全 文 :苍耳提取物对萝卜蚜和粘虫作用方式及
解毒酶活性影响的研究
张君霞1,2,张新虎2,沈慧敏2
(1.甘肃农业大学林学院,甘肃 兰州730070;2.甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点
实验室 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州730070)
摘要:采用室内生测法,研究了苍耳3种溶剂(丙酮、乙醇、氯仿)提取物对萝卜蚜和粘虫的作用方式及苍耳氯仿提
取物对两种试虫的3种解毒酶活性的影响。结果表明,苍耳氯仿提取物对萝卜蚜有很强的忌避作用,当浓度为
0.05g/mL,处理4h,忌避率达94.25%,48h忌避率为84.53%;其次是触杀作用,校正死亡率最高为67.24%,
LC50为0.7420g/mL;内吸作用极弱。对粘虫主要表现为拒食和生长发育抑制作用,拒食校正死亡率最高达
98.27%,AFC50为0.1985g/mL;72h体重增长率为-5.85%,与对照差异极显著;胃毒和触杀毒力较弱,LC50分别
为0.8997和1.3070g/mL。苍耳氯仿提取物对萝卜蚜和粘虫的乙酰胆碱酯酶(AchE)有抑制作用,处理萝卜蚜24
h及处理粘虫4h时,乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制率最高,分别为37.55%和25.65%;对谷胱甘肽转移酶(GSTs)和
多功能氧化酶(MFO)活力影响不明显。
关键词:苍耳;杀虫作用方式;解毒酶
中图分类号:S433 文献标识码:A 文章编号:10045759(2014)04027609
犇犗犐:10.11686/cyxb20140434
苍耳(犡犪狀狋犺犻狌犿狊犻犫犻狉犻犮狌犿)为菊科苍耳属(犡犪狀狋犺犻狌犿)一年生草本植物,在我国林地、农田和草地均广泛分
布。苍耳全株有毒,幼芽和果实的毒性最大,茎叶中含有对神经及肌肉有毒的物质,作为中药具有散风除湿、拘挛
麻木、通窍止痛、解毒杀虫的作用[14]。
在植物源农药领域,苍耳提取物的杀菌活性已有很多报道。如杨顺义[5]、郭东艳[6]、何静等[7]、刘林和孟昭
礼[8]、李玉平等[9]、张君霞[10]发现苍耳不同部位丙酮提取液对番茄灰霉病、辣椒丝核病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄早
疫病菌、黄瓜黑星病菌、葡萄白腐病菌、苹果腐烂病菌、小麦赤霉病菌等菌丝生长及孢子萌发均有较强抑制作用;
冯俊涛等[11]在室内采用黄瓜子叶法测定苍耳全株丙酮提取物对番茄灰霉病的防护作用为65.1%,而盆栽试验对
小麦白粉病的治疗效果72.5%。Amerjothy等[12]研究发现印度苍耳(犡.犻狀犱犻犮狌犿)的正己烷提取物对白色念珠
菌、黑曲霉、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌有明显抑制作用。同时,有人对苍耳的化感活性也做了研究,如李美
等[13]报道苍耳丙酮提取物对作物幼根及幼茎的生长有较强的抑制作用,其10g/L的丙酮提取物对黄瓜(犆狌犮狌
犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊)幼根的抑制率高达82.6%,在质量浓度为5g/L时对油菜(犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊)和高粱(犛狅狉犵犺狌犿
狏狌犾犵犪狉犲)幼根的生长抑制率分别为90.7%和92.1%;高兴祥等[14]报道苍耳水浸提液对油菜种子的萌发和生长
最为敏感,有较强的抑制作用,其次为萝卜(犚犪狆犺犪狀狌狊狊犪狋犻狏狌狊)。
关于其杀虫活性,张兴等[15]在对西北地区杀虫植物资源进行初步调查中首次发现了苍耳具有杀虫活性;周
琼等[1617]报道了苍耳分离物对小菜蛾有拒食和忌避活性(或产卵忌避性);王国夫等[18]报道苍耳乙醇提取物对菜
粉蝶的拒食率为96.24%,丙酮提取物触杀效果最好(48h校正死亡率为81.48%);何道航[19]对苍耳的杀虫活性
物质进行了分离鉴定,发现其主要为苍耳素、β谷甾醇和苍术甙,茎叶和种子是其主要的活性部位。而在杀虫机
理方面,仅见何道航[19]和熊正燕等[20]报道:何道航[19]报道苍耳对菜粉蝶的作用机理主要是降低幼虫的血淋巴总
276-284
2014年8月
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA
第23卷 第4期
Vol.23,No.4
收稿日期:20130819;改回日期:20131120
基金项目:甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW200408)和甘肃农业大学盛彤笙基金(GSAUSTS1426)资助。
作者简介:张君霞(1981),女,甘肃甘谷人,讲师,在读博士。Email:zhangjx@gsau.edu.cn
通讯作者。Email:ndshm@gsau.edu.cn
糖和蛋白质含量,并对中肠酯酶活力有较明显抑制作用;熊正燕等[20]报道了苍耳氯仿萃取物对粘虫的拒食作用
及消化酶活性的影响,结果表明处理粘虫12h中肠蛋白酶、淀粉酶和羧酸酯酶活性均被明显抑制。以上研究结
果表明,以苍耳为植物源农药原料,对不同危害方式害虫的杀虫作用方式及对其解毒酶影响的研究还未见报道。
因此,本文针对此问题进行研究,以期进一步明确苍耳提取物的杀虫作用方式及作用机理,为苍耳植物源农药的
开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
苍耳2009年8月下旬采自甘肃兰州。苍耳茎叶洗净%干,粉碎过40目筛(孔径0.37mm)后密封,置4℃冰
箱中保存备用。
萝卜蚜(犔犻狆犪狆犺犻狊犲狉狔狊犻犿犻):虫源采自兰州刘家堡乡菜豆(犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊)地,在实验室盆栽菜豆苗上继
代饲养,选个体大小一致,健康活泼的无翅成蚜作为供试蚜虫。
粘虫(犕狔狋犺犻犿狀犪狊犲狆犪狉犪狋犪):甘肃农业大学养虫室内饲养,选取同代健康活泼的3~4龄幼虫供试粘虫。养
虫室饲养条件:温度(25±5)℃;相对湿度(50±5)%;光照周期12h∶12h(L∶D)。
1.2 试验方法
1.2.1 苍耳提取物提取方法 取粉碎植物样品20g装入滤纸筒中,以索氏抽提法[7]分别用乙醇、氯仿、丙酮提
取72h,提取液用旋转蒸发仪浓缩至少量转入刻度试管中,分别用其提取溶剂定容至20mL,浓度相当于每毫升
溶液含1g干样品(1g/mL),并将其用相应溶剂稀释为1,0.7,0.4,0.1和0.05g/mL5个浓度梯度。
1.2.2 触杀作用 萝卜蚜:采用浸虫法[21],剪取有萝卜蚜的新鲜菜豆叶,在苍耳不同浓度提取物中浸3s,放入9
cm培养皿。每处理150头萝卜蚜,设溶剂和清水对照。24h后观察其死亡情况,计算死亡率、校正死亡率,求出
毒力回归式和致死中浓度LC50(LC50值表示杀死有害生物50%个体所需要的药剂浓度)。本研究中所有死亡率、
校正死亡率计算公式如下:
死亡率(%)=
死亡虫数
处理虫数×100
校正死亡率(%)=
处理组死亡率-空白对照组死亡率
100-空白对照组死亡率 ×100
粘虫:采用微量点滴法[21],选择3龄幼虫(平均体重5.6059mg/头)用微型进样器在中胸背板定量点滴(0.1
mL/头)不同浓度提取物。待溶剂挥发,每培养皿放入2头粘虫,每处理30头,再放入新鲜玉米(犣犲犪犿犪狔狊)叶
段,48h后记录死亡情况。计算死亡率、校正死亡率,求出毒力回归式和致死中浓度LC50。
1.2.3 内吸作用 将新鲜菜豆叶片叶柄插于不同浓度提取物中,72h后取出,放入保湿培养皿中,接入无翅成
蚜50头。重复3次,48h后观察其死亡率。计算死亡率、校正死亡率,求出毒力回归式和致死中浓度LC50。
1.2.4 忌避作用 采用选择性忌避方法[21]。将新鲜菜豆以叶中脉为界,一侧正反涂布苍耳提取物(浓度为0.05
g/mL),另一侧涂布溶剂作为对照,每侧各接无翅成蚜25头。重复3次,于4,24,48h后记录叶片上的萝卜蚜数
(叶中脉的萝卜蚜不计算在内),计算忌避率。
忌避率(%)=
对照虫数-处理虫数
对照虫数+处理虫数×100
1.2.5 拒食作用[2122] 新鲜玉米叶在不同浓度提取物中浸渍3s,打成直径为1cm的叶碟,放入培养皿,接入经
4h饥饿的4龄幼虫2头,每处理30头,设溶剂对照和清水空白对照。药后72h,用坐标纸法测量取食面积,计算
拒食率和校正拒食率。求出毒力回归式和拒食中浓度AFC50。
拒食率(%)=
对照组取食面积-处理组取食面积
对照组取食面积 ×100
校正拒食率(%)=
处理组拒食率-对照组拒食率
处理组拒食率 ×100
772第23卷第4期 草业学报2014年
1.2.6 胃毒作用 方法同1.2.5,记录药后72h死亡情况,计算死亡率、校正死亡率,求出毒力回归式和LC50。
1.2.7 生长调节作用 采用称体重法[2122]:具体方法与拒食法基本相同,用0.05g/mL苍耳氯仿提取物浸渍玉
米叶片3s,打成直径1cm叶碟,放入保湿培养皿,接入3龄幼虫2头,每处理30头,于24,48和72h后分别称体
重,计算体重增长率。
体重增长率(%)=
每时段平均体重-初始平均体重
初始平均体重 ×100
1.2.8 乙酰胆碱酯酶(AchE)活力测定 酶液的制备:以触杀作用测定方法处理试虫,处理浓度分别为其上述试
验所获得的触杀LC50,设溶剂处理为对照。在0,0.5,2,4,12,24h各取出处理组和对照组20头萝卜蚜、在0,
0.5,4,12,24,48h各取出处理组和对照组10头4龄粘虫的头部,分别加入0.1mol/L,pH7.2磷酸缓冲液4
mL,用玻璃匀浆器于冰浴中研磨,匀浆液在0~4℃条件下,3000r/min离心10min,取其上清液作酶源。
酶活力测定:参照 Manulis等[23]的方法,0.4mL反应体系中含50μL0.1mol/L的碘化硫代乙酰胆碱,0.1
mL酶液及0.1mol/L、pH为8.0的磷酸缓冲液,在25℃水浴箱反应15min,加入3.6mL对硝基苯甲酸(DT
NB)乙醇磷酸缓冲液,于412nm 处比色,测定OD412值。重复3次,根据酶液经蛋白质含量测定得出的每毫升
酶液相当的蛋白质含量,计算乙酰胆碱酯酶比活力,单位以μmol/(min·mL)表示。
抑制率(%)=
对照比活力-处理比活力
对照比活力 ×100
1.2.9 谷胱甘肽S转移酶(GSTs)活力 酶液制备:萝卜蚜用内吸法,粘虫用胃毒法(处理浓度分别为其内吸
LC50及胃毒LC50,设溶剂处理为对照),分别在0,4,8,12,24,48h各取对照组和处理组萝卜蚜50头和粘虫10
头,加0.25mL生理盐水冰浴中匀浆后,10000r/min,4℃下离心15min,取上清液备用。
酶活力测定:参照 Hansen和Hodgson[24]的方法,反应体系中谷胱甘肽(GSH)和CDNB均为1mmol/L,酶
液1mL,0.1mol/L、pH6.5磷酸缓冲液,反应总体积为3mL,25℃水浴箱中反应5min,于340nm 处比色,测
定OD340值,重复3次,根据酶源蛋白质测定结果,将OD值换算成比活力ΔOD,单位以ΔOD/(mg蛋白·mL)表
示。
1.2.10 多功能氧化酶(MFO)活力 酶液制备:试虫处理方法同内吸处理(萝卜蚜)和胃毒处理(粘虫)(处理浓
度分别为其内吸LC50及胃毒LC50,设溶剂处理为对照),分别在0,2,4,8,12,24h各取对照组和处理组萝卜蚜50
头,在0,4,8,12,24,48h各取对照组和处理组10头粘虫中肠,在1.5mL磷酸缓冲液(0.2mol/LpH7.8)中充
分匀浆后,10000r/min,4℃下离心15min,取上清液备用。
酶活力测定:参照Clark等[25]的方法,反应体系中1mmol/LNADPH溶液、0.1mmol/L对硝基苯甲醚:均
用缓冲溶液配制,磷酸缓冲液为pH6.5、0.1mol/L,30℃水浴箱中反应30min,加1mmol/LHCl1mL,终止反
应;再往试管中加5mL氯仿萃取,移取氯仿层3mL到另一试管内,加0.5mol/LNaOH3mL萃取;取NaOH
溶液层2mL于400nm处比色,测定OD400值,重复3次,根据对硝基苯酚标准曲线求得酶促反应生成的硝基苯
酚量,酶活力单位以μmol/(min·mL)表示。
1.3 统计分析
采用Excel软件进行统计,用SPSS17.0软件进行毒力回归分析及Duncan法显著性分析。
2 结果与分析
2.1 苍耳3种提取物对萝卜蚜和粘虫的杀虫作用方式
2.1.1 触杀作用 苍耳3种提取物对萝卜蚜和粘虫的触杀作用测定结果(表1)显示,苍耳3种溶剂提取物对萝
卜蚜和粘虫有一定的触杀作用,且随提取物浓度的增高触杀作用增强,同时显示,对萝卜蚜和粘虫触杀作用最高
的为氯仿提取物,校正死亡率最高分别为67.24%和47.90%,LC50分别为0.7420和1.3070g/mL,其次为丙酮
提取物,再次是乙醇提取物;另外,由表中可以看出,苍耳提取物对萝卜蚜的触杀作用整体较对粘虫的高。
2.1.2 内吸作用 苍耳3种溶剂提取物对萝卜蚜的内吸作用测定结果(表2)表明,苍耳各提取物对萝卜蚜的内
吸作用均较弱,乙醇、氯仿和丙酮提取物对萝卜蚜的内吸校正死亡率最高分别为12.35%,12.13%和10.46%,
LC50分别达到36.8347,42.7764和55.9830g/mL。
872 ACTAPRATACULTURAESINICA(2014) Vol.23,No.4
表1 苍耳提取物对萝卜蚜和粘虫的触杀作用测定
犜犪犫犾犲1 犜犲狊狋狅犳犮狅狀狋犪犮狋狋狅狓犻犮犻狋狔狅犳狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿狅狀犔.犲狉狔狊犻犿犻犪狀犱犕.狊犲狆犪狉犪狋犪
试虫
Testinsects
溶剂
Solvent
校正死亡率Correctedmortality(%)
1
g/mL
0.7
g/mL
0.4
g/mL
0.1
g/mL
0.05
g/mL
毒力回归式
Toxicregression
equation(狔=)
犚 LC50
(g/mL)
95%置信区间
Confidence
interval
萝卜蚜
犔.犲狉狔狊犻犿犻
氯仿Chloroform 67.24 42.36 27.56 18.32 7.65 1.3626狓+5.1766 0.9380 0.7420 0.2594~1.5937
乙醇Alcohol 47.32 36.59 24.98 14.65 6.42 1.0526狓+4.8564 0.9840 1.3691 0.9763~2.0160
丙酮Acetone 52.64 46.28 32.48 20.10 10.34 0.9686狓+5.0339 0.9903 0.9226 0.6680~1.2611
粘虫
犕.狊犲狆犪狉犪狋犪
氯仿Chloroform 47.90 39.84 26.87 17.28 8.69 0.9515狓+4.8894 0.9840 1.3070 0.9062~1.9800
乙醇Alcohol 24.62 17.24 11.35 6.89 2.14 0.9487狓+4.2559 0.9773 6.0867 4.2335~10.0130
丙酮Acetone 34.56 30.62 24.56 11.65 4.67 0.8704狓+4.6247 0.9950 2.6989 2.1911~3.4601
表2 苍耳提取物对萝卜蚜的内吸作用测定
犜犪犫犾犲2 犜犲狊狋狅犳狊狔狊狋犲犿犻犮犪犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犔.犲狉狔狊犻犿犻
溶剂
Solvent
校正死亡率Correctedmortality(%)
1
g/mL
0.7
g/mL
0.4
g/mL
0.1
g/mL
0.05
g/mL
毒力回归式
Toxicregression
equation(狔=)
犚 LC50
(g/mL)
95%置信区间
Confidence
interval
氯仿Chloroform 12.13 10.32 6.73 3.14 1.96 0.7169狓+3.8305 0.9970 42.7764 35.9188~51.7621
乙醇Alcohol 12.35 10.41 6.82 3.72 1.13 0.7340狓+3.8504 0.9922 36.8367 27.9944~50.6062
丙酮Acetone 10.46 7.36 5.84 3.02 0.57 0.7340狓+3.7170 0.9827 55.9830 39.0254~86.1691
2.1.3 忌避作用 苍耳3种溶剂提取物对萝卜蚜的忌避作用测定结果(表3)表明,3种提取物对萝卜蚜均具有
较高忌避活性,处理4h,其忌避率均大于87%,且苍耳氯仿提取物的忌避活性最强,忌避率为94.25%;随时间推
移,3种提取物忌避率下降,48h丙酮提取物忌避率最低,为62.48%,与氯仿和乙醇提取的忌避率差异极显著,
而后两者差异不显著,忌避率均高于80%。
表3 苍耳提取物对萝卜蚜的忌避作用测定
犜犪犫犾犲3 犜犲狊狋狅犳狉犲狆犲犾犲狀犮狔犪犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犔.犲狉狔狊犻犿犻 %
溶剂
Solvent
4h平均忌避率
Theaveragerepelentrateof4h
24h平均忌避率
Theaveragerepelentrateof24h
48h平均忌避率
Theaveragerepelentrateof48h
氯仿Chloroform 94.25±3.27aA 85.38±4.87aA 84.53±9.00aA
乙醇Alcohol 88.66±5.32aA 83.48±8.36aA 82.62±6.89aA
丙酮Acetone 87.96±4.69aA 67.83±8.55bB 62.48±6.48bB
注:提取物浓度均为0.05g/mL。数据后不同小写字母表示在5%(犘≤0.05)水平差异显著,大写字母表示1%(犘≤0.01)水平差异极显著。下同。
Note:Theconcentrationofextractionwas0.05g/mL.Thedifferentminusculebetweenthedataofthesamearrangemeanthesignificantdiffer
ence(犘≤0.05)andthecapitallettersmeantheverysignificantdifference(犘≤0.01).Thesamebelow.
2.1.4 拒食作用 苍耳3种溶剂提取物对粘虫的拒食作用测定结果(表4)表明,拒食活性与提取物浓度呈正
比,且苍耳氯仿和丙酮提取物对粘虫均具有较强拒食活性,在浓度为1g/mL时,校正拒食率为98.27%和
95.67%,AFC50分别为0.1985和0.2414g/mL;苍耳乙醇提取物对粘虫拒食活性较弱,其 AFC50为1.8277
g/mL。
2.1.5 胃毒作用 苍耳提取物对粘虫幼虫的胃毒作用测定结果表明(表5),苍耳氯仿、乙醇和丙酮3种提取物
对粘虫均有一定胃毒作用,在1g/mL时校正死亡率分别为57.14%,54.08%和56.00%,LC50分别为0.8997,
972第23卷第4期 草业学报2014年
1.1351和0.8521g/mL。
2.1.6 生长调节作用 苍耳提取物对粘虫的生长调节作用见表6。结果表明,用浓度为0.05g/mL的苍耳氯
仿、乙醇和丙酮提取物处理后,处理粘虫的体重增长率由0~48h间的缓慢增长趋势变为逐渐下降,72h时后体
重增长率分别为-5.85%,35.91%和16.61%,以苍耳氯仿提取物的抑制作用最强,对照粘虫幼虫体重增长率高
达588.93%,差异达极显著水平。
表4 苍耳提取物对粘虫的拒食作用测定
犜犪犫犾犲4 犜犲狊狋狅犳犪狀狋犻犳犲犲犱犻狀犵犪犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犕.狊犲狆犪狉犪狋犪
溶剂
Solvent
校正拒食率Correctedantifeedingrate(%)
1
g/mL
0.7
g/mL
0.4
g/mL
0.1
g/mL
0.05
g/mL
毒力回归式
Toxicregression
equation(狔=)
犚 AFC50
(g/mL)
95%置信区间
Confidence
interval
氯仿Chloroform 98.27 82.41 51.34 34.38 23.46 1.4806狓+6.0390 0.9401 0.1985 0.0030~0.5346
乙醇Alcohol 48.78 33.34 23.15 19.54 12.10 0.7904狓+4.7930 0.9187 1.8277 0.7550~12.8654
丙酮Acetone 95.67 78.31 45.36 30.58 21.23 1.4833狓+5.9156 0.9312 0.2414 0.0022~0.6562
表5 苍耳提取物对粘虫的胃毒作用测定
犜犪犫犾犲5 犜犲狊狋狅犳狊狋狅犿犪犮犺狋狅狓犻犮犻狋狔狅犳狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狊狅犳犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犕.狊犲狆犪狉犪狋犪
溶剂
Solvent
校正死亡率Correctedmortality(%)
1
g/mL
0.7
g/mL
0.4
g/mL
0.1
g/mL
0.05
g/mL
毒力回归式
Toxicregression
equation(狔=)
犚 LC50
(g/mL)
95%置信区间
Confidence
interval
氯仿Chloroform 57.14 45.36 32.65 28.34 19.36 0.7060狓+5.0324 0.9386 0.8997 0.2343~2.8184
乙醇Alcohol 54.08 42.35 29.36 25.68 16.38 0.7342狓+4.9596 0.9368 1.1351 0.3891~4.1186
丙酮Acetone 56.00 46.03 33.33 20.21 13.41 0.9542狓+5.0663 0.9861 0.8521 0.5649~1.2462
表6 苍耳提取物对粘虫生长调节作用测定
犜犪犫犾犲6 犜犲狊狋狅犳犵狉狅狑狋犺犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀犪犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犕.狊犲狆犪狉犪狋犪
溶剂Solvent
0h
平均体重
Theaverage
weight
(mg/头 Head)
24h
平均体重
Theaverage
weight
(mg/头 Head)
体重增长率
Thegrowthrate
ofbodyweight
(%)
48h
平均体重
Theaverage
weight
(mg/头 Head)
体重增长率
Thegrowthrate
ofbodyweight
(%)
72h
平均体重
Theaverage
weight
(mg/头 Head)
体重增长率
Thegrowthrate
ofbodyweight
(%)
CK 5.60±1.30aA 12.67±2.53aA 126.43 19.96±4.46aA 256.43 38.58±4.80aA 588.93
氯仿Chloroform5.81±1.41aA 7.78±1.78bA 33.91 7.23±3.69bB 24.44 5.47±5.61bB -5.85
乙醇Alcohol 5.43±1.08aA 8.65±1.67bA 59.30 9.46±3.38bAB 74.22 7.38±4.02bB 35.91
丙酮Acetone 6.02±1.35aA 8.26±1.62bA 37.21 8.12±4.52bB 34.88 7.02±4.28bB 16.61
注:提取物浓度均为0.05g/mL。
Note:Theconcentrationofextractionwas0.05g/mL.
2.2 试虫中毒症状描述
2.2.1 萝卜蚜中毒症状 用浸虫法处理萝卜蚜时,可以观察到,萝卜蚜在接触苍耳提取物0~0.5h时虫体腹部
向上翘起,后足伸展,表现麻痹状态,2h后逐渐恢复,拔出口针,四处爬行,大部分爬到培养皿边,少部分停留在
叶柄部分,在叶面上几乎没有萝卜蚜;对照处理接上萝卜蚜之后,试虫很少爬动,大部分停留在叶面上,24h后,
虫体死亡,体色变褐。
082 ACTAPRATACULTURAESINICA(2014) Vol.23,No.4
2.2.2 粘虫中毒症状 粘虫触杀试验中,处理几秒后,多数试虫四处爬行并翻滚、不停摇动头部,一些试虫头部
和腹末向上尽力抬起,0.5h后,个别粘虫身体蜷缩,用硬物触动,没有反应,4h后恢复行动,但行动迟缓,爬到叶
片上进行取食,但取食量明显少于对照。12h后,未恢复行动粘虫体色变黑,虫体萎缩僵硬死亡。
拒食试验中,试虫只用口器轻碰叶片,但不取食,在叶片周围及培养皿边缘爬行或静止不动,不接近叶片;经
过一段时间饥饿,健壮粘虫取食衰弱粘虫,只有部分少量取食叶片,取食后48h体色变深,萎缩、僵硬,最后死亡,
个别行动迟缓,48h后并不死亡,随后其取食和行动逐渐恢复,72h后,生长发育较对照粘虫缓慢,虫体萎缩,平
均体重显著小于对照,化蛹期比对照推迟2~3d。
胃毒试验中,粘虫对夹毒叶片表现极强不选择性,所有粘虫均取食未涂药液一面叶碟,而将有药液一面叶碟
较完整的保留下来,当饥饿一段时间后,有少量取食。取食后症状与拒食试验取食后症状相同。
2.3 苍耳氯仿提取物对萝卜蚜和粘虫解毒酶活性的影响
2.3.1 乙酰胆碱酯酶(AchE) 苍耳氯仿提取物对萝卜蚜乙酰胆碱酯酶(AchE)活力的影响结果(图1)表明,苍
耳氯仿提取物对萝卜蚜AchE产生抑制作用。处理0~0.5h,AchE活力迅速下降,0.5h抑制率为27.78%,随
后AchE活力有所升高,但其活力均比对照低,处于抑制状态,12h后,AchE活力又迅速下降,处理萝卜蚜AchE
比活力为1.53μmol/(min·mL),与对照相比处理AchE活力的抑制率达到最高,为37.55%。
苍耳氯仿提取物对粘虫AchE活力测定结果(图2)表明,苍耳氯仿提取物对粘虫AchE活力同样有抑制作
用,在4h时,处理粘虫 AchE 比活力为3.42μmol/(min·mL),抑制率达最高,为25.65%。随后处理粘虫
AchE活力逐渐升高,12h时,酶被激活,激活率为9.42%;之后处理粘虫体内AchE活力又下降,到48h一直处
于被抑制状态。
图1 苍耳氯仿提取物对萝卜蚜的犃犮犺犈活力的影响
犉犻犵.1 犃犮犺犈犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋犺犲犮犺犾狅狉狅犳狅狉犿犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳
犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犔.犲狉狔狊犻犿犻
图2 苍耳氯仿提取物对粘虫的犃犮犺犈活力的影响
犉犻犵.2 犃犮犺犈犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋犺犲犮犺犾狅狉狅犳狅狉犿犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳
犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犕.狊犲狆犪狉犪狋犪
2.3.2 谷胱甘肽S转移酶(GSTs) 由图3可以看出,苍耳氯仿提取物对萝卜蚜体内谷胱甘肽S转移酶
(GSTs)活力有激活作用,24h时,处理酶活力与对照酶活力分别为0.056和0.041ΔOD/(mg蛋白·mL),激活
率最高为26.79%,48h后,又被抑制。
苍耳氯仿提取物对粘虫谷胱甘肽S转移酶(GSTs)活力有先抑制后激活的影响,如图4所示,0~8h,处理
粘虫GSTs比活力较对照低,其酶被抑制,抑制率最高为18.11%;8~12h后处理粘虫酶比活力高于对照,24h
时,对照和处理酶比活力分别为0.320和0.420ΔOD/(mg蛋白·mL),其激活率为23.81%;24h后酶活力有所
降低,逐渐与对照相当。
2.3.3 多功能氧化酶(MFO) 苍耳氯仿提取物对萝卜蚜多功能氧化酶(MFO)活力影响不明显。如图5所示,
在0~2h内,苍耳氯仿提取物对萝卜蚜的 MFO活力的影响呈上升趋势,处理2hMFO 被激活,激活率为
182第23卷第4期 草业学报2014年
13.44%;在2~8h间,酶活力呈下降趋势,8h时处理酶活力被抑制,抑制率为11.89%,8~12h时处理组 MFO
呈上升趋势,之后又下降,但处理组与对照组比活力差别不大。
苍耳氯仿提取物对粘虫 MFO活力的影响见图6。结果表明,在取食带毒叶片0~4h内,处理粘虫体内
MFO活力被微弱抑制;在8~48h,表现较弱激活作用,48h时,激活作用最高,对照酶比活力为3.85μmol/
(min·mL),处理粘虫的为4.94μmol/(min·mL),激活率达22.06%。
图3 苍耳氯仿提取物对萝卜蚜的犌犛犜狊活力的影响
犉犻犵.3 犌犛犜狊犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋犺犲犮犺犾狅狉狅犳狅狉犿犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳
犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犔.犲狉狔狊犻犿犻
图4 苍耳氯仿提取物对粘虫的犌犛犜狊活力的影响
犉犻犵.4 犌犛犜狊犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋犺犲犮犺犾狅狉狅犳狅狉犿犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳
犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犕.狊犲狆犪狉犪狋犪
图5 苍耳氯仿提取物对萝卜蚜的 犕犉犗活力的影响
犉犻犵.5 犕犉犗犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋犺犲犮犺犾狅狉狅犳狅狉犿犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳
犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犔.犲狉狔狊犻犿犻
图6 苍耳氯仿提取物对粘虫的 犕犉犗活力的影响
犉犻犵.6 犕犉犗犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋犺犲犮犺犾狅狉狅犳狅狉犿犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳
犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犕.狊犲狆犪狉犪狋犪
3 结论与讨论
乙酰胆碱酯酶(AchE)是大多数神经毒剂农药的作用靶标。主要作用是催化昆虫中枢神经系统传导物乙酰
胆碱(Ach)的水解,其活性受到抑制,势必会引起昆虫神经传导的异常反应,直至最终阻断突触传递,使昆虫死
亡[2627]。本研究中,触杀法处理萝卜蚜和粘虫后,其AchE立即受到抑制,萝卜蚜表现痉挛,而粘虫表现焦躁不安
的过度兴奋状态,之后逐渐恢复,说明苍耳氯仿提取物是试虫神经靶标AchE的抑制剂,但是,AchE活力会恢
复,这一点与一般的神经毒剂不同,可能原因有:活性物质与AchE的结合是可逆的;另外可能与GSTs及 MFO
的解毒代谢有关。
谷胱甘肽S转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)都是昆虫体内重要的解毒酶系。GSTs能使有害的亲电
物质与内源的还原型谷胱甘肽(GSH)结合,参与转运体内重要的脂类化合物[28];当苍耳氯仿提取物处理萝卜蚜
282 ACTAPRATACULTURAESINICA(2014) Vol.23,No.4
24h之前,其GSTs被激活,说明苍耳氯仿提取物具有杀虫活性物质,或对萝卜蚜能够产生有害的亲电物质,但随
着时间延长,酶又被抑制,表明其解毒能力下降,而此时萝卜蚜AchE和 MFO同处在抑制状态,从而引起虫体死
亡。而 MFO系是一类由细胞色素P450、细胞色素b5、NADPH细胞色素b5还原酶、NADPH细胞色素c还
原酶及磷脂等组成的氧化酶系,能够催化各种结构不同的内源或外源化合物氧化,如脂肪酸、甾体激素、药物、杀
虫剂及各种环境有害化合物等,与害虫抗药性发展密切相关的重要酶系[29],本研究中苍耳氯仿提取物对萝卜蚜
和粘虫的 MFO活力影响不明显,说明苍耳杀虫作用与该酶系关系不大,反之亦说明萝卜蚜和粘虫对苍耳氯仿提
取物不易产生抗性。
粘虫对苍耳氯仿提取物表现极高的拒食活性,其取食量非常小,从而导致进入虫体的药液量少,但当粘虫取
食一定量的毒叶后,粘虫表现活动迟缓,生长发育被抑制。这很有可能是因为拒食活性高,取食少造成其营养缺
乏,从而被饿死;另一个原因可能是:当粘虫取食少量毒叶后,其体内重要的解毒酶———GSTs和 MFO活力均被
微弱抑制,粘虫表现中毒症状为行动迟缓,而之后,酶又被激活,使得其解毒作用增强,代谢加速,使昆虫产生暂时
的耐药性,以帮助其渡过“危险期”,从而使得不表现高的胃毒活性。但粘虫为了维持这种高水平的解毒过程,消
耗了体内大量的能量导致体能衰竭,直至最终死亡;而其他存活的个体,也因为耗能太多,造成体质衰弱,生活力
差,因此又表现很高生长发育抑制作用。
本文针对试虫中毒症状,研究了试虫3种酶的活性,基本明确了其杀虫机理是对其AchE活性的抑制作用。
同时,也得出,苍耳氯仿提取物对试虫内吸及胃毒活性低的原因可能与 GSTs的激活有关。但是试虫对苍耳提取
物的拒食及忌避机理是什么,苍耳中究竟含有哪些影响试虫取食的成分等问题,还有待于进一步研究。
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犃狊狋狌犱狔狅狀狋犺犲犿狅犱犲狅犳犻狀狊犲犮狋犻犮犻犱犪犾犪犮狋犻狅狀犪狀犱狋犺犲犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犱犲狋狅狓犻犳犻犮犪狋犻狅狀犲狀狕狔犿犲犻狀犲狓狋狉犪犮狋狊狅犳
犡犪狀狋犺犻狌犿狊犻犫犻狉犻犮狌犿犪犵犪犻狀狊狋犔犻狆犪狆犺犻狊犲狉狔狊犻犿犻犪狀犱犕狔狋犺犻犿狀犪狊犲狆犪狉犪狋犪
ZHANGJunxia1,2,ZHANGXinhu2,SHENHuimin2
(1.ColegeofForestry,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.ColegeofPratacultural
Science,GansuAgriculturalUniversity;KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation;
TheSinoU.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Themodeofinsecticidalactionandtheactivityofdetoxificationenzymes(AchE,GSTs,MFO)were
studiedusingthreedifferentsolventextracts(acetone,ethanol,chloroform)of犡犪狀狋犺犻狌犿狊犻犫犻狉犻犮狌犿against
犔犻狆犪狆犺犻狊犲狉狔狊犻犿犻and犕狔狋犺犻犿狀犪狊犲狆犪狉犪狋犲.Thechloroformextractsof犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿mainlyexpressedastrong
repelencyactionagainst犔.犲狉狔狊犻犿犻:therepelentratewas94.25%at4hwithaconcentrationof0.05g/mL,
whileat48h,itwas84.53%;Forcontacttoxicity,thehighestmortalityratewas67.24%,andtheLC50was
0.7420g/mL;Systemicactionwasextremelyweak.For犕.狊犲狆犪狉犪狋犲,themodeofinsecticidalactionwas
mainlyantifeedantandgrowthinhibitionactivity,andtheantifeedingcorrectedmortalityratewasashighas
98.27%,andtheAFC50was0.1985g/mL;At72h,thebodyweightgrowthratewas-5.85%,whichwas
significantlydifferentfromtheCK;Stomachandcontacttoxicitywereweak,andtheLC50 were0.8997and
1.3070g/mLrespectively.TheAchEactivityof犔.犲狉狔狊犻犿犻and犕.狊犲狆犪狉犪狋犪wasinhibitedbythechloroform
extractof犡.狊犻犫犻狉犻犮狌犿,at24h(犔.犲狉狔狊犻犿犻)and4h(犕.狊犲狆犪狉犪狋犲),theinhibitionratesoftheAchEactivity
werethehighest(37.55%and25.65%);TheactivitiesofGSTsandMFOwerenotsignificant.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犡犪狀狋犺犻狌犿狊犻犫犻狉犻犮狌犿;modeofinsecticidalaction;detoxificationenzyme
482 ACTAPRATACULTURAESINICA(2014) Vol.23,No.4