全 文 ：书唐古特白刺质膜犖犪＋／犎＋逆向转运
蛋白基因的克隆与表达分析
郑琳琳，张慧荣，贺龙梅，王迎春
（内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特０１００２１）
摘要：土壤中过多的 Ｎａ＋ 会导致植物产生盐害，严重影响植物的生长和发育。质膜型 Ｎａ＋／Ｈ＋ 逆向转运蛋白
犛犗犛１介导植物细胞内过量的Ｎａ＋外排，在植物抵御盐胁迫过程中起着重要的作用。唐古特白刺隶属于蒺藜科白
刺属，是中国特有的盐生植物，主要生长于西北地区的荒漠或盐渍化荒漠，具有极强的抗逆能力。应用简并
ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术克隆获得唐古特白刺Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白犖狋犛犗犛１基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＫＣ２９２２６７）。
序列分析显示，该ｃＤＮＡ全长４００８ｂｐ，包含３４９２ｂｐ的开放阅读框，编码分子量为１２７．５９ｋＤａ的蛋白质。疏水性
分析预测犖狋犛犗犛１基因编码蛋白Ｎ端具有１１个跨膜结构域，Ｃ端具有一个面向胞质的长亲水尾部，包含保守环核
苷酸结合区域、自我抑制基序及磷酸化位点等多个活性调控结构域。犖狋犛犗犛１氨基酸序列与葡萄、霸王、拟南芥等
植物的犛犗犛１序列同源性较高，分别可达７１．７７％，６８．９４％，６２．６５％。系统发育分析表明犖狋犛犗犛１基因为质膜型
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白，与液泡型Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白属于不同分支。半定量ＲＴ－ＰＣＲ结果显示冷、热、盐和
干旱胁迫都可以诱导 犖狋犛犗犛１基因的表达，同时，犖狋犛犗犛１基因随着盐处理浓度增加呈现出先上升（０～３００
ｍｍｏｌ／Ｌ）后下降（４００ｍｍｏｌ／Ｌ）的趋势。结合植物的生境特点和犖狋犛犗犛１表达模式分析，该基因表达水平的升高可
能在唐古特白刺适应恶劣生境的过程中发挥积极作用。本研究的开展为利用犖狋犛犗犛１基因进行作物与牧草改良
并深入研究唐古特白刺抗逆分子机制奠定了基础。
关键词：盐生植物；唐古特白刺；质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白
中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０４０１７９０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０４２２
土壤中过量的盐特别是Ｎａ＋会导致盐害的产生，严重影响植物的生长发育和产量［１］。保持细胞内低Ｎａ＋浓
度对于植物实现正常生理代谢，抵御盐害十分重要。盐胁迫条件下植物主要通过细胞质膜或液泡膜上的Ｎａ＋／
Ｈ＋逆向转运蛋白，将Ｎａ＋外排或区隔化在液泡中，以降低细胞质内Ｎａ＋含量。质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白利用
跨膜质子梯度产生的驱动力，将胞内过量的Ｎａ＋逆浓度差转运出细胞，从而减少Ｎａ＋毒害，是目前唯一一种介导
Ｎａ＋外排的质膜整合蛋白，在植物抵御盐胁迫过程中发挥着关键作用［２，３］。
植物中质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白（ＮＨＡ或ＳＯＳ１）的活性首先在大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）中被发现［４］，随
后相继从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、番茄（犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）、藜麦（犆犺犲狀狅狆狅犱犻
狌犿狇狌犻狀狅犪）等甜土植物［５１０］和胡杨（犘狅狆狌犾狌狊犲狌狆犺狉犪狋犻犮犪）、星星草（犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪）、盐芥（犜犺犲犾犾狌狀犵犻犲犾犾犪
犺犪犾狅狆犺犻犾犪）、盐地碱蓬（犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪）等盐生植物［１１１７］中得以克隆，并确定其参与植物根部Ｎａ＋的外排。突变体
功能互补实验或过表达转基因植株的耐盐生理分析证实，犛犗犛１可以恢复或提高转化体的耐盐能力［１８２３］。通常
情况下，盐生植物相较于甜土植物具有更低的胞内 Ｎａ＋含量。Ｔａｋａｈａｓｈｉ等［２３］发现，来源于耐盐基因型芦苇
（犘犺狉犪犵犿犻狋犲狊犪狌狊狋狉犪犾犻狊）的犛犗犛１比盐敏感基因型芦苇的犛犗犛１能够更有效的将过量的Ｎａ＋排出细胞，更大程度
地提高转基因酵母的耐盐能力。由此可见，从植物中特别是盐生植物中发掘犛犗犛１基因并对其进行深入研究，对
于获得优良基因元件和耐盐基因工程具有重要的应用价值。
第２２卷 第４期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１７９－１８６
２０１３年８月
收稿日期：２０１２１２２０；改回日期：２０１３０２２０
基金项目：国家自然科学基金主任基金项目（３１１４００２０），内蒙古自然科学基金重大项目（２０１２ＺＤ０５）和内蒙古自治区教育厅项目（３１００１５）资助。
作者简介：郑琳琳（１９８３），女，内蒙古呼伦贝尔人，讲师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：１３８５６２６５＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｃｗａｎｇ＠ｉｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
唐古特白刺（犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿）为蒺藜科（Ｚｙｇｏｐｈｙｌａｃｅａｅ）白刺属（犖犻狋狉犪狉犻犪）的一种建群性落叶灌木，属
中国特有，起源于第三纪，广泛分布于内蒙古、青海、甘肃等中国西北地区。唐古特白刺具有抗高温、抗沙埋、耐干
旱、耐盐碱、耐严寒等生物学特性，是在严酷生境中经过长期的自然选择保留下来的优胜者［２４］。唐古特白刺可在
含盐量２％ 左右、ｐＨ９．７的土壤中正常生长，尤为重要的是，唐古特白刺沙埋后可通过克隆生长形成白刺包，是
防治土壤荒漠化和盐碱化的先锋植物［２５］，同时，作为名贵中药材锁阳（犆狔狀狅犿狅狉犻狌犿狊狅狀犵犪狉犻犮狌犿）的主要寄主［２６］，
唐古特白刺具有较高的经济价值。然而，对于这种优质野生抗逆资源植物，由于受到遗传背景和基因数据缺乏的
局限，除了张建秋等［２７，２８］采用ｍＲＮＡ差异显示技术分离到２７个与盐碱胁迫相关的基因片段外，未见关于白刺
抗逆分子生物学的研究。目前，ｃＤＮＡ末端快速扩增法 （ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）广泛应用于抗
逆基因的克隆［２９，３０］，本实验应用该技术克隆唐古特白刺质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因犖狋犛犗犛１并对其进行分
析，以期为探讨唐古特白刺耐盐分子机制和合理开发利用白刺资源提供相关资料。
１ 材料与方法
１．１ 材料
唐古特白刺种子于２０１２年７月采自内蒙古自治区东阿拉善－西鄂尔多斯荒漠区（１０６°２７′～１１１°２８′Ｅ，
３９°１３′～４０°５２′Ｎ，海拔１５００～２１００ｍ），经表面消毒后播种于 ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培养基中。８周龄幼
苗用作实验材料。
大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α、ｐＰＺＰ２２１由内蒙古大学牧草与特色作物生物技术省部共建教育部重点
实验室提供。
所用化学试剂均为国产分析纯；ＤＮＡ限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，Ｔａｑ酶、Ｍａｒｋｅｒ
购自 ＴｒａｎｓＧｅｎ公司；总 ＲＮＡ 分离采用 ＲＮＡｉｓｏ试剂（Ｔａｋａｒａ），ｃＤＮＡ 合成采用 ＭＭＬＶ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅＫｉｔｓ反转录试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ），犖狋犛犗犛１ｃＤＮＡ全长采用ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）获得；寡核苷酸引物合成和产物测序由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司承担。
１．２ 研究方法
１．２．１ 植物胁迫处理 待幼苗长至８周时，置于含有１０％ＰＥＧ６０００或２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ液体培养基、
５０℃或４℃中胁迫处理６ｈ；同时，将幼苗移至含有１００，２００，３００及４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的 ＭＳ液体培养基中盐胁
迫６ｈ，处理结束后收取叶片作为实验材料，经液氮速冻后置于－８０℃保存备用。
１．２．２ 总ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ合成 将各样品加入液氮研磨至粉末状，按照ＲＮＡｓｉｏ总ＲＮＡ抽提试剂盒的
操作说明提取叶片总ＲＮＡ，用１％的琼脂糖凝胶鉴定其质量和完整性；利用 ＭＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＫｉｔｓ
将１μｇＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，并最终将其稀释为２０ｎｇ／μＬ。
１．２．３ 犖狋犛犗犛１全长ｃＤＮＡ序列的扩增 通过对ＧｅｎＢａｎｋ中发表的多种植物ＳＯＳ１核苷酸序列进行同源比
对，找出高度保守区域，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计一对简并引物ＤＥＦ［５′ＴＣＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣ
３′］和ＤＥＲ［５′ＡＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＧＡＴＧ３′］，用于扩增唐古特白刺犛犗犛１基因片
段，推测目的片段长度为３６５ｂｐ。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，内含２ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、引物各
１．０μｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．０Ｕ，２０ｎｇ模板ｃＤＮＡ。ＰＣＲ扩增程序为９４℃ 预变性５ｍｉｎ；然后９４℃变性
３０ｓ，４６℃退火３０ｓ，７２℃ 延伸３０ｓ，共３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。将扩增得到的保守片段ｃＤＮＡ插入
到ｐＭＤ１９Ｔｓｉｍｐｌｅ载体上，进行双向序列测定。对测序结果进行Ｂｌａｓｔ在线分析，确认其为犖狋犛犗犛１保守区段
后，设计３′ｒａｃｅ引物（ＧＳＰ３：５′ＣＣＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＧＡＧＴＧＡＧＡ３′）和５′ｒａｃｅ引物（ＧＳＰ５：５′ＧＣＡ
ＴＡＣＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＧＴＧＣ３′）。参照ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒操作方
法，结合试剂盒内提供的锚定引物进行犖狋犛犗犛１的３′和５′末端扩增。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，内含２ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｍｇ２＋、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、１．０μｍｏｌ／ＬＧＳＰ３（ＧＳＰ５）、０．０４μｍｏｌ／ＬｌｏｎｇＵＰＭ、０．２μｍｏｌ／ＬｓｈｏｒｔＵＰＭ、Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶１．０Ｕ，２０ｎｇ３′ＲＡＣＥＲＥＡＤＹｃＤＮＡ（５′ＲＡＣＥＲＥＡＤＹｃＤＮＡ）。ＰＣＲ扩增程序为９５℃变性３０
ｓ，６８℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共３５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。将扩增得到的片段测序后用ｖｅｃｔｏｒＮＴＩ
１１．５软件拼接在一起，得到犖狋犛犗犛１基因全长ｃＤＮＡ序列。
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１．２．４ 犖狋犛犗犛１基因生物信息学分析 犖狋犛犗犛１基因编码蛋白的序列比对和开放阅读框分析通过ＮＣＢＩ网站
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）的ＢｌａｓｔＰ和ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ软件进行在线操作；利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件预测蛋白
的理论分子量和等电点；蛋白的跨膜结构通过ＴＭＰＲＥＤ在线程序进行分析；犛犗犛１蛋白多序列比对和系统进化
树构建由ＣｌｕｓｔａｌＸ和 ＭＥＧＡ４．０软件执行。
１．２．５ 半定量 ＲＴ－ＰＣＲ表达分析 根据 犖狋犛犗犛１编码区和唐古特白刺βａｃｔｉｎ序列（ＧｅｎＢａｎｋ 登录号
ＡＢ６１７８０５．１）信息［３１］，设计一对用于半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析的特异引物（ＳＯＳ１Ｆ：５′ＧＣＴＡＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡＧ
ＧＣＡＧＧＡＴ３′、ＳＯＳ１Ｒ：５′ＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＴＧ３′）和一对对照引物（ＡＣＴＩＮＦ：５′ＧＧＡＡＴＣ
ＣＡＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡ３′、ＡＣＴＩＮＲ：５′ＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡ３′），扩增长度分别为２０８和
２１９ｂｐ。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，内含２ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、引物各１．０μｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ 聚
合酶１．０Ｕ，２０ｎｇ模板ｃＤＮＡ。ＰＣＲ反应程序为９４℃预变性１ｍｉｎ，９４℃变性２０ｓ、５５℃退火３０ｓ、７２℃延伸４０
ｓ，２８个循环，ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳分离观察。进行３次重复实验，通过比较目的条带的亮度来判定
基因表达强弱。
２ 结果与分析
２．１ 犖狋犛犗犛１全长ｃＤＮＡ的克隆
使用简并引物ＤＥＦ和ＤＥＲ进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得一个与预期片段相符约３６５ｂｐ的ｃＤＮＡ片段。Ｂｌａｓｔ
比对证实该ｃＤＮＡ片段与已知的质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白具有较高的同源性，说明获得的片段为Ｎａ＋／Ｈ＋逆
向转运蛋白的保守区域。根据保守区域片段设计ＲＡＣＥ引物，获得犖狋犛犗犛１基因的３′和５′末端（图１）。
图１ 唐古特白刺犖狋犛犗犛１基因全长犮犇犖犃的扩增
犉犻犵．１ 犜犺犲犳狌犾犾犲狀犵狋犺犮犇犖犃犮犾狅狀犻狀犵狅犳犖狋犛犗犛１
Ｌ１：保守区扩增结果；Ｌ２：５′ＲＡＣＥ结果；Ｌ３：３′ＲＡＣＥ结果；Ｍ：ＤＮＡ分子量。Ｌ１：Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犖狋犛犗犛１；Ｌ２：Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅ５′ＲＡＣＥ；Ｌ３：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅ３′ＲＡＣＥ；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
２．２ ＮｔＳＯＳ１氨基酸序列分析
经核苷酸推导ＮｔＳＯＳ１蛋白含有１１６３个氨基酸，理论分子量为１２７．５９ｋＤａ，等电点为６．４３。氨基酸同源
性分析表明，ＮｔＳＯＳ１氨基酸序列与葡萄（犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪，ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＣＹ０３２７４）、霸王（犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀
狋犺狅狓狔犾狌犿，ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＣＺ５７３５７）、拟南芥（ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＡＡＦ７６１３９）等植物的犛犗犛１序列同源性较
高，分别可达７１．７７％，６８．９４％，６２．６５％。
ＴＭｐｒｅｄ软件预测犖狋犛犗犛１Ｎ端包含１１个完全跨膜结构域，与已报道的动植物及微生物的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转
运蛋白的跨膜区域数（１０～１２）吻合。Ｃ端具有一个长约７００ｂｐ面向细胞质的亲水性尾部，含有多个重要功能结
构域，包括保守环核苷酸结合区域ＣＮＢＤ（ｃｙｃｌｉｃｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ），自我抑制结构域基序１和基序２，苏
氨酸／丝氨酸激酶ＳＯＳ２识别及磷酸化结构域 （图２）。
１８１第２２卷第４期 草业学报２０１３年
图２ 犖狋犛犗犛１氨基酸与葡萄、霸王、拟南芥同源序列的比对结果
犉犻犵．２ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犖狋犛犗犛１狑犻狋犺狅狋犺犲狉犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊狊犲狇狌犲狀犮犲狊
划线部分表示ＮｔＳＯＳ１跨膜结构ＴＭ１～ＴＭ１１，ＣＮＢＤ结构域，自我抑制结构域和磷酸化结构域。箭头表示ＳＯＳ２激酶的识别和磷酸化位点。
Ｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ（ＴＭ１－ＴＭ１１），ＣＮＢＤｄｏｍａｉｎ，ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｏｆＮｔＳＯＳ１ａｒｅｕｎｄｅｒｔｈｅ
ｂｌａｃｋｌｉｎｅ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｉｔｅａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｉｎｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎａｒｅａｒｒｏｗｅｄ．犞狏犛犗犛１：葡萄犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪，犣狓犛犗犛１：霸王犣狔犵狅
狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿；犃狋犛犗犛１：拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪．
系统进化树分析显示Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白明显分为两大分支，犖狋犛犗犛１与其他植物质膜型Ｎａ＋／Ｈ＋逆向
转运蛋白亲缘关系近，同属第一分支，而液泡型Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白则属于与之亲缘关系较远的另一分支（图
３）。以上结果证实犖狋犛犗犛１确为唐古特白刺质膜型Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因。
２．３ 犖狋犛犗犛１基因表达特性分析
在正常生长条件下，犖狋犛犗犛１有少量表达，这说明犖狋犛犗犛１在唐古特白刺中属于组成型表达。在６ｈ高盐
（２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）、干旱（１０％ＰＥＧ）、低温（４℃）及高温（５０℃）胁迫下，犖狋犛犗犛１基因均上调表达（图４），尤其
在高盐和干旱处理中基因表达量的升高程度较大。进一步研究发现，随着ＮａＣｌ浓度（０～３００ｍｍｏｌ／Ｌ）的增加，
犖狋犛犗犛１基因表达量持续上升，随后在４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理时表达量出现下降（图５）。这些结果说明犖狋
犛犗犛１不仅在唐古特白刺的耐盐过程中发挥重要作用，而且可能与唐古特白刺对于其他胁迫的适应机制密切相关。
２８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
图３ 犖狋犛犗犛１与其他植物的犖犪＋／犎＋逆向转运蛋白的系统进化分析
犉犻犵．３ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犖狋犛犗犛１犪狀犱狅狋犺犲狉犖犪＋／犎＋犪狀狋犻狆狅狉狋犲狉狊
分支上的数值代表自展支持率。Ｎｕｍｅｒｉｃｄａｔａｏｎｔｈｅｂｒａｎｃｈｒｅｐｒｅｓｅｎｔｂｏｏｔｓｔｒａｐｖａｌｕｅ．
图４ 不同胁迫条件下犖狋犛犗犛１基因表达模式分析
犉犻犵．４ 犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犖狋犛犗犛１犵犲狀犲狅犳
犖．狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿狌狀犱犲狉犿狌犾狋犻狆犾犲犪犫犻狅狋犻犮狊狋狉犲狊狊犲狊
图５ 盐胁迫条件下犖狋犛犗犛１基因表达分析
犉犻犵．５ 犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犖狋犛犗犛１犵犲狀犲狅犳
犖．狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿狉犲狊狆狅狀犱狊狋狅狊犪犾狋狊狋狉犲狊狊
３ 讨论
在植物抵御盐害过程中，质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白ＳＯＳ１发挥着外排过量Ｎａ＋、维持胞内离子平衡的作
用，对其进行深入系统的研究意义重大［３１］。目前，研究最为透彻的是盐胁迫条件下拟南芥中的ＳＯＳ信号通
路［３２］。在水稻和盐芥［３３］中也发现了相似的ＳＯＳ路径，以上研究表明盐生植物和甜土植物可能共用一套耐盐机
制。Ｚｈｕ［３］和Ｑｕｉｎｔｅｒｏ等［３４］对拟南芥犛犗犛１研究发现，ＡｔＳＯＳ１蛋白的Ｃ端含有犛犗犛２识别及磷酸化结构域，具
有一个识别位点和一个磷酸化位点，这２个位点为犛犗犛１激活所必需；同时存在一个自我抑制结构域，在未被
犛犗犛２激酶催化时与ＣＮＢＤ结构域协同作用抑制犛犗犛１的活性。然而，这些研究多集中于模式植物，关于野生耐
盐植物犛犗犛１的研究较为少见。因此，本研究选取在中国西北地区广泛分布，具有极强抗逆性的唐古特白刺作为
实验材料，从中克隆出犖狋犛犗犛１基因，氨基酸序列分析结果显示，ＮｔＳＯＳ１蛋白Ｃ末端也含有与拟南芥相同的调
３８１第２２卷第４期 草业学报２０１３年
控位点和结构域，这说明在唐古特白刺中，可能也存在ＳＯＳ信号通路，其调控机制与拟南芥相似。聚类分析结果
表明犖狋犛犗犛１属于质膜型Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白家族，与同为蒺藜科的霸王犣狓犛犗犛１亲缘关系较近。
植物中犛犗犛１基因在不同胁迫下的表达模式差异较大。Ｓｈｉ等［５］发现盐胁迫可显著提高拟南芥犃狋犛犗犛１的
表达量，而外源ＡＢＡ和冷处理对其没有影响；水稻犗狊犖犎犃１可受盐诱导表达，但干旱处理无诱导作用［８］。大岛
野路菊犆犮犛犗犛１表达水平在盐胁迫下快速升高，干旱、低温和 ＡＢＡ处理均可在不同程度上影响犆犮犛犗犛１表
达［１６］。本研究中，犖狋犛犗犛１在盐、高温、低温及干旱处理条件中，犖狋犛犗犛１表达量均有不同程度的升高，尤其在盐
和干旱胁迫中表达量上升明显；而且犖狋犛犗犛１基因表达量随着盐处理浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。唐
古特白刺多分布于中国西北的沙漠或盐渍化荒漠，如东阿拉善－西鄂尔多斯荒漠区。该地区存在多种制约植物
生长的不利环境因素，如温度（极端最高气温３９．４℃，极端最低气温－３２．６℃）、干旱（年平均降水量１４０．９～
３０２．２ｍｍ），土壤盐分（含盐量最高可达３％）等［３５］。结合唐古特白刺的生境特点和犖狋犛犗犛１表达模式分析，该基
因表达水平的升高可能在唐古特白刺适应恶劣生境的过程中发挥积极作用。
Ｗａｎｇ等［１３］和Ｓｈｉ等［２０］分别利用星星草犘狋犛犗犛１和拟南芥犃狋犛犗犛基因转化拟南芥过表达，均发现转基因植
株的耐盐性明显提高。Ｙｕｅ等［１９］将犃狋犛犗犛１基因转入番茄中过量表达，结果显示转化植株可以维持胞内较高的
Ｋ＋／Ｎａ＋，增强其耐盐能力。另一方面，Ｗｕ等［１５］将胡杨犘犲犛犗犛１基因转化大肠杆菌Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白犈犮
犖犺犪犃和犈犮犖犺犪犅 双缺失突变体ＥＰ４３２，发现犘犲犛犗犛１基因的表达可以使转基因ＥＰ４３２在对照菌株几乎无法存
活的盐浓度 （２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）下正常生长。Ｓｏｎｇ等［１６］将大岛野路菊犆犮犛犗犛１基因转入酵母Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转
运蛋白缺失突变体犲狀犪１狀犺狓１和犲狀犪１狀犺犪１中，可以使转化突变体排Ｎａ＋能力恢复到野生型水平。这些研究说明
利用犛犗犛１基因转化提高植物耐盐能力，是可行的耐盐基因工程策略。目前，已成功构建犖狋犛犗犛１基因的植物表
达载体，后续研究中拟将该基因转化双子叶模式植物拟南芥，获得耐盐性提高的转基因植株，为将唐古特白刺作
为一种种质资源应用于作物及牧草的基因改良提供参考。
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犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｅｘｃｅｓｓｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｓｏｄｉｕｍｉｏｎｉｎｓｏｉｌｉｓａｍａｊｏｒｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｔｏｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐ
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ｆｒｏｍｃｅｌｓ，ａｎｄｉｔｐｌａｙｓａｃｒｕｃｉａｌｒｏｌｅｉｎｐｌａｎｔｓａｌｉｎｉｔｙｔｏｌｅｒａｎｃｅ．犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿，ａｓｈｒｕｂｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏｔｈｅ
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Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓ．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ犖狋犛犗犛１ｍＲＮＡｗａｓｃｌｅａｒｌｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆＮａＣｌ，ＰＥＧ，
ｃｏｌｄａｎｄｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，犖狋犛犗犛１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｂｕｎｄａｎｃｅｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＮａＣｌｃｏｎｃｅｎ
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ｍｅｎｔ．Ｏｕｒｗｏｒｋｏｆｆｅｒｓａｓｏｌｉｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃｒｏｐｓａｎｄｈｅｒｂａｇｅｓｗｉｔｈ犖狋犛犗犛１ｇｅｎｅ
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６８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４