全 文 ：林业科学研究　２０１５，２８（６）：８３３ ８３８
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
　　文章编号：１００１１４９８（２０１５）０６０８３３０６
思茅松１脱氧Ｄ木酮糖５磷酸合酶（ＤＸＳ）基因的
克隆及功能分析
王　毅１，２，周　旭３，毕　玮１，２，杨宇明２，李　江２，王　娟２
（１．云南省林业科学院 国家林业局云南珍稀濒特森林植物繁育和保护重点实验室，云南 昆明　６５０２０１；
２．云南省林业科学院，云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南 昆明　６５０２０１；
３．西南林业大学，云南 昆明　６５０２２４）
收稿日期：２０１５０１１９
基金项目：林业公益性行业科研专项（２０１３０４１０５）资助；云南省应用基础研究重点项目（２０１３ＦＡ０５４）；云南省中青年学术技术带头人后
备人才培养项目（２０１０ＣＩ０１６）资助
作者简介：王　毅（１９８１—），男，四川广安人．助理研究员，主要从事植物学和分子生物学研究．Ｅｍａｉｌ：２２８２５８１８＠ｑｑ．ｃｏｍ．
 通讯作者：植物学博士，教授，硕士生导师，从事生物多样性保护和竹类植物的微观研究．ｓｃｈｉｍａ＠１６３．ｃｏｍ．电话：０８７１６５８２２８４２。
摘要：１脱氧Ｄ木酮糖５磷酸合酶（ＤＸＳ）是甲基
!
Ｄ
!
赤藓醇
!
４
!
磷酸（ＭＥＰ）途径中的第一个酶，也是限速酶。
本文根据思茅松（Ｐｉｎｕｓｋｅｓｉｙａｖａｒ．ｌａｎｇｂｉａｎｅｎｓｉｓ（Ａ．Ｃｈｅｖ．）Ｇａｕｓｓｅｎ）树皮转录组数据分析结果，获得思茅松 ＤＸＳ
基因片段，然后根据获得的基因片段设计特异引物，运用 ＲＴＰＣＲ和 ＲＡＣＥ技术从思茅松树皮中克隆得到完整的
ＤＸＳ基因（ＰｋＤＸＳ１）。ＰｋＤＸＳ１基因的ｃＤＮＡ全长序列２８８８ｂｐ，含有１个２２２３ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ），编码７４０
个氨基酸，该基因推断的蛋白与赤松（ＰｉｎｕｓｄｅｎｓｉｆｌｏｒａＳｉｅｂｏｌｄ＆Ｚｕｃｃ）ＤＸＳ蛋白的相似性为９９％，与欧洲云杉（Ｐｉｃｅａ
ａｂｉｅｓ（Ｌ．）Ｈ．Ｋａｒｓｔ．）ＤＸＳ的相似性为９７％；经氨基酸序列比对，推断思茅松ＤＸＳ具有高等植物ＤＸＳ酶特有的叶绿
体转运肽，二磷酸硫胺结合位点和转酮醇酶结构域。半定量ＲＴＰＣＲ检测表明树皮的创伤促进ＤＸＳ基因的表达。
关键词：思茅松；ＤＸＳ；ｃＤＮＡ克隆；基因功能分析
中图分类号：Ｓ７１８．４６ 文献标识码：Ａ
ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａ１ＤｅｏｘｙＤｘｙｌｕｌｏｓｅ
５ｐｈｏｓｐｈａｔｅＳｙｎｔｈａｓｅＧｅｎｅＦｒｏｍＰｉｎｕｓｋｅｓｉｙａｖａｒ．ｌａｎｇｂｉａｎｅｎｓｉｓ
ＷＡＮＧＹｉ１，２，ＺＨＯＵＸｕ３，ＢＩＷｅｉ１，２，ＹＡＮＧＹｕｍｉｎｇ２，ＬＩＪｉａｎｇ２，ＷＡＮＧＪｕａｎ２
（１．ＴｈｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲａｒｅａｎｄＥｎｄａｎｇｅｒｅｄＦｏｒｅｓｔＰｌａｎｔｓｏｆＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＹｕｎｎａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２０１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＴｈｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔｙＰｌａｎｔＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＹｕｎｎａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２０１，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；
３．ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：１ｄｅｏｘｙＤｘｙｌｕｌｏｓｅ５ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ＤＸＳ）ｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｆｉｒｓｔａｎｄｔｈｅｒａｔｅｌｉｍｉｔｉｎｇｓｔｅｐｏｆｔｈｅＭＥＰ
ｐａｔｈｗａｙ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｓｐｅｃｉａｌｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｄａｔａｏｆＰｉｎｕｓｋｅｓｉｙａｖａｒ．
ｌａｎｇｂｉａｎｅｎｓｉｓ（Ａ．Ｃｈｅｖ．）Ｇａｕｓｓｅｎ．ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｇｅｎｅｏｆＰｋＤＸＳ１ｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＲＴＰＣＲａｎｄＲＡＣＥ，ｗｈｉｃｈ
ｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆ２２２３ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｅｎｃｏｄｉｎｇ７４０ａｍｉｎｏａｃｉｄ，ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄＰｋＤＸＳ１ｐｒｏｔｅｉｎｓｈａｒｅｄ
９９％ ａｎｄ９７％ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓｗｉｔｈＤＸＳｏｆＰｉｎｕｓｄｅｎｓｉｆｌｏｒａＳｉｅｂｏｌｄ＆ＺｕｃｃａｎｄＰｉｃｅａａｂｉｅｓ（Ｌ．）Ｈ．Ｋａｒｓｔ．，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ
ｌｙ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰｋＤＸＳ１ｃａｒｉｅｄａｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｉｔｐｅｐｔｉｅｄ，ａｔｈｉａ
ｍｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ，ａｎｄａｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅｍｏｔｉｆ，ｗｈｉｃｈａｒｅｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＤＸＳｅｎｚｙｍｅｓｉｎ
ｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ．ＳｅｍｉｑｕａｎｔｉｔｙＲＴＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＤＸＳｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｗｏｕｎｄｉｎｇ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｉｎｕｓｋｅｓｉｙａｖａｒ．ｌａｎｇｂｉａｎｅｎｓｉｓ（Ａ．Ｃｈｅｖ．）Ｇａｕｓｓｅｎ；１ｄｅｏｘｙｄｘｙｌｕｌｏｓｅ５ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ；
ｃＤＮＡｃｌｏｎｅ；ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ
林　业　科　学　研　究 第２８卷
思茅松（Ｐｉｎｕｓｋｅｓｉｙａｖａｒ．ｌａｎｇｂｉａｎｅｎｓｉｓ（Ａ．
Ｃｈｅｖ．）Ｇａｕｓｓｅｎ）是云南松脂主要资源树种之一，其
树干富含树脂，其松节油平均含量２０％，最高可达
３２％，松节油中 β蒎烯含量高，为全国之最［１］。据
调查，目前云南省思茅松的林地面积约 １０２．５万
ｈｍ２，松香年蓄积量为１１．５万 ｔ，其松香产量占云南
省产量的９０％以上［２］。然而，在生产实践中发现思
茅松个体松脂产量差异显著，单株年产量一般３ｋｇ，
最高可达１４０ｋｇ［１］，这意味着思茅松单位面积产脂
量有巨大的提升空间。思茅松产脂量高低属于数量
性状，但是传统的数量性状研究方法在解决生长周
期较长的物种的数量性状时却面临诸多困难。虽然
目前已经发展出利用第二代测序技术，获得 ＳＳＲ或
ＳＮＰ等分子标记，然后将分子标记关联到数量性状
上，有效地揭示了一些数量性状机理，也大大提高了
分子辅助育种的效率［３］。但是对于思茅松这样的树
种，除了生长周期长的特性之外，还有基因组特别庞
大的特点，这为筛选得到与数量性状关联的分子标
记带来巨大困难［４］。随着越来越多的数量性状机理
被揭示，研究者发现与数量性状相关的代谢途径基
因往往处于数量性状基因座内或者附近［５－６］。因
此，Ｍａｕｒｉｃｉｏ于２００１年就提出反向数量遗传学研究
策略［７］，即从候选基因（通常是与数量性状相关的
代谢通路上的关键基因）出发，首先确定候选基因与
数量性状相关性，再对候选基因上下游序列进行研
究，获得数量性状基因座进而阐明数量性状基因调
控机理［８－９］。特别是近年测序技术的飞速发展，从
候选基因出发，通过比较基因组上的差异已经获得
大量数量性状基因座［１０－１１］。
松脂是由挥发性和非挥发性萜类组成的复杂混
合物，松脂中的挥发性单萜和倍半萜以及非挥发性
的二萜是重要的化工原料［１２］。它们都是以异戊烯
基焦磷酸（ＩＰＰ）和二甲基烯丙基焦磷酸（ＤＭＡＰＰ）为
初始底物，在异戊二烯转移酶（ＦＰＰ，ＧＰＰ，ＧＧＰＰ）作
用下生成萜类化合物的各种前体，最后在萜烯合酶
作用下生成单萜、二萜、倍半萜等萜类化合物［１３］。
研究人员发现 ＩＰＰ和 ＤＭＡＰＰ可以通过两个代谢途
径独立合成，即位于细胞质中的甲羟戊酸（ｍｅｖａｌ
ｏｎａｔｅｐａｔｈｗａｙ，ＭＶＡ）途径和位于质体中的甲基
!
Ｄ
!
赤藓醇４磷酸途径（ＭＥＰ）。其中，ＭＥＰ途径的最
终产物通常是单萜、二萜和四萜类化合物，而 ＭＶＡ
途径的最终产物通常是倍半萜、三萜类化合物［１４］。
前期研究人员对高产脂思茅松松脂化学组成特征研
究发现思茅松所产松脂中的主要成分为单萜和双萜
化合物，而倍半萜的含量不到 ２％［１５］。因此，ＭＥＰ
途径在思茅松松脂合成代谢中起着重要作用。
１脱氧Ｄ木酮糖５磷酸合酶（ＤＸＳ）是 ＭＥＰ途
径中的第一个酶，也是第一个限速酶［１６］，ＤＸＳ通过
控制质体中类异戊二烯前体的供应，从而调控植物
的初级代谢以及次级代谢［１７］。许多实验已经证明
过量表达ＤＸＳ基因将提高宿主植物中萜类化合物
的含量［１８］。ＤＸＳ存在于植物和细菌中，并且有非常
高的同源性，在植物和细菌中任何一对 ＤＸＳ有拥有
高于４５％的相同氨基酸。并且在植物中 ＤＸＳ的保
守性高于细菌中的保守性。最近的研究表明：大多
数植物中都含有超过一个 ＤＸＳ基因。ＤＸＳ１（或简
单ＤＸＳ）拥有与细菌ＤＸＳ非常相似的功能；而ＤＸＳ２
（和ＤＸＳ３）在植物中具有不同组织或者不同器官的
表达差异性。比如研究人员发现松科植物中的ＤＸＳ
基因会在其受伤组织中大量表达［１７］。Ｋｉｍ等的研
究也发现赤松通过改变 ＤＸＳ的转录水平来调控其
松脂代谢，在割脂（创伤）后，ＤＸＳ基因表达量和松
脂产量成正相关［１９］。在研究葡萄中单萜成分含量
数量性状基因座时，发现 ＤＸＳ基因位于影响葡萄中
单萜含量的数量性状基因座上［２０］。因此，我们推测
思茅松的松脂代谢也受到 ＤＸＳ基因表达调控，其所
在基因座也影响着松脂产量。目前，虽然 ＤＸＳ基因
很早就在模式植物拟南芥中发现，但由于 ＤＸＳ的功
能越来越丰富，因此依然有许多来自于非模式植物，
特别是一些具有重要经济价值的植物中的 ＤＸＳ被
克隆出来并鉴定其功能，如土沉香［２１］、蜜柑［２２］。然
而关于裸子植物的 ＤＸＳ功能的报道却很少［１７，２３］。
目前尚未见与思茅松 ＤＸＳ基因的相关报道，因此，
本文首先对思茅松转录组数据进行分析后获得思茅
松的 ＤＸＳ基因部分序列，然后利用 ＲＴＰＣＲ和
ＲＡＣＥ方法获得全长的思茅松 ＤＸＳ基因，并进行生
物信息学分析以及基因表达分析，以期为思茅松
ＤＸＳ基因功能研究奠定基础，同时也为阐明思茅松
松脂生物合成机制和分子育种提供参考。
１　材料与方法
１．１　材料
思茅松树皮采集于２０１３年１１月云南省普洱市
景谷县半坡乡，按照当地采松脂步骤，去除粗皮后，
将表皮以及形成层部分割下，迅速放入液氮中，并一
直用液氮保存直到提取ＲＮＡ。ｐＥＳＹＴ３克隆试剂盒
４３８
第６期 王　毅，等：思茅松１脱氧Ｄ木酮糖５磷酸合酶（ＤＸＳ）基因的克隆及功能分析
及感受态细胞均购自北京全式金公司；ＬＡＴａｑ酶、
以及 ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＭＭＬＶ购自大连宝生物
公司。
１．２　总 ＲＮＡ的抽提
思茅松的树皮、松针、幼枝的 ＲＮＡ提取方法采
用ＣＴＡＢ提取，ＬｉＣｌ沉淀的方法［２４－２５］。ＲＮＡ提取裂
解液配方为：１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２％
ＣＴＡＢ、３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ、２ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣｌ和
００５％（Ｗ／Ｖ）亚精胺，在提取时再加入２％（ｗ／ｖ）
ＰＶＰＰ、２％（ｖ／ｖ）β巯基乙醇、２ｍｇ·ｍＬ－１蛋白酶 Ｋ。
具体步骤如下：首先将样品尽量磨碎（通常加四次液
氮进行研磨），将样品粉末加入预热的裂解液中，
４２℃水浴９０ｍｉｎ。然后用氯仿－异戊醇反复抽提两
次后，用最终浓度为２ｍｏｌ·Ｌ－１的 ＬｉＣｌ进行４℃过
夜沉淀后，１５０００ｒ·ｍｉｎ－１４℃离心２５ｍｉｎ，弃上清，
加入 ５０μＬＤＥＰＣ水溶解。ＤＮＡ消化：将溶解的
ＲＮＡ用ＤＥＰＣ水补足２００μＬ后，加入１００μＬ的无
水乙醇。混匀后加入 ＲＮＡＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ（宝生物，
ＲＮＡ提取试剂盒），按照试剂盒步骤进行 ＤＮＡ消
化，最终用３０μＬ洗脱液进行洗脱ＲＮＡ。
１．３　思茅松ＤＸＳ基因的３′ＲＡＣＥ和５＇ＲＡＣＥ
由于转录组数据分析只得到思茅松 ＤＸＳ的片
段，缺少５′和３′端的基因序列。因此，首先以思茅松
树皮的ＲＮＡ为模板，按照ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ及３′ＦｕｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔＶｅｒ．２．０试剂
盒说明书合成５′端及３′端完整的思茅松ｃＤＮＡ第一
链。根据获得的 ＤＸＳ基因片段序列设计 ５′和 ３′
ＲＡＣＥ引物（表１），用５′ＦｕｌＲＡＣＥＫｉｔｗｉｔｈＴＡＰ试
剂盒和 ３′ＦｕｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔｗｉｔｈＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ
ＲＴａｓｅ（ＴａＫａＲａ）对思茅松 ＤＸＳ基因片段的５′和３′
基因片段进行克隆。
表１　文中所用引物序列
名称 序列（５′３′） 用途
３ＲＡＣＤＸＳＦ１ ＡＴＴＡＣＡＴＴＧＧＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴ
３′ＲＡＣＥ
３ＲＡＣＤＸＳＦ２ ＴＧＣＴＧＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡ
５ＲＡＣＤＸＳＦ１ ＣＴＣＧＴＣＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣ
５′ＲＡＣＥ
５ＲＡＣＤＸＳＦ２ ＡＣＣＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣ
ＰｋＤＸＳＦ０ ＡＴＧＧＣＡＡＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡ
全长ｃＤＮＡ开放
阅读框克隆
ＰｋＤＸＳＲ０ ＴＴＡＴＣＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＧＡ
ＦＤＸＳｔ ＡＣＡＴＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＡＴＣＴ ＲＴＰＣＲ检测
ＲＤＸＳｔ ＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＴＣＣＴＡ
Ｆａｃｔｉｎ ＡＴＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＡＴＧＡＧＣＡ ＲＴＰＣＲ内参
Ｒａｃｔｉｎ ＴＧＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＣＡ
１．４　ｃＤＮＡ全长扩增
依据ｃＤＮＡ拼接序列，设计 ＤＸＳ基因特异引物
ＰｋＤＸＳ１Ｆ０和 ＰｋＤＸＳ１Ｒ０（表 １），以思茅松树皮的
ｃＤＮＡ为模板，ＰｋＤＸＳ１Ｆ０和 ＰｋＤＸＳ１Ｒ０为引物，扩
增思茅松ＤＸＳ基因ｃＤＮＡ开放阅读框全长序列。反
应条件为：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５８℃４５ｓ，７２℃２．５
ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸１５ｍｉｎ。扩增的ＰＣＲ产物
胶回收后连接到 ｐＥＡＳＹＴ３载体中。并测序验证所
克隆得到的全长ｃＤＮＡ。
１．５　思茅松ＤＸＳ基因ｃＤＮＡ序列及其编码蛋白氨
基酸的序列分析
　　采用 ＮＣＢＩ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）
Ｂｌａｓｔ工具和ＤＮＡＭＡＮ软件将思茅松ＤＸＳ与数据库
中其他植物 ＤＸＳ基因进行核酸和氨基酸的同源序
列比对。多序列的比对由 ＣｌｕｓｔｅｒＷ程序完成，并用
ＭＥＧＡ４．０．２软件的邻位相连算法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎ
ｉｎｇ）１０００次自检举（ｂｏｏｔｓｔｒａｐｉｎｇ）绘制出进化树图
像。为了将叶绿体转运肽也纳入进化树分析，本进
化树以低等植物衣藻的 ＤＸＳ作为外类群［２６］。Ｔａｒ
ｇｅｔＰ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ／）和 ＣｈｌｏｒｏＰ
（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／）被用来
预测ＰｋＤＸＳ蛋白的亚细胞定位以及叶绿体转运肽
的切割位点。
１．６　半定量ＲＴＰＣＲ检测思茅松ＤＸＳ基因表达分析
以获得的ＰｋＤＸＳ１基因序列为模板设计特异引
物Ｆｄｘｓｔ和 Ｒｄｘｓｔ（表 １）。将样品液氮研磨后，用
ＣＴＡＢ法分别提取思茅松的树皮１（除去粗皮后立即
取样），树皮２（除去粗皮后１２ｈ取样，树皮３（除去
粗皮后２４ｈ取样），树皮４（除去粗皮后３６ｈ取样）。
并用琼脂糖凝胶电泳检测 ＲＮＡ质量后，将 ＲＮＡ保
存在－８０℃超低温冰箱。ｃＤＮＡ合成参照 Ｒｅｖｅｒｓｅ
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＭＭＬＶ试剂盒（宝生物工程有限公司，
大连）的说明书操作，并将 ｃＤＮＡ保存在 －２０℃冰
箱。以特异引物 Ｆｄｘｓｔ和 Ｒｄｘｓｔ检测 ＰｋＤＸＳ基因的
表达情况。同时以ａｃｔｉｎ为内参。
２　结果与分析
２．１　思茅松ＲＮＡ提取
本文采用其他研究人员发展起来的 ＣＴＡＢ提取
结合ＬｉＣｌ沉淀法［１４－１５］，提取思茅松树皮以及松针的
ＲＮＡ。并采用膜上消化的方式除去样本中的 ＤＮＡ，
获得完成且纯度高的ＲＮＡ（图１）。
２．２　思茅松ＤＸＳ全长ｃＤＮＡ的克隆与序列分析
首先从思茅松树皮转录组数据中获得１２００ｂｐ
大小的ＤＸＳ基因片段，然后，根据该片段设计特异
５３８
林　业　科　学　研　究 第２８卷
Ｍ：１ＫＤＮＡｍａｒｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ）；１：树皮ＲＮＡ；２：３′ＲＡＣＥ；３：５′ＲＡＣＥ；
４：ＤＸＳ全长ＯＲＦ克隆 。
图１　ＲＮＡ提取和ＤＸＳ基因克隆
引物，应用ＲＡＣＥ技术克隆获得思茅松 ＤＸＳ的３′和
５′ｃＤＮＡ末端序列信息，其大小分别为１４５２ｂｐ和１
２３５ｂｐ（图１）。
将获得的ＤＸＳ基因片段序列进行拼接后，得到
全长ｃＤＮＡ序列为 ２８８８ｂｐ。利用在线软件（ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）分析获
得ｃＤＮＡ开放阅读框，并根据该序列设计含有起始
密码子的特异引物 ＰｋＤＸＳＦ０和含终止密码子的特
异引物 ＰｋＤＸＳＲ０，并以思茅松树皮 ｃＤＮＡ为模板，
ＰＣＲ扩增获得 ２２２３ｂｐ的 ｃＤＮＡ完整的开放阅读
框，并命名为 ＰｋＤＸＳ１。将此２２２３ｂｐ片段与 ＤＸＳ
ｃＤＮＡ拼接序列进行比对分析，分析结果显示两序
列一致，这表明思茅松 ＤＸＳ基因 ｃＤＮＡ拼接序列正
确。其５′含有３０８ｂｐ的非编码区，３′端含有３６０ｂｐ
的非编码区，这表明思茅松 ＤＸＳ基因的 ｃＤＮＡ序列
完整（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＫＭ３８２１７０）。
２．３　ＰｋＤＸＳ氨基酸序列分析
根据思茅松 ＰｋＤＸＳ１基因 ｃＤＮＡ全长序列推测
其编码７４０个氨基酸残基，该基因推断的蛋白与赤
松（ＰｉｎｕｓｄｅｎｓｉｆｌｏｒａＳｉｅｂｏｌｄ＆Ｚｕｃｃ．）ＤＸＳ蛋白的相
似性为 ９９％，与欧洲云杉（Ｐｉｃｅａａｂｉｅｓ（Ｌ．）Ｈ．
Ｋａｒｓｔ．）ＤＸＳ的相似性为９７％。以思茅松 ＤＸＳ氨基
酸序列与来其他四种不同物种的１脱氧Ｄ木酮糖
５磷酸合酶氨基酸序列进行序列比对分析，推测出
ＰｋＤＸＳ蛋白还包含二磷酸硫胺结合位点 ＧＤＧ（Ｘ）
８Ｅ（Ｘ）４Ａ（Ｘ）１１ＮＤＮ（虚线框标注）（图２）。同时，
ＰｋＤＸＳ蛋 白 还 含 有 一 个 转 酮 醇 酶 结 构 域
ＤＲＡＧＸ２８ＰＸＤ（实线框标注）（图 ２）。利用亚细胞
定位软件以及叶绿体转运肽的切割位点分析软件显
示ＰｋＤＸＳ１的合成位于叶绿体内，其含有一个由４８
个氨基酸残基构成的叶绿体转运肽，切割位点已用
箭头标注（图２）。
２．４　ＰｋＤＸＳ系统进化树分析
思茅松ＤＸＳ与其他植物的 ＤＸＳ氨基酸序列的
系统进化分析表明：思茅松ＤＸＳ与松科的１脱氧Ｄ
ＰｄＤＸＳ：赤松（ＡＣＣ５４５５４），ＰａＤＸＳ：欧洲云杉（（ＡＢＳ５０５１９），Ｇｂ
ＤＸＳ：银杏 （ＡＡＲ９５６９９），ＣｒＤＸＳ：长春花（ＣＡＡ０９８０４）。所以保守
的氨基酸位点都用星号标注，箭头处为叶绿体转运肽的切割位点，
虚线框处为二磷酸硫胺结合位点，实线框处为转酮醇酶结构域。
图２　思茅松和其他物种ＤＸＳ氨基酸序列比对分析
６３８
第６期 王　毅，等：思茅松１脱氧Ｄ木酮糖５磷酸合酶（ＤＸＳ）基因的克隆及功能分析
木酮糖５磷酸合酶聚为一类，从系统进化树可以看
出思茅松 ＰｋＤＸＳ与赤松（ＰｉｎｕｓｄｅｎｓｉｆｌｏｒａＳｉｅｂｏｌｄ＆
Ｚｕｃｃ）的ＤＸＳ基因及欧洲云杉（Ｐｉｃｅａａｂｉｅｓ（Ｌ．）Ｈ．
Ｋａｒｓｔ．）的ＤＸＳ的亲缘关系较近（图３）。
图３　ＰｋＤＸＳ与其他不同物种间ＤＸＳ系统进化树
２．５　ＰｋＤＸＳ基因的转录模式分析
利用 ＰｋＤＸＳ１基因的特异引物 Ｆｄｘｓｔ和 Ｒｄｘｓｔ，
通过 ＲＴＰＣＲ检测 ＰｋＤＸＳ１在模拟割脂过程中导致
思茅松树皮受伤后，随着时间变化 ＰｋＤＸＳ１基因表
达情况。从图４中可以看出，ＰｋＤＸＳ１基因在刚刚创
伤时（０ｈ）的表达量明显少于创伤后（１２ｈ、２４ｈ、３６
ｈ）。这说明创伤会刺激ＰｋＤＸＳ１基因表达。
图４　思茅松ＰｋＤＸＳ１在树皮创伤后表达情况
３　讨论
思茅松是云南省主要的松脂资源树种，其种植
面积已经超过１００万ｈｍ２。生产实践发现思茅松个
体松脂产量差异显著，单株年产量一般３ｋｇ，最高可
达１４０ｋｇ［１］。我国自２０世纪８０年代始开展思茅松
遗传改良研究，在种源试验、优良林分选择、优树收
集、无性系种子园建设、半同胞子代测定、早晚期性
状相关及遗传变异等方面开展了大量研究工作，并
取得了可喜的成绩［２７］。然而，传统的选优育种方法
并没有有效地解决思茅松产脂高低这一数量性状的
难题。
由于思茅松从播种到产脂需要漫长的生长周
期，如果采用传统的数量性状研究方法研究高低产
脂机理，则需要几代人的努力。这很难满足目前对
高产脂思茅松的需要。大量的图位克隆结果表明数
量性状基因座在基因组上往往位于控制其性状的代
谢通路上的酶基因上或者附近。那么，以与数量性
状相关代谢途径为出发点，确定候选基因与数量性
状的相关性，再通过第二代测序技术获得候选基因
附近基因座的个体差异，从这些差异的基因座序列
中设计分子标记，将极大地提高分子标记与数量性
状的关联性。这样的研究方法将极大地缩短确定与
数量性状关联分子标记的时间，将有效地解决目前
思茅松高产脂分子育种的瓶颈问题。
本文以普洱市景谷县半坡乡的思茅松“产脂
王”（松脂年产量超过１００ｋｇ）为研究对象，首次利
用转录组测序技术与ＲＡＣＥ技术相结合的方法成功
克隆获得思茅松 ＤＸＳ基因（ＰｋＤＸＳ１）。系统进化分
析发现ＰｋＤＸＳ和赤松ＤＸＳ聚类在同一分支（图３）。
对克隆获得的思茅松 ＰｋＤＸＳ１基因推导的蛋白序列
分析发现，ＰｋＤＸＳ１与赤松的 ＤＸＳ同源性高达
９９３％。只有五个氨基酸有差异（即：第３３、３４、３６、
４５１、４６１位点）。由此可以推测高产脂思茅松产脂
量高的原因不是因为ＤＸＳ蛋白序列差异导致，而很
可能是类似于赤松通过改变 ＤＸＳ基因转录水平来
调控松脂合成（Ｋｉｍ２０１０）。通过 ＲＴＰＣＲ检测思
茅松模拟割脂过程产生创伤后 ＤＸＳ表达情况发现，
创伤能够有效地刺激ＤＸＳ表达（图４）。这与生产实
践中割脂可以刺激松脂产生相吻合，从而再次证明
ＰｋＤＸＳ参与控制思茅松的松脂代谢。
ＰｋＤＸＳ１将是未来进行反向数量性状研究的靶
基因，通过ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ，构建ＢＡＣ文库以及全基
因组测序等方法，获得ＰｋＤＸＳ１基因前后序列（数量
性状基因座），通过比较高低产脂不同个体中 Ｐｋ
ＤＸＳ１所在基因基因座的区别，最终揭示高低产脂数
量性状的控制机理。这些工作将极大促进高产脂思
茅松的分子育种。同时，ＰｋＤＸＳ１在基因工程上也是
非常重要的基因材料，通过在思茅松或者其他植物
中超表达ＰｋＤＸＳ１，从而推动植物代谢向 ＭＥＰ途径
倾斜，从而获得高产萜类化合物的工程植株。这些
将极大推动高产脂思茅松工程植株的研发。
参考文献：
［１］徐明艳，邓桂香，凌万刚．思茅松良种利用方法的探讨［Ｊ］．种
７３８
林　业　科　学　研　究 第２８卷
子，２０１２，３１（８）：９５－１０１．
［２］董静曦，张　剑，郭辉军．云南与广西产脂松树资源的对比分
析［Ｊ］．林业资源管理，２００９，２８（３）：８５－８９．
［３］ＬｅＣｏｒｅＶ，ＫｒｅｍｅｒＡ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｔｒａｉｔｌｏｃｉｕｎｄｅｒｌｏｃａｌａｄａｐｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｃｏｌｏｇｙ，２０１２，２１
（７）：１５４８－１５６６．
［４］ＲｉｂａｕｔＪＭ，ｄｅＶｉｃｅｎｔｅＭＣ，ＤｅｌａｎｎａｙＸ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｒｅｅｄｉｎｇｉｎ
ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ｃｈａｌｅｎｇｅｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＣｕｒｅｎｔＯ
ｐｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１３（２）：２１３－２１８．
［５］ＺｏｒｉｌａＦｏｎｔａｎｅｓｉＹ，ＣａｂｅｚａＡ，ＤｏｍíｎｇｕｅｚＰ，ｅｔａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｔｒａｉｔｌｏｃｉａｎｄｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇａｇｒｏｎｏｍｉｃａｌａｎｄ
ｆｒｕｉｔｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓｉｎｏｃｔｏｐｌｏｉｄｓｔｒａｗｂｅｒｙ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓａ）
［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄａｐｐｌｉｅｄｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１，１２３（５）：７５５－７７８．
［６］ＩｎｄｕｒｉＢＲ，ＥｌｉｓＤＲ，ＳｌａｖｏｖＧＴ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｉｔａ
ｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉａｎｄｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｆｏｒｃａｄｍｉｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＰｏｐｕｌｕｓ
［Ｊ］．Ｔｒｅｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（５）：６２６－６３８．
［７］ＭａｕｒｉｃｉｏＲ．Ｍａｐｐｉｎｇｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉｉｎｐｌａｎｔｓ：ｕｓｅｓａｎｄｃａｖｅ
ａｔｓｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，２
（５）：３７０－３８１．
［８］ＳａｌｖｉＳ，ＴｕｂｅｒｏｓａＲ．ＴｏｃｌｏｎｅｏｒｎｏｔｔｏｃｌｏｎｅｐｌａｎｔＱＴＬｓ：ｐｒｅｓｅｎｔ
ａｎｄｆｕｔｕｒｅｃｈａｌｅｎｇｅｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓｉｎｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，１０（６）：
２９７－３０４．
［９］ＬｏｎｇｈｉＳ，ＨａｍｂｌｉｎＭＴ，ＴｒａｉｎｏｔｉＬ，ｅｔａｌ．Ａｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｂａｓｅｄ
ａｐｐｒｏａｃｈｖａｌｉｄａｔｅｓＭｄＰＧ１ａｓｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒａＱＴＬｉｍｐａｃ
ｔｉｎｇｆｒｕｉｔｔｅｘｔｕｒｅｉｎａｐｐｌｅ（ＭａｌｕｓｘｄｏｍｅｓｔｉｃａＢｏｒｋｈ）［Ｊ］．ＢＭＣ
ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１３（１）：３７．
［１０］ＷａｎｇＬ，ＷａｎｇＡ，ＨｕａｎｇＸ，ｅｔａｌ．Ｍａｐｐｉｎｇｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉ
ａｔｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂａｓｅｄｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆｒｉｃｅｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄａｐｐｌｉｅｄｇｅｎｅｔｉｃｓ，
２０１１，１２２（２）：３２７－３４０．
［１１］ＧｕｇｇｅｎｈｅｉｍＪＡ，ＭｃＭａｈｏｎＧ，ＫｅｍｐＪＰ，ｅｔａｌ．Ａｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ
ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｆｏｒｃｏｒｎｅａｌｃｕｒｖａｔｕｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｔｈｅｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄ
ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａｇｅｎｅａｓａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓｆｏｒｅｙｅ
ｓｉｚｅｉｎｗｈｉｔｅＥｕｒｏｐｅａｎｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｖｉｓｉｏｎ，２０１３，１９：２４３．
［１２］ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＫＣＤＳ，ＬｉｍａＪＣ，ＦｅｔＡＧ．Ｐｉｎｅｏｌｅｏｒｅｓｉｎ：ｔａｐｐｉｎｇ
ｇｒｅｅｎｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｂｉｏｆｕｅｌｓ，ｆｏｏｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄｃａｒｂｏｎｓｅｑｕｅｓｔｒａ
ｔｉｏｎｆｒｏｍｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅｔｒｅｅｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄａｎｄＥｎｅｒｇｙＳｅｃｕｒｉｔｙ，２０１３，
１（２）：８１
!
９３．
［１３］ＴｈｏｌＤ．Ｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｓａｎｄｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｒｏｌｅｓｏｆｔｅｒｐｅｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．ＣｕｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌ
ｏｇｙ，２００６，９（１）：１－８．
［１４］ＶｒａｎｏｖáＥ，ＣｏｍａｎＤ，ＧｒｕｉｓｓｅｍＷ．ＮｅｔｗｏｒｋａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＭＶＡ
ａｎｄＭＥＰｐａｔｈｗａｙｓｆｏｒｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌｒｅｖｉｅｗｏｆ
ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，６４：６６５－７００．
［１５］李思广，付玉嫔，蒋云东．４０个高产脂思茅松无性系的松脂化
学组成特征［Ｊ］．西部林业科学，２００８，３７（２）：６１－６５．
［１６］ＸｉａｎｇＳ，ＵｓｕｎｏｗＧ，ＬａｎｇｅＧ，ｅｔａｌ．１ＤｅｏｘｙｄＸｙｌｕｌｏｓｅ５Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅＳｙｎｔｈａｓｅ（ＤＸＳ），ａｃｒｕｃｉａｌｅｎｚｙｍｅｆｏｒｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ．Ｉｎｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｐｌａｎｔｓａｎｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｍ］．Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．２０１３，１７－２８．
［１７］ＷａｌｔｅｒＭＨ，ＦｌｏｓｓＤＳ，ＰａｅｔｚｏｌｄＨ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｌａｓｔｉｄｉａｌｉｓｏ
ｐｒｅｎｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓｕｐｐｌｙ：ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ１ＤｅｏｘｙｄＸｙｌｕｌｏｓｅ５Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ＤＸＳ）ｉｓｏｇｅｎｅｓｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅａｌｏｃａｔｉｏｎｔｏｐｒｉｍａｒｙｏｒ
ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｉｎｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｐｌａｎｔｓａｎｄｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｍ］．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．２０１３，２５１－２７０．
［１８］ＥｎｆｉｓｓｉＥ，ＦｒａｓｅｒＰＤ，ＬｏｉｓＬＭ，ｅｔａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆ
ｔｈｅｍｅｖａｌｏｎａｔｅａｎｄｎｏｎ
$
ｍｅｖａｌｏｎａｔｅｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
$
ｆｏｒｍｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｅａｌｔｈ
$
ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｉｓｏｐｒｅ
ｎｏｉｄｓｉｎｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ，２００５，３（１）：１７
－２７．
［１９］ＫｉｍＹＢ，ＫｉｍＳＭ，ＫａｎｇＭＫ，ｅｔａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｎａｃｉｄ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＰｉｎｕｓｄｅｎｓｉｆｌｏｒａｂｙｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓ
ｅｎｃｏｄｉｎｇｍｕｌｔｉｐｌｅ１ｄｅｏｘｙｄｘｙｌｕｌｏｓｅ５ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅａｎｄ１
ｈｙｄｒｏｘｙ２ｍｅｔｈｙｌ２（Ｅ）ｂｕｔｅｎｙｌ４ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｇｅｎｅｓ
［Ｊ］．ＴｒｅｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００９，２９（５）：７３７－７４９．
［２０］ＢａｔｉｌａｎａＪ，ＣｏｓｔａｎｔｉｎｉＬ，ＥｍａｎｕｅｌｉＦ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅ１ｄｅｏｘｙｄｘｙｌｕ
ｌｏｓｅ５ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｓｗｉｔｈａｍａｊｏｒＱＴＬａｆｅｃｔ
ｉｎｇｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎｇｒａｐｅｖｉｎｅ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄａｐｐｌｉｅｄ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００９，１１８（４）：６５３－６６９．
［２１］ＸｕＹ，ＬｉｕＪ，ＬｉａｎｇＬ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ
ｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｃＤＮＡｓｅｎｃｏｄｉｎｇ１ｄｅｏｘｙｄｘｙｌｕｌｏｓｅ５ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎ
ｔｈａｓｅｉｎＡｑｕｉｌａｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｇｉｌｇ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，８２：１３３－１４１．
［２２］ＰｅｎｇＧ，ＷａｎｇＣ，ＳｏｎｇＳ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆ１ｄｅｏｘｙｄｘｙｌｕｌｏｓｅ５
ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅａｎｄｐｈｙｔｏｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｃｉｔｒｕｓｃａ
ｒｏｔｅｎｏｉｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２０１３，７１：６７－７６．
［２３］ＰｈｉｌｉｐｓＭＡ，ＷａｌｔｅｒＭＨ，ＲａｌｐｈＳＧ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｄｅｎｔｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ１ｄｅｏｘｙＤｘｙｌｕｌｏｓｅ５ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｓｙｎｔｈａｓｅｉｎｉｎｄｕｃｅｄｔｅｒｐｅｎｏｉｄｒｅｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＮｏｒｗａｙｓｐｒｕｃｅ
（Ｐｉｃｅａａｂｉｅｓ）［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，６５（３）：２４３
－２５７．
［２４］ＡｚｅｖｅｄｏＨ，ＬｉｎｏＮｅｔｏＴ，ＴａｖａｒｅｓＲＭ．Ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒ
ｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｎｅｅｄｌｅｓｏｆａｄｕｌｔｍａｒｉｔｉｍｅｐｉｎｅｔｒｅｅｓ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｒｅｐｏｒｔｅｒ，２００３，２１（４）：３３３－３３８．
［２５］王　雁，李　贞，刘小侠，等．白皮松总 ＲＮＡ３种提取方法的比
较研究［Ｊ］．安徽农业科学，２０１１，３９（２３）：１３９５８－１３９５９．
［２６］ＺｈａｎｇＭ，ＬｉＫ，ＺｈａｎｇＣ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆｃｌａｓｓ１ＤＸＳｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇ１ｄｅｏｘｙＤｘｙｌｕｌｏｓｅ５ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎ
ｔｈａｓｅ，ｔｈｅｆｉｒｓｔｃｏｍｍｉｔｅｄｅｎｚｙｍｅｏｆｔｈｅＭＥＰｐａｔｈｗａｙｆｒｏｍｓｏｙｂｅａｎ
［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｒｅｐｏｒｔｓ，２００９，３６（５）：８７９－８８７．
［２７］张文勇，刘永刚．思茅松人工林遗传改良研究现状与展望［Ｊ］．
广西林业科学，２０１０，３９（２）：９３－９６．
８３８