of Saline-Alkaline Tole-
rance for Transgenic Medicago sativa
WANG Zhen-Yu1,2,3, CAI Hua 1, BAI Xi 1, JI Wei 1, LI Yong 1, WEI Zheng-Wei 1, and ZHU Yan-Ming 1,*
1 Plant Bioengineering Laboratory, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2 Northeast Institute of Geography and Agroecology,
Chinese Academy of Sciences, Changchun 130012, China; 3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: Alfalfa (Medicago sativa L.) is one of the most important leguminous forage crops worldwide. Saline-alkaline stress
significantly limits the productivity of alfalfa due to its adverse effects on growth, formation of nodules, and symbiotic nitro-
gen-fixation capacity, and resulting in the formation of reactive oxygen species (ROS). To protect plants from the toxicity of reac-
tive oxygen, aerobic organisms are equipped with an array of defense mechanisms, including one based on glutathione
S-transferases (GSTs). Glutathione S-transferases (GSTs) are ubiquitous enzymes that play a key role in stress tolerance and cel-
lular detoxification. The GST gene GsGST19 isolated from wild type soybean (Glycine soja) under saline-alkaline stress was
transformed into alfalfa (Medicago sativa L.). Transgenic alfalfa plants showed 0.52–0.49 times higher levels of GST activity than
wild type plants. Transgenic alfalfa grew well in the conditions of 100 mmol L–1 NaHCO3, while wild type plants exhibited dis-
coloration and stunted growth, or even death. There were significantly changes in malondialdehyde content and relative mem-
brane permeability caused by saline-alkaline stress in non-transgenic lines compared to transgenic lines (P<0.05). Moreover,
compared with non-transgenic, transgenic alfalfa had higher levels of chlorophyll content and root activity under saline-alkali
stress conditions. The results indicated that the gene GsGST19 could enhance resistance to saline-alkaline in alfalfa.
Keywords: Glutathione S-transferase; Transgenic alfalfa; Glycine soja; Saline-alkaline stress
紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培最广、
最主要的豆科牧草之一 , 在我国的种植面积约有
133万公顷[1]。苜蓿作为主要的栽培牧草, 是农牧结
合的纽带, 其生产状况对整个农业产业结构中的种
植业、畜牧业及加工业等都会产生重要影响。紫花
苜蓿营养丰富, 蛋白含量高, 各种氨基酸组成均衡,
适口性强, 各种牲畜均喜食用。因此, 苜蓿作为牧草
在畜牧业生产中占有重要的地位, 素有“牧草之王”
的美誉。近年来, 随着我国畜牧业的发展, 对优质苜
蓿的需求进一步加大。但由于土壤盐碱化, 极大制
972 作 物 学 报 第 38卷

约了苜蓿产业的发展。因此亟需培育耐盐碱性强的
苜蓿品种, 满足日益发展的畜牧产业的需求。
我国松嫩平原西部现有盐碱化土地面积 373万
公顷, 是世界三大片苏打盐碱地集中分布地区之一[2]。
该地区土壤中含有大量的碱性盐 NaHCO3和 Na2CO3,
这种土壤对作物不但会产生渗透胁迫和离子拮抗作
用, 而且会因 HCO3–和 CO32–离子造成 pH 值升高引
起混合毒害作用。此外在盐碱胁迫条件下, 植物细
胞会产生大量的氧自由基, 导致膜脂成分改变, 光
合作用元件受到破坏。为了保护细胞免受活性氧的
毒害, 植物体内形成了一系列的酶促和非酶促反应
机制[3], 其中通过谷胱甘肽 S-转移酶(GST)调节细胞
内氧还原平衡, 是降低盐碱胁迫对植物造成的氧化
损伤的有效途径之一。
植物谷胱甘肽 S-转移酶(GST)普遍存在于植物
体内, 由一个庞大而高度分化的基因家族编码。这
类酶能够催化谷胱甘肽(GSH, γ-Glu-Cys-Gly)与生物
异源物或细胞过氧化物结合, 以促进这些底物的代
谢、区域化隔离或将其彻底清除。大量研究表明 ,
GST 能够增强植物对干旱、低温、机械损伤、盐碱
胁迫等多种逆境的耐受能力。Roxas等[4]研究发现,
超量表达GST/GPX基因, 可促进转基因烟草幼苗在
冷胁迫和盐胁迫条件下的生长, 而这种现象可能是
谷胱甘肽库中高含量的氧化型谷胱甘肽造成的。
George 等[5] 葇从 荑牧豆树——一种耐干旱的豆科树
种中分离到 1 个 PjGSTU1 基因, 并将其转化烟草,
发现转 PjGSTU1 基因烟草株系在 15% PEG 胁迫下
生长状态优于非转基因烟草生长; 应用 GFP 融合技
术研究其亚细胞定位, 发现该蛋白位于转基因烟草
的线粒体中; 由于 PjGSTU1 的表达产物具有过氧化
物酶活性, 并且定位于线粒体, 说明该基因可能具
有 ROS清除作用。Huang等[6]研究发现插入 GST基
因可增强转基因拟南芥的耐寒性。Zhao 等[7]应用农
杆菌介导法将盐地碱蓬的 GST 和 CAT1 基因一起转
入水稻品种中花 11 后, 转基因水稻耐盐性提高, 同
时研究发现, 转基因水稻不但 CST和 CAT酶活性提
高, 而且 SOD 酶活性也得到提高, 从而其活性氧清
除系统增强, 抗氧化的相关蛋白含量提高。Dixon等[8]
研究发现 , 大豆根瘤中含有丰富的 GSTs, 这些酶
具有抗氧化防御功能, 并且对固氮具有重要的支持
作用。
Ge 等[9-10]选用采自吉林省白城市盐碱地的野大
豆为试材, 应用基因芯片技术建立野大豆盐碱胁迫
基因表达谱, 并构建了盐碱胁迫基因调控网络, 从
中筛选出 28 个位于关键调控节点的胁迫应答基因,
其中包括 3个 GST家族基因。本文通过同源克隆的
方法克隆得到其中 1 个 GsGST19 基因, 并构建由组
成型启动子调控的植物表达载体, 将 GsGST19 导入
苜蓿, 研究发现 GsGST19 显著提高转基因苜蓿的耐
盐碱性。本研究建立的苜蓿分子育种技术体系, 对
于充分利用我国盐碱地资源 , 扩大苜蓿种植面积 ,
提高苜蓿产量和品质, 发展畜牧业, 具有重要的研
究价值和广阔的开发应用前景。
1 材料与方法
1.1 试验材料
野大豆(Glycine soja)(G07256), 采自吉林省白
城市盐碱地。取已发芽的种子置 1/4 Hoagland 溶液
中培养 , 21 d 后 , 用 50 mmol L–1 NaHCO3+1/4
Hoagland胁迫处理, 于胁迫后 0、1、2、3、4、5、6
和 7 h后取新生三出复叶、根末端 3 cm, 提取总 RNA。
大肠杆菌 DH5α、农杆菌 EHA105、植物表达载
体卡盒 pCGBE 均由东北农业大学植物生物工程研
究室构建保存; 克隆载体 pGEM-T 购自 Promega 公
司。野大豆盐碱胁迫基因转录谱由东北农业大学植
物生物工程研究室构建。
1.2 总 RNA的提取和 cDNA第一链的合成
参照 RNAprep Pure Plnat Kit使用说明, 提取野
大豆总 RNA。取 2 µg总 RNA, 应用 SuperScript III
Reverse Transcriptase Kit合成 cDNA第一链。
1.3 GsGST19基因克隆与序列分析
根据葛瑛等[9-10]构建的野大豆盐碱胁迫转录谱,
发现 3个胁迫应答的 GST家族基因, 选择其中 1 个
栽培大豆(Glycine max) GST19的同源基因, 根据在
NCBI 上已发表的栽培大豆 GST19 序列, 应用软件
Primer Premier 5.0 设计包含全长 CDs 的引物
GST19-S和 GST19-AS (表 1)。以上述制备的野大豆
的 cDNA为模板进行 PCR扩增。将目的片段连接到
载体 pGEM-T 上, 测序。引物合成和序列测定均由
博仕生物有限公司完成。
采用 Blastx 程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
搜索序列相似性; 采用 GenScan 软件(http://genes.
mit.edu/GENSCAN.html)结合 ORFfinder程序预测基
因编码区的完整性; 采用 DNAman 软件分析蛋白
质基本性质 ; 采用 NCBI 的 Protein Conservation
Domain 程序分析蛋白保守结构域 ; 采用 ClustalX
第 6期 王臻昱等: 野生大豆 GsGST19基因的克隆及其转基因苜蓿的耐盐碱性分析 973


1.83进行氨基酸序列多重比对及绘制系统进化树。
1.4 植物表达载体的构建
将含有GsGST19基因完全编码区的片段插入植
物表达载体卡盒 pCGBE 中 , 由烟草花叶病毒
CaMV35S promoter 调控, 并且在启动子与目的基
因之间插入 Omega 翻译增强序列, 以 Bar 作为筛选
标记基因, 构建高水平组成型植物表达载体。采用
冻融法将重组质粒导入农杆菌 EHA105, 用于苜蓿
的遗传转化。
1.5 GsGST19 对苜蓿的遗传转化及再生植株的
获得
取苜蓿 8 日龄无菌苗的子叶节作为外植体, 用
含有植物表达载体 pCBE-GsGST19的农杆菌菌液侵
染, 用 0.5 mg L–1固杀草(glufosinate-ammonium, 购
自 Sigma公司)筛选再生植株。将再生植株移栽到草
炭土∶沙土=2∶1 的花盆中, 并于温室中培养(24℃,
600 μmol s–1 m–2, 16 h d–1光照, 80%相对湿度湿度),
用于进一步检测分析。
1.6 转基因苜蓿植株的分子生物学鉴定
以转基因苜蓿植株DNA为模板, 用筛选标记基
因 Bar及其启动子序列设计特异引物, Bar-35S-S和
Bar-35S-AS用于 PCR检测。PCR产物长度为 287 bp。
随机选取部分 PCR 阳性的转基因株系, 进行
GsGST19 转录水平分析。苜蓿总 RNA 的提取及
cDNA第一链的合成方法同 1.2。以 GsGST19基因的
特异引物(RT-19-S, RT-19-AS)用于半定量RT-PCR分
析, 以苜蓿 GPDH (glyceraldehyde-3-phosphate de-
hydrogenase)基因为内参基因[11]。

表 1 本文中使用的引物
Table 1 List of primers used in the study
引物名称
Primer name
序列
Sequence (5′–3′)
QPCR-GAPDH-S GACTGGTATGGCATTCCGTGT
QPCR-GAPDH-A GCCCTCTGATTCCTCCTTGA
QPCR-GST19-S AGAAAGTTCCAGTGCTCCTACA
QPCR-GST19-A TCCCCATACAGCTAACACACAC
GST19-S CTAAAGGTTGAAGATTT AGCAAAAC
GST19-AS AACACTATTTGAAGCCAAACTCC
Bar-35S-S CCTGTGCCTCCAGGGAC
Bar-35S-AS GCGGTCTGCACCATCGTC
RT-19-S TTGTGCCAGGGTAGAATG
RT-19-AS TCAAGTGGTAGCAAAGGG
GPDH-S GTGGTGCCAAGAAGGTTGTTAT
GPDH-AS CTGGGAATGATGTTGAAGGAAG
1.7 盐碱处理下转基因苜蓿的表型分析
将转 GsGST19 基因植株和非转基因植株, 剪取
带有 2~3个节点的茎段扦插扩繁。待茎段生根后, 选
取生长状态良好且一致的扩繁苗 , 移栽到含有蛭
石∶珍珠岩=1∶1的小钵(直径 4 cm, 高 5 cm, 每钵
1株)中, 分别用含有 0、50和 100 mmol L–1 NaHCO3
的 1/8 Hoagland营养液(pH值分别为 7.0、8.0和 8.5)
处理, 每 2 d更换一次营养液, 14 d后观察记录表型。
1.8 转基因植株 GST和 SOD酶活性检测
参照 Rao 等[12]的方法提取苜蓿叶片总蛋白, 略
作改动, 采用考马斯亮蓝法检测蛋白含量, 以小牛
血清蛋白作为标准蛋白。采用参照 Mauch等[13]的方
法检测 GST酶活性, 以还原型谷胱甘肽和 CDNB作
为底物, 1 个 GST 酶活单位为形成 1 nmol min–1
GSH-CDNB 结合产物消耗的酶量。采用 NBT 比色
法检测 SOD 酶活性, 以抑制 NBT 光氧还原 50%消
耗的酶为 1个活性单位[14]。
1.9 转基因植株相关生理指标的检测
采用硫代巴比妥酸 (TBA)比色法测定丙二醛
(MDA)含量, 参照 Gibon 等[15]的方法, 用 DDSJ-308A
电导率仪检测相对质膜透性。参照 Lichtenthaler 和
Wellburn[16]的方法检测叶绿素含量, 略作改动。采用
氯化三苯基四氮唑(TTC)法检测根系活力[17]。
2 结果与分析
2.1 GsGST19基因盐碱胁迫表达特性分析
由基因芯片杂交结果(图 1-A)可以看出, 野大豆
GsGST19 基因在盐碱胁迫条件下, 无论在叶中还是
在根中均为上调表达。而通过Real-time PCR验证(图
1-B)可以看出 , 虽然表达量有所差异 , 但表达趋势
与芯片结果是基本一致的, 说明芯片杂交结果是可
信的。
2.2 GsGST19基因全长的克隆及序列分析
以野大豆 cDNA 为模板, 通过 PCR 扩增得到
796 bp片段, 利用 DNAman软件, 结合 GenScan软
件分析, 该片段包含 1 个 672 bp 的开放读码框, 编
码 224 个氨基酸, 分子量约 26 kD。利用 GenBank
中的 Blastx 程序分析, 该片段与其他植物的谷胱甘
肽 S-转移酶(GST)具有同源性(图 2-A), 应用 ClustalX
1.83软件, 对该片段的预测氨基酸序列进行系统发育
树分析(图 2-B), 发现其与栽培大豆 GmGST19 同源性
最高, 因此将该基因命名为 GsGST19, 已将该基因
提交 GenBank, 登录号为 JQ031560。
974 作 物 学 报 第 38卷



图 1 盐碱胁迫下野大豆 GsGST19表达特性
Fig. 1 Relative expression levels of wild soybean GsGST19 under saline-alkali stress
A: GsGST19芯片杂交结果; B: GsGST19s real-time PCR结果。
A: genechip result of GsGST19; B: real-time PCR result of GsGST19.

采用 NCBI 的 Protein Conservation Domain 程
序对 GsGST19基因预测蛋白的氨基酸序列进行保守
结构域分析, 发现该蛋白具有 Tau 类 GST 亚家族特
征, N-端的氨基酸残基组成相对保守, 具有谷胱甘
肽(GSH)结合位点(G-site); C-端氨基酸组成多样, 具
有与疏水配基结合的活性位点 (H-site)。G-site 和
H-site 的特征性氨基酸由#号标注。G-site 由保守氨
基酸组成, 使其可以稳定地结合 GSH, 而 H-site 的
氨基酸残基组成具有多样性, 使其结构具有较大的
可变性, 从而使这类酶结合的疏水底物具有广谱性。
2.3 目的基因转化苜蓿及转基因植株的分子生
物学检测
将 GsGST19基因插入由 CaMV35S启动子调控,
并含有Omega翻译增强序列的植物表达载体卡盒上,
构建超量表达植物表达载体 pCBE-GsGST19, 载体
如图 3所示, 以 Bar基因作为筛选标记基因。
应用根癌农杆菌介导法将载体 pCBE-GsGST19
导入苜蓿, 应用 Bar 基因及其启动子序列设计的特
异引物 Bar-35S-S 和 Bar-35S-AS, 对固杀草筛选得
到的抗性植株进行 PCR 鉴定, 获得 PCR 阳性植株
17株。
随机选取 5个转基因植株, RT-PCR分析结果显
示GsGST19在转基因苜蓿中均能正常表达(图 4), 而
非转基因对照株系中未检测到转录信号。
2.4 转基因苜蓿耐盐碱表型分析
由于苜蓿的花期较长, 为了在短期内获得足够
的试验材料, 本研究通过茎节扦插扩繁的方式, 获
得了大量可用于生物学研究的转基因苜蓿植株。从
RT-PCR 阳性株系中选取表达量最高和最低的两个
株系 19-4, 和 19-19 (图 4中 1和 3), 将转基因和非
转基因苜蓿分别用 0、50和 100 mmol L–1 NaHCO3
处理 14 d, 结果发现在正常条件下, 转 GsGST19基
因苜蓿与非转基因苜蓿的生长状态并无明显差
异(图 5-A), 而在 NaHCO3胁迫下, 转基因株系 19-4
和 19-19 的生长状态明显好于非转基因株系(图 5-
B~C)。如经 100 mmol L–1 NaHCO3处理 14 d后, 转
基因株系 19-4 和 19-19 均能保持良好的生长状态,
而非转基因对照株系则明显萎蔫、失绿甚至死亡(图
5-C)。
图 6 表明, 所有株系的株高与根长均随盐碱处
理浓度的增大而逐渐下降, 但转基因株系 19-4 和
19-19 的下降幅度均小于非转基因株系, 如在 100
mmol L–1 NaHCO3处理条件下, 转基因株系 19-4和
19-19 的株高分别是非转基因株系的 1.60 倍和 1.35
倍, 转基因株系 19-4 和 19-19 的根长分别是非转基
因株系的 1.59 倍和 1.46 倍, 2 个转基因株系的株高
和根长均显著地高于非转基因株系(P<0.05)。由此进
一步说明转 GsGST19 基因苜蓿具有较强的耐盐碱
能力。
2.5 盐碱胁迫对转 GsGST19 基因苜蓿 GST 和
SOD酶活性的影响
在正常条件下, 2个GsGST19 转基因株系的GST
酶活性分别是未转基因对照株系的 1.52倍和 1.49倍
(图 7), 说明 GsGST19 在转基因植株得到了超量表
第 6期 王臻昱等: 野生大豆 GsGST19基因的克隆及其转基因苜蓿的耐盐碱性分析 975




图 2 GsGST19预测氨基酸的序列比对(A)和系统发育分析(B)
Fig. 2 Alignment (A) and phylogenetic (B) analysis of the deduced amino acid sequence of GsGST19



图 3 植物表达载体 pCBE-GsGST19结构图谱
Fig. 3 Sketch map of plant expression vector pCBE-GsGST19



图 4 转 GsGST19基因苜蓿半定量 RT-PCR分析
Fig. 4 RT-PCR analysis of expression in leaf of alfalfa with
GsGST19
NT: 未转基因苜蓿; 1~5: 转 GsGST19基因苜蓿株系。
NT: non-transgenic plants; 1–5: transgenic alfalfa plants with
GsGST19.
达。随着 NaHCO3 胁迫浓度的增加, 转基因和未转
基因株系的 GST酶活性均有提高, 而 2 个转基因株
系的 GST酶活性均显著高于非转基因株系(P<0.01),
说明超量表达 GsGST19基因增强了盐碱胁迫条件下
转基因苜蓿的 GST 酶活性, 从而增强了转基因植株
的耐盐碱能力。
图 8 表明, 正常条件下, 转基因和非转基因株
系的 SOD酶活性没有显著差异, 但在 NaHCO3胁迫
条件下, 转基因和未转基因对照株系的 SOD 酶活
性均被诱导提高, 而 2个转基因株系的 SOD酶活性
均显著高于非转基因株系(P<0.01), 说明超量表达
GsGST19 基因增强了转基因株系的活性氧清除能力,
从而降低了盐碱胁迫对转基因植株造成的氧化伤害。
976 作 物 学 报 第 38卷



图 5 转基因苜蓿碱胁迫表型分析
Fig. 5 Phenotype analysis of transgenic alfalfa with GsGST19
under saline-alkali stress
A、B和 C分别为 0、50和 100 mmol L–1 NaHCO3 处理 14 d后的
表型; NT: 非转基因对照; 19-4和 19-19: 转 GsGST19基因株系。
A, B, and C are alfalfa phenotype treated with 0, 50, and 100 mmol
L–1 NaHCO3 for 14 days; NT: non-transgenic alfalfa; 19-4 and
19-19: transgenic alfalfa plants with GsGST19.

2.6 盐碱胁迫条件下转 GsGST19 基因苜蓿相关
生理指标的分析
2.6.1 NaHCO3 胁迫下苜蓿叶片丙二醛(MDA)含量
的分析 在盐碱胁迫下, 植物细胞会产生大量的
活性氧, 在活性氧的作用下, 膜脂发生过氧化反应
而产生丙二醛(MDA), 因此, MDA 含量是反映膜氧
化损伤程度的重要指标之一。通过分析转 GsGST
19苜蓿和非转基因株系 MDA含量(图 9)发现, 随着
NaHCO3 胁迫浓度的增加, 转基因和非转基因株系
的 MDA 含量均随之增加, 但 2 个转 GsGST19 基因
苜蓿株系的 MDA 含量增加幅度显著低于非转基因
对照株系(P<0.05)从而说明超量表达 GsGST19 基因
可降低 NaHCO3 胁迫对转基因苜蓿细胞膜造成的氧
化损伤。
2.6.2 NaHCO3 胁迫下苜蓿叶片相对质膜透性分析
图 10表明, 转GsGST19基因和非转基因苜蓿的
相对质膜透性均随着 NaHCO3胁迫浓度的增加而升


图 6 NaHCO3胁迫对转 GsGST19基因苜蓿株高和根长的影响
Fig. 6 Changes of plant height and root length of transgenic
alfalfa with GsGST19 under NaHCO3 stress
图柱上方不同大写和小写字母分别表示在 P<0.01和 P<0.05水平
上差异显著。
Bars with different capitals or lowercases are significant differences
at P<0.01 and P<0.05, respectively.



图 7 盐碱胁迫下转 GsGST19基因苜蓿的 GST酶活性
Fig. 7 GST activity in transgenic plant with GsGST19 under
saline-alkali stress
图柱上方不同大写和小写字母分别表示在 P<0.01和 P<0.05水平
上差异显著。
Bars with different capitals or lowercases are significant differences
at P<0.01 and P<0.05, respectively.

高, 但 2个转基因株系相对质膜透性的增加幅度均显
著低于非转基因对照植株(P<0.05), 说明在 NaHCO3
胁迫条件下, 转 GsGST19 基因株系较非转基因株系
的细胞膜具有较强的生理活性。
2.6.3 NaHCO3 胁迫下叶绿素含量分析 图 11显
示, 随着 NaHCO3胁迫浓度的增加, 2个转 GsGST19
基因苜蓿株系和非转基因对照株系的叶绿素含量均
第 6期 王臻昱等: 野生大豆 GsGST19基因的克隆及其转基因苜蓿的耐盐碱性分析 977


随之降低, 但在相同 NaHCO3 浓度处理条件下, 转
基因株系的叶绿素含量均高于非转基因对照, 尤其



图 8 盐碱胁迫下转 GsGST19基因苜蓿的 SOD酶活性
Fig. 8 SOD activity in transgenic plant with GsGST19 under
saline-alkali stress
图柱上方不同大写和小写字母分别表示在 P<0.01和 P<0.05水平
上差异显著。
Bars with different capitals or lowercases are significant differences
at P<0.01 and P<0.05, respectively.



图 9 转 GsGST19基因苜蓿的 MDA含量
Fig. 9 MDA content of transgenic alfalfa with GsGST19
图柱上方不同大写和小写字母分别表示在 P<0.01和 P<0.05水平
上差异显著。
Bars with different capitals or lowercases are significant differences
at P<0.01 and P<0.05, respectively.



图 10 转 GsGST19基因苜蓿的相对质膜透性
Fig. 10 Relative membrane permeability of transgenic alfalfa
with GsGST19
图柱上方不同大写和小写字母分别表示在 P<0.01和 P<0.05水平
上差异显著。
Bars with different capitals or lowercases are significant differences
at P<0.01 and P<0.05, respectively.


图 11 转 GsGST19基因的苜蓿叶绿素含量
Fig. 11 Chlorophyll content of transgenic alfalfa with
GsGST19
图柱上方不同大写和小写字母分别表示在 P<0.01和 P<0.05水平
上差异显著。
Bars with different capitals or lowercases are significant differences
at P<0.01 and P<0.05, respectively.

在 100 mmol L–1 NaHCO3处理条件下, 2个转基因株
系的叶绿素含量均显著高于非转基因对照株系
(P<0.05), 显然转 GsGST19 基因苜蓿株系在盐碱胁
迫条件下仍能保持较强的光合能力, 从而保持较好
的生长状态。
2.6.4 NaHCO3 胁迫下苜蓿根系活力分析 从图
12 可以看出, 在 NaHCO3胁迫条件下, 非转基因苜
蓿的根系活力急剧下降, 而 2 个 GsGST19 的转基因
株系的根系活力虽然也随着胁迫浓度的增加而降低,
但下降幅度均低于非转基因株系。在 100 mmol L–1
NaHCO3处理条件下, 转 GsGST19 基因株系的根系
活力显著高于非转基因株系。由此可见, GsGST19
的超量表达可以使转基因苜蓿根系在盐碱胁迫下保
持较高的活力, 有利于其对水分和养分的吸收。



图 12 转 GsGST19基因苜蓿的根系活力
Fig. 12 Root activity of transgenic alfalfa with GsGST19
不同大写和小写字母分别表示在P<0.01和P<0.05水平上差异显著。
Bars with different capitals or lowercases are significant differences
at P<0.01 and P<0.05, respectively.

3 讨论
盐碱胁迫严重影响作物产量和品质, 通过基因
工程手段培育耐盐碱作物品种是推动盐碱地区农业
978 作 物 学 报 第 38卷

发展的有效措施之一, 而盐生植物是一个宝贵的自
然耐盐碱基因库。在大豆种质资源中, 可在盐碱土
地区生长的野大豆是研究大豆耐盐碱分子机理和挖
掘耐盐碱基因的理想材料。
本研究根据已构建的野大豆盐碱胁迫基因表达
谱 [9-10], 以及基于盐碱胁迫表达谱构建的基因调控
网络, 选择了盐碱胁迫应答关键基因 GsGST19, 对
其克隆与分析发现, GsGST19属于 Tau类 GST亚家
族。Tau 类 GST 是植物特有的, 也是植物中含量比
较丰富的一类 GST[18], 大量研究表明 Tau类 GST与
植物对生物和非生物胁迫的耐受有关[19-22]。George
等[5]研究发现一个 Tau 类 GST 基因 PjGSTU1, 可以
提高转基因烟草的耐旱性, 而该基因具有过氧化物
酶活性, 并且定位于线粒体, 因此推断该基因可能
与活性氧清除相关。
植物在盐碱、干旱、低温等非生物胁迫条件下,
除了产生渗透胁迫和离子胁迫外, 还会由于活性氧
的积累而产生次级氧化胁迫, 因此, 提高植物细胞
的抗氧化能力可增强植物对非生物胁迫的耐性。研
究表明, GST 可通过降解胁迫条件下细胞内积累的
毒性氧化物, 保护植物免受氧化伤害。已有大量研
究表明 GST转基因植物能够增强植物对低温、干旱、
盐碱及重金属等多种胁迫环境的耐受能力, 而共同的
机制就是降低逆境对植物体产生的氧化损伤[4,6,23-24]。
例如, 研究表明转 GST 基因烟草通过提高活性氧清
除系统的产物含量, 而增强了转基因烟草对盐胁迫
的耐受能力[7,26]。Dixit 等[25]报道在烟草中表达一个
真菌 GST, 显著提高了转基因烟草对重金属的耐受
能力, 另外, 在重金属胁迫条件下, 不但 GST 酶活
性提高, 而且 SOD 酶, 过氧化物酶、过氧化氢酶等
活性均显著提高, 因此推断 GST 酶可能与其他抗氧
化物酶类共同调节植物细胞内的有害和有益 H2O2
的平衡。此外, Dixon等[8]发现大豆根瘤中含有丰富
的 GST, 研究表明根瘤中 GST具有抗氧化功能。
本文通过在苜蓿中超量表达 GsGST19, 研究该
基因对提高植物耐盐碱能力的作用。结果显示超量
表达 GsGST19 基因的苜蓿, 在盐碱胁迫条件下, 不
但诱导产生较高的GST酶活性, 而且 SOD酶活性也
显著提高。由此可见, 超量表达 GsGST19 基因, 增
强了转基因苜蓿株系的活性氧清除能力, 从而降低
了盐碱胁迫对植物产生的氧化损伤。通过对转
GsGST19 基因苜蓿相关生理指标的分析, 进一步证
实, 在 NaHCO3胁迫条件下, GsGST19能够降低转基
因苜蓿膜脂的氧化损伤, 使转基因株系细胞膜保持
较好的生理活性, 并具有较强的光合能力和根部吸
收能力, 从而使转基因苜蓿在盐碱胁迫条件下仍能
保持良好的生长状态。
4 结论
克隆得到野大豆盐碱胁迫应答关键基因
GsGST19, 该基因属于 tau类GST家族; 获得超量表
达的转 GsGST19基因苜蓿; GsGST19提高了转基因
苜蓿耐盐碱性。
References
[1] Geng H-Z(耿华珠). Alfalfa in China (中国苜蓿). Beijing: China
Agriculture Press, 1995. pp 1–5 (in Chinese)
[2] Liu C-K(柳参奎). Primitive Color Illustrated Handbook of Plants
of Salt-Alkali Soil in the Northeast of China (中国东北盐碱地植
物原色图鉴). Herbin: Northeast Forest University Press in China,
2005. p 1 (in Chinese)
[3] Zhang H-N(张海娜), Li X-J(李小娟), Li C-D(李存东), Xiao
K(肖凯). Effects of overexpression of wheat superoxide dismu-
tase (SOD) genes on salt tolerant capability in tobacco. Acta
Agron Sin (作物学报), 2008, 34(8): 1403–1408 (in Chinese with
English abstract)
[4] Roxas V P, Smith R K, Jr, Allen1 E R, Allen1 R D. Overex-
pression of glutathione S-transferase/glutathioneperoxidase en-
hances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress.
Nat Biotechnol, 1997, 15: 988–991
[5] George S, Venkataraman G, Parida A. A chloroplast-localized and
auxin-induced glutathione S-transferase from phreatophyte Pro-
sopis juliflora confer drought tolerance on tobacco. J Plant
Physiol, 2010, 167: 311–318
[6] Huang C, Guo T, Zheng S C, Feng Q L, Liang J H, Li L. In-
creased cold tolerance in Arabidopsis thaliana transformed with
Choristoneura fumiferana glutathione S-transferase gene. Biol
Plant, 2009, 53: 183–187
[7] Zhao F Y, Zhang H. Salt and paraquat stress tolerance results
from co-expression of the Suaeda salsa glutathione S-transferase
and catalase in transgenic rice. Plant Cell Tiss Organ Cult, 2006,
86: 349–358
[8] Dixon D P, Skipsey M, Edwards R. Roles for glutathione trans-
ferases in plant secondary metabolism. Phytochemistry, 2010, 71:
338–350
[9] Ge Y, Li Y, Zhu Y M, Bai X, Lü D K, Guo D J, Ji W, Cai H.
Global transcriptome profiling of wild soybean (Glycine soja)
roots under NaHCO3 treatment. BMC Plant Biol, 2010, 10: 153
[10] Ge Y, Li Y, Lv D K, Bai X, Ji W, Cai H, Wang A X, Zhu Y M.
Alkaline-stress response in Glycine soja leaf identifies specific
transcription factors and ABA-mediated signaling factors. Funct
Integr Genom, 2011, 11: 369–379
[11] Bao A K, Wang S M, Wu G Q, Xi J J, Zhang J L, Wang C M.
Overexpression of the Arabidopsis H+-PPase enhanced resistance
第 6期 王臻昱等: 野生大豆 GsGST19基因的克隆及其转基因苜蓿的耐盐碱性分析 979


to salt and drought stress in transgenic alfalfa (Medicago sativa
L.). Plant Sci, 2009, 176: 232–240
[12] Rao M V, Paliyath G, Ormrod D P. Influence of salicylic acid on
H2O2 production, oxidative stress, and H2O2-metabolizing en-
zymes. Plant Physiol, 1997, 115: 137–149
[13] Mauch F, Dudlar R. Differential induction of distinct glutathione-
S-transferases of wheat by xenobiotics and by pathogen attack.
Plant Physiol, 1993, 102: 1193–1201
[14] Health R L, Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts:
I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch
Biochem Biophys, 1968, 125:1892–1981
[15] Gibon Y, Larher F. Cycling assay for nicotinamide adenine dinu-
cleotides: NaCl precipitation and ethanol solubilization of the re-
duced tetrazolium. Anal Biochem, 1997, 251: 153–157
[16] Lichtenthaler H K, Wellburn A R. Determination of total carote-
noids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different sol-
vents. Biochem Soc Trans, 1983, 11: 591–592
[17] Zhong X H, Huang N R. Rice grain chalkiness is negatively cor-
related with root activity during grain filling. Rice Sci, 2005, 12:
192–196
[18] Dixon D P, Lapthorn A, Edwards R. Plant glutathione trans-
ferases. Genome Biol, 2002, 3: 3004.1–3004.10
[19] Yang X, Su W, Liu J P, Liu Y J, Zeng Q Y. Biochemical and
physiological characterization of a tau class glutathione trans-
ferase from rice (Oryza sativa). Plant Physiol Biochem, 2009, 47:
1061–1068
[20] Lo Piero A R, Puglisi I, Petrone G. Gene isolation, analysis of ex-
pression, and in vitro synthesis of glutathione S-transferase from
orange fruit [Citrus sinensis L. (Osbeck)]. J Agric Food Chem,
2006, 54: 9227–9233
[21] Bianchi M W, Roux C, Vartanian N. Drought regulation of GST8
encoding the Arabidopsis homologue of ParC/Nt107 glutathione
transferase/peroxidase. Physiol Plant, 2002, 116: 96–105
[22] DeRidder B P, Dixon D P, Beussman D J, Edwards R, Golds-
brough P B. Induction of glutathione S-transferases in Arabidop-
sis by herbicide safety. Plant Physiol, 2002, 130: 1497–1505
[23] Ji W, Zhu Y M, Li Y, Yang L, Zhao X W, Cai H, Bai X. Over- ex-
pression of a glutathione S-transferase gene, GsGST, from wild
soybean (Glycine soja) enhances drought and salt tolerance in
transgenic tobacco. Biotechnol Lett, 2010, 32: 1173–1179
[24] Dixit P, Mukherjee P K, Ramachandran V, Eapen S. Glutathione
transferase from Trichoderma virens enhances cadmium tolerance
without enhancing its accumulation in transgenic Nicotiana
tabacum. PloS ONE, 2011, 6(1): e16360.1371/journal.pone.0016360
[25] Shigeoka S, Ishikawa T, Tamoi M, Miyagawa Y, Takeda T,
Yabuta Y. Regulation and function of ascorbate peroxidase
isoenzymes. J Exp Bot, 2002, 53: 1305–1319
[26] Diao G, Wang Y, Wang C, Yang C. Cloning and functional char-
acterization of a novel glutathione S-transferase gene from Limo-
nium bicolor. Plant Mol Biol Rep, 2011, 29: 77–87