全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&""#$"V# "V%
!"#$%&$%$(#)*
!!文章编号!$##$($)&""#$%##"(#"V#(#:
油桐尺蛾核型多角体病毒 %45>_ 基因结构及
系统进化分析
罗!辑$!"! 周国英$!! 朱积余"
"$.中南林业科技大学林学院!湖南 长沙!$###+ ".广西壮族自治区林业科学研究院!广西 南宁!%V###"#
收稿日期$ "#$(#("V
基金项目$ 中国博士后科学基金资助项目""#$e%%"%VVSM#+广西林科院博士后专项资金项目"林科 "#$V 号#+广西林科院基金项目
"林科 "#$#$ 号#
作者简介$ 罗!辑"$)&%*#!男!湖南长沙人!博士后!主要从事森林病虫害研究)
!
通讯作者$教授!博士生导师!/(01,2$6F347<"$$&9$:V.;70
摘要!:$T2_基因作为杆状病毒重要的早期表达基因!编码病毒+c?聚合酶的最大亚基) 本文通过对油桐尺蛾核型多
角体病毒:$T2&基因进行测序!对其基因结构及其在杆状病毒中的系统进化进行了分析) 发现:$T2&基因在油桐尺蛾核
型多角体病毒中编码区长 " :V KQ!编码 &**个氨基酸) 在 %4(^L+区具有可能为其启动子及转录起始位点的信号序
列!在 V4(^L+区具有加尾信号序列!但这些序列的具体功能还有待进一步研究) 其蛋白序列与常见的模式cUn同源
性较低!但具有共同的签名序列) 通过对杆状病毒:$T2& 基因的系统进化分析!发现颗粒体病毒和核型多角体病毒明
显分为两支!而核型多角体病毒中又明显分为 个分支!其进化关系在很大程度上与其寄主的进化关系相关)
关键词!油桐尺蛾+核型多角体病毒+杆状病毒+:$T2& 基因+基因结构+系统进化
中图分类号!>*:V.V 文献标识码!?
/8#620I92I01-1).D8<-*(#)#29!)1-<&&*+V12#EYG0#&&*),192*0
Q "%45>_# F#)#)?$@$/( &$##/4&&(/*( "I9-#10D*-<8#.0*&&N0I&
K5OL4
$!"
! +,O5/9"27401
$
! +,5L4279
"
"$.G72@6@7-E7B@ADBF! G@5DB12>7?!:&20192$ J1D@@XQB@AA,75 -1;D7B& ":$T2_# 6@5@,A15 @1B2F@XQB@AA,75 6@5@! 15H ;7H@AD4@21B6@ADAQ72F0@B1A@,5 K1;<27N,B"MAcUn#.CD41H " :V KQ ;7H,56B@6,75 15H @5;7H,56&** 10,571;,H B@A,H<@A.>70@A,6512A@8<@5;@AR@B@-7<5H
,5 <5DB15A21D@H B@6,75 " L^+#$ Q7AA,K2@QB707D@B15H DB15A;B,QD,75 ,5,D,1D,75 A,D@R@B@-7<5H ,5 %4(^L+! 15H 1Q<(
D1D,N@Q72F1H@5F21D,75 A,6512A@8<@5;@R1A-7<5H ,5 V4(^L+.MD4@BB@A@1B;4.L4@QB7D@,5 A@8<@5;@7-:$T2_ 6@5@,5 MAcUnR1A27R470727672FD4@A10@A,6512A@8<@5;@.MFQ4F276@5@D,;1512FA,A7-:$T2_ 6@5@,5 K1;<27N,BQ72F4@HB7A,AN,BKB7g@,5D7 KB15;4@A.?5H @N72;#< $*0.&$ G9J9#( %9PP#$%(#4(+ 5<;2@1BQ72F4@HB7A,AN,B1512FA,A
油桐尺蛾"G9J9#( %9PP#$%(#4(#作为我国南方重
要的林业害虫!每年都对林业生产造成严重的损
失,$- ) 油桐尺蛾核型多角体病毒"G9J9#( %9PP#$%(2
#4( 5<;2@1BQ72F4@HB7A,AN,B第 " 期 罗!辑等$油桐尺蛾核型多角体病毒:$T2_ 基因结构及系统进化分析
染油桐尺蛾!对其起到生物防治的作用!是很有潜力
的生物农药) 其属于核型多角体病毒!是杆状病毒
的一大分支!对宿主具有较高的特异性,"- ) 其研究
最早是在 "# 世纪 *# 年代!中国科学院武汉病毒所
在湖北蒲圻羊楼洞茶场以及四川新胜茶场!发现油
桐尺蛾自然患病幼虫!倒挂而死) 经分离鉴定确认
为油桐尺蛾核型多角体病毒感染,V- ) 在此之前该病
毒在世界范围内尚未见报道!为我国首次报道命
名,- ) 此后!武汉病毒所对油桐尺蛾核型多角体病
毒的形态结构,%- %毒力测定,: W*- %病毒的核酸,&- %蛋
白及血清学性质,) W$#-等进行了研究!为其在实际生
产中的应用奠定了一定的基础)
+c?转录相关基因是很重要的一类基因!因为
病毒侵染和增殖过程中需要的酶都需要从病毒基因
组转录!而转录所需要的酶一方面来自宿主的转录
酶!另一方面需要病毒基因组编码的转录酶参与)
与转录相关的酶中!最重要的就是核型多角体病毒
的+c?聚合酶!其由多个基因编码) :$T2_ 就是编码
病毒+c?聚合酶最大亚基的基因!另外 V 个亚基分
别由:$T2`%:$T2a%P`b 三个基因编码,$$ W$"- ) 这几个基
因特别是:$T2_ 和 :$T2a 在不同种类的核型多角体病
毒中具有一定的保守性!能够作为鉴定病毒种类的
依据,$V- ) 因此本文对油桐尺蛾核型多角体病毒 :$T2
_ 基因进行了测序及序列分析!并与杆状病毒进行
了比较)
$!材料与方法
=.=>材料
$.$.$!供试昆虫!油桐尺蛾于 "#$V 年 * 月采集于
广西壮族自治区来宾市忻城县) 于实验室内用桉树
叶饲养!人工气候箱控制温湿度及光照$温度控制在
"& v$d!光周期J$PY$:$&!湿度在幼虫期为 # v
%=!蛹及成虫期为 &# v%=)
$.$."!供试病毒!油桐尺蛾核型多角体病毒从广
西南宁市六里林场采集的油桐尺蛾上分离保存)
=.?>方法
$.".$!病毒的增殖!选取生长状态相同的油桐尺
蛾四龄幼虫!单条置于培养皿中饥饿 " 4!用喷有油
桐尺蛾核型多角体病毒悬液的桉树叶饲喂!待其发
病死亡后收集虫尸)
$."."!病毒的纯化!将收集的虫尸置于研钵中!加
适量UM>"Qj*.#缓冲液研磨) 用夹有一层棉花的
纱布过滤!d差速离心!收集沉淀) 沉淀用 #.$=
>P>洗涤后!用少量 UM> 重悬) 再用 V#= :%=蔗
糖连续梯度离心!收集病毒带!UM>洗涤后 d保存)
$.".V!病毒Pc?提取!向病毒悬液中加入等体积
碱解液"#.$ 072/JW$ c1
"
Gk
V
!#.$* 072/J
W$
c1G2!
#.#$ 072/J
W$
/PL?!Qj$#.&#!V*d保温至澄清)
加入 $#=>P> 至终浓度为 #.%=!加入蛋白酶 I!至
终浓度 #."% 06/0JW$!%%d保温 V 小时) 酚氯仿
抽提后溶于L/中!置于W"#d备用)
$.".!引物合成和UG+扩增!引物由上海立菲生
物技术公司合成$
2@-&(E$L??G?G?L??GGGGGG??G????G
2@-&(+$TG?G??GG?LGLT?TLL?G?L?GLL
UG+体系为病毒 Pc?"# 56!引物"$#
"
072/
J
W$
#各 $.:
"
J!""L18 UG+e1AD@Be,X"%
"
J!反应体
系 %#
"
J) 反应条件 )d预变性 V 0,5+)d变性 "#
A!%&d退火 V# A!*"d延伸 V.% 0,5!V% 个循环+*"d
延伸 $# 0,5!d保存) $.%=琼脂糖凝胶电泳后切
胶回收后送上海立菲生物技术公司测序)
$.".%!系统进化分析!在 cGMC上搜索杆状病毒
:$T2_ 基因!下载具有全长的所有序列!用 e/T?:.#
对其编码的蛋白进行比对分析) 用 c@,64K7B(i7,5,56
法构建系统进化树)
"!结果与分析
?.=>基因序列与结构
通过测序及拼接分析!最终得到了一个 V **$
KQ的片段"T@5M15g 1;;@AA,75$ Ii:&%%)!图 $#) 该
片段中编码区 " :V KQ%%4非编码区"%4(^L+#:":
KQ%V4非编码区"V4(^L+#%$$ KQ) :$T2_ 基因序列中
富含?%L碱基!编码区 ?L含量高达 :$."#=!V4及
%4 L^+区?L含量也在 :$=左右)
图 $!油桐尺蛾核型多角体病毒:$T2_ 基因电泳图
在该片段的非编码区中!能够发现一些病毒基
因的结构序列"图 "#) %4(^L+中具有可能的启动
子序列) 在起始密码子上游 %"& KQ 处为 G?TL序
$V"
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
列!此序列被认为是杆状病毒早期 +c?聚合酶 CC
转录起始位点,$- +在起始密码子上游 ): KQ 处为
T?L?序列!此序列则被认为是宿主转录因子特异
性结合的位点,$%- +起始密码子上游 &: KQ 处有
L?L??序列!起始密码子上游 "& KQ 处有 G?LL
序列!两序列之间相隔 %V KQ!这两个序列的组合为
可能的 L?L?启动子区,$:- ) V4(^L+中能找到可能
的加尾信号序列?LL???,$*- !其位于终止密码子下游
"* KQ处)
图 "!油桐尺蛾核型多角体病毒:$T2_ 基因的结构
?.?>蛋白序列与结构
:$T2_ 基因编码 &** 个氨基酸!分子量约为 $#".V
IP!等电点为 &.)*) 在 U>CU+/P网站 " 4DQ$__
K,7,5-.;A.<;2.1;.现其大部分区域均为无规卷曲!占到总数的
%:h=!而
!
折叠"").)=#约为
+
螺旋"$V.*=#的
两倍) 在U+k>CL/网站"4DQ$__QB7A,D@.@XQ1AF.7B6_
A;15QB7A,D@_#预测蛋白的特征序列!发现其 *$)
*V$ 氨基酸处的蛋白序列 TnICGTnjTtITn为
+c?聚合酶
!
链的签名序列) 其与常用的模式核
型多角体病毒相比!同源性不高!均在 :#=左右!其
与家蚕核型多角体病毒"G"CS7YC"#45<;2@1BQ72F4@(
HB7A,AN,B毒"-9&"1#(P*( )(:4T"#04)( 5<;2@1BQ72F4@HB7A,AN,B?;cUn#的 J/E(& 同源性均为 :$=!而与黄杉毒蛾
核多角体病毒 "O#174( P%$9Q&%91(&( 5<;2@1BQ72F4@(
HB7A,AN,B第 " 期 罗!辑等$油桐尺蛾核型多角体病毒:$T2_ 基因结构及系统进化分析
?.A>杆状病毒J/E(Q 系统进化分析
从cGMC上收集已知杆状病毒的 J/E(& 蛋白序
列!包括核型多角体病毒 "cUn# 和颗粒体病毒
"Tn#) 以颗粒体病毒为外类群构建系统进化树"图
#) 从图中可以看出!cUn和 Tn分成了明显的两
支!这说明二者之间存在较大的基因差异!甚至可能
具有不同的进化起源) cUn中也明显存在 个分
支!其中在基部的分支为侵染膜翅目和双翅目的
cUn!而其它的寄主均为鳞翅目昆虫) 从寄主方面
看!在大部分情况下!侵染同属寄主的 cUn具有较
近的亲缘关系!但侵染 O#174( 以及 UP"Q"P&$#( 两个
属的cUn中有例外!并不是都聚在一个分支上+在
科的水平上也具有类似的规律!例如在cUnTB7的一个分支上聚集的 cUn均以夜蛾科为寄主) 因
此可以看出!杆状病毒的系统进化与其寄主的进化
关系是非常相关的)
V!讨论
AK=>%45>_ 基因结构
油桐尺蛾核型多角体病毒是一种寄生于油桐尺
蛾体内的昆虫病毒!其在宿主体内大量扩增繁殖后
引起宿主组织器官液化!进而死亡) 正是由于其营
寄生生活!很多生理活动需要依靠寄主的酶或者代
谢产物参与) 在病毒侵染宿主的早期!病毒仅有其
环状的基因组Pc?进入宿主细胞中!其自身不具备
其他任何酶类!因此其早期基因的表达则完全依靠
宿主的表达系统) :$T2& 基因是油桐尺蛾核型多角体
病毒晚期表达因子之一!编码病毒自身的 +c?聚合
酶的最大亚基!其是病毒早期表达的重要基因之一)
所以在其基因结构中能够找到可能为宿主转录因子
特异性结合位点的序列***T?L?!并且在其 V4(
L^+区能找到真核生物的加微信号序列!这也是其
适应在真核生物中寄生生活的一个方面) 但根据文
献!除了能找到可能的宿主转录因子结合位点外!还
能找到可能的 L?L?启动子区以及杆状病毒早期
+c?聚合酶 C转录起始位点!这些位于基因 %4(
L^+的信号序列都可能起到启动转录的功能) 与其
他核型多角体病毒相比!MAcUn的:$T2_ 基因 %4端的
可能启动信号较多!并且与其他种类有些差异) 在
杆状病毒:$T2_ 基因的 %4端!起始密码子上游大约
"## KQ内存在晚期表达启动子和早期表达启动子!
它们在一些种类中同时存在,$&- !在一些种类中单独
存在,$)- !而在一些种类的 %4端这两种启动子都缺
失,"#- ) 在MAcUn中虽然能够找到早期表达启动子
L?L?区!但其位于起始密码子上游近 %## KQ 处!按
文献的标准应属于两种启动子都缺失的类型) 但是
否其启动子区域与起始密码子相距较远还需要更多
实验上的证据) 另外从序列上找到的启动信号较
多!而具体哪个才是主导信号或者哪些信号共同起
到启动作用还有待进一步研究)
A.?>:$T2_ 基因系统进化
从序列上看!杆状病毒的 :$T2_ 基因存在较大的
种间差异) 最长的序列长达 " )" KQ",$C4:$9)( AQ.
cUn#!最短的则仅有 " & KQ"F*&*"#4C($( "P$#)9:$2
:( Tn#!相差近 %## KQ) 但差异之中也存在着一定
的保守性!例如所有的Tn中此基因同源性较高!使
得Tn都聚在了同一分支上而与cUn分开) 如果将
Tn和 cUn分开来分析!会发现在一定程度上病毒
亲缘关系的远近与其宿主亲缘关系的远近有正相
关) 在非寄生生物中!物种的进化主要是由于其对
环境因子的适应!进而通过自然对其的选择作用完
成进化过程) 而寄生生物由于其寄生于宿主体内!
因此环境因子对其影响较小!宿主体内的各种生物
因子则对其影响很大!所以环境因子对其的选择作
用有限) 寄生生物与其宿主则通过相互之间的适应
作用协同进化) 杆状病毒作为一种特殊的寄生生
物!与其他寄生生物有个显著的差异!其不像寄蝇%
线虫等寄生生物一样仅仅取食其宿主!由于其基因
组很小!必须通过将自身的基因组整合到宿主基因
组中!并利用宿主基因组及细胞中的各种生物成分
才能完成其生命周期!因此其与宿主的基因交流更
为密切,"$- ) 正是这种密切的基因交流使得在大多
数情况下!杆状病毒的亲缘关系随其宿主亲缘关系
变化而变化) 而在少数情况下!可能会出现寄生于
同属寄主的杆状病毒不在进化树的同一分支上的情
况!例如本研究中侵染 O#174( 以及 UP"Q"P&$#( 两个
属的病毒) 这一方面可能是由于病毒自身在进化过
程中产生的变异!另一方面可能是寄主虽然亲缘关
系与其他近缘种接近!但 :$T2_ 基因与其他近缘种有
一定的差异!进而导致其病毒在协同进化过程中也
与其他病毒产生了一定的差异!但具体是什么原因
导致的还有待进一步研究证实) 而出现寄生于同属
寄主的杆状病毒不在进化树的同一分支上的这种现
象并不是由于进行进化分析时涉及的基因数不足或
者使用的分析方法不当) 从其他研究者的研究结
果,"" W"V-中可以发现!不论是用全基因组数据还是结
VV"
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
图 !杆状病毒J/E(& 进化树
V"
第 " 期 罗!辑等$油桐尺蛾核型多角体病毒:$T2_ 基因结构及系统进化分析
合多个基因数据进行分析!得到的都是类似的结果)
这一方面从其他研究者的角度佐证了本研究结论的
可靠性+另一方面从分子生物学及基因组学方面表
明$杆状病毒的亲缘关系在绝大多数情况下是随寄
主的亲缘关系变化而变化的!少数情况下也会与寄
主的亲缘关系存在差异)
参考文献!
,$- 梁光祥! 何国业! 蒙庆卓.油桐尺蠖危害桉树用灭幼脲
%
号防
治试验初报,i-.广西林业科学! $))&! "*"V#$ $ W.
,"- 陈!川! 张永安! 王玉珠! 等.油桐尺蠖核型多角体病毒
"M""V#$ $# W$.
,V- 祝庆荃! 刘宇兰! 刘!军! 等.油桐尺蠖核型多角体病毒对实验
动物的毒性试,i-.中国茶叶! $)&"! "#$ V# WV".
,- 谢天恩! 彭辉银! 葛云垣! 等.大尺蠖核型多角体病毒的生产及
其应用,i-.中国茶叶! $)&#! "%#$ $& W"#.
,%- 陈明树! 孙富林! 许大海.油桐尺蠖核型多角体病毒生物学特
性的研究,i-.湖北农业科学! $)&$! "$"#$ ": W"&.
,:- 彭辉银! 陈新文! 金!锋! 等.保存时间对油桐尺蠖核型多角体
病毒杀虫剂毒力的影响,i-.生物防治通报! $))V! )"V#$ $$)
W$"$.
,*- 曾云添! 汤显春! 刘宇蓝! 等.油桐尺蠖核型多角体病毒毒力的
生物测定,i-.广东茶叶科技! $)&V! "#$ $ W%.
,&- 孙松柏! 陈明树! 孙富林! 等.油桐尺蠖核型多角体病毒 Pc?
的限制性内切酶分析,i-.华中农学院学报! $)&%! ""#$ *%
W&#.
,)- 刘明富! 谢天恩.原位化学切割法对油桐尺蠖核型多角体病毒
两种相似多肽的比较研究,i-.病毒学杂志! $))$! :"$#$ *%
W*&.
,$#- 梁布锋.油桐尺蠖核型多角体病毒杀虫剂的血清学检测,i-.
湖北农业科学! $))#! "$##$ "#!"&.
,$$- ?;41BF1?! T7Q,51D415 I.G41B1;D@B,31D,75 7-21D@6@5@@XQB@AA,75
-1;D7BA:$T2a 15H :$T2_ -B70G"CS7YC"#45<;2@7Q72F4@HB7N,Bi7,$"- GB7<;4 /?! G7XJL! e7B12@AIT! $&(:.C5D@B(AD,75A7-D4@-9&"1#(P*( )(:4T"#04)( e 5<;2@7Q72F4@HB7N,BQ72F0@B1A@,i-.n,B7276F! "##*! V:*""#$ ":% W"*.
,$V- i7A@i! i1212,> I! >4,N12,561AR10FLe! $&(:.e72@;<21BG41B1;(
D@B,31D,75 7-c<;2@7Q72F4@HB7N,BA,56J1D@/XQB@AA,75 E1;D7B(& T@5@,i-.C5H,15 i76F! "#$V! ""$#$ %) W:%.
,$- M2,AA1BH Tf!I7615 Uj!f@,+!$&(:.?AF5D4@D,;@1B2FQB707D(
@B-B701K1;<27N,BA,D@G?TLA@8<@5;@,5 K1A122@N@2A7-DB15A;B,QD,75,i-.n,B7276F!
$))"! $)#""#$ *&V W*)V.
,$%- I7615 Uj! G4@5 S! M2,AA1BH Tf.kN@B21QQ,56L?L?(H@Q@5H@5D
15H L?L?(,5H@Q@5H@5D@1B2FQB707D@B1;D,N,D,@A,5 D4@K1;<27N,B6Q: @5N@27Q@-:)"V#$ $%" W$:$.
,$:- S,56I!P@56+!f156i!$&(:.?512FA,A15H QB@H,;D,75 7-K1;<27(
N,BW*$.
,$*- j<156j!f156e!P@56E!$&(:.L4@41*" G7B@T@5@7-M1;<27(
N,BB,N@H n,B+72@,5 CDAE<5;D,75,i-.i7W*#).
,$&- >,0‚5 k!U1201J!M@Q@B@DC!$&(:.>@8<@5;@;70Q1B,A75 K@DR@@5
D4B@@6@76B1Q4,;12FH,AD,5;DUP"Q"P&$#( T#914P$#Q( 0<2D,Q2@5<;2@(
7Q72F4@HB7N,Bi7,$)- L156SP! S,17t! e1SG! $&(:.e7BQ47276F15H 6@570@7-H92
P#")&4%P%$9Q")"0%P$#%( 5<;2@7Q72F4@HB7N,B"##)! V&"V#$ )% W%#:.
,"#- ?4B@5AGj! +@8<@5;@7-D4@
O#174( P%$9Q"&%91(&( e<2D,5<;2@7;1QA,H c<;2@1BU72F4@HB7A,An,BT@570@,i-.n,B7276F! $))*! "")""#$ V&$ WV)).
,"$- 丁!铲.病毒的进化与传播,i-.中国家禽! "#$#! V""$$#$ V%
WV*.
,""- m4< m!l,5 E!J,< S!@D12.T@570@>@8<@5;@15H ?512FA,A7-G92
J9#( %9PP#$%(#4( c<;2@7Q72F4@HB7N,B9%,i-.U27Ak5@! "#$! )"$#$ @&:%#.
,"V- L4<0K,PI! /N@2@,64 +ie! J<;1B7D,Gi! $&(:.G70Q2@D@>@(
8<@5;@!?512FA,A15H kB615,31D,75 7-D4@O#174( :$9)"%&41C( c<;2@(
7Q72F4@HB7N,BW"V"*.
%V"