全 文 ：书结缕草属植物杂交后代杂种真实性
鉴定———犛犚犃犘分子标记
薛丹丹１，２，郭海林１，郑轶琦１，陈宣１，刘建秀１
（１．江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京２１００１４；２．南京农业大学园艺学院，江苏 南京２１００９５）
摘要：ＳＲＡＰ标记是基于ＰＣＲ技术的一种新型分子标记。本研究通过ＳＲＡＰ分子标记技术对结缕草属植物种间杂
交的５个组合３７份杂交后代进行了真假杂种的鉴定，以为育种工作进一步开展奠定基础。首先筛选出在父本中
能扩增出，而在母本中没有的特征带的引物，共筛选出９对引物对后代进行真实性鉴定。把父母本和后代一起进
行ＰＣＲ扩增、电泳，根据后代中是否能扩增出父本特征带而进行鉴定。结果表明，３７个杂交后代中有３２个后代具
有父本特征带，被鉴定为真杂种。同时，从杂种扩增的谱带来看，条带清晰、稳定且后代出现了丰富的变异，主要表
现为新谱带的出现或某些谱带的消失。据此认为，ＳＲＡＰ标记可以有效地对结缕草属杂交后代进行真实性鉴定和
遗传分析，为杂交育种提供了理论依据。
关键词：结缕草；杂交育种；ＳＲＡＰ标记；杂种鉴定
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３．５；Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０１００７２０８
结缕草（犣狅狔狊犻犪）是一种多年生暖季型草坪草，因其具有抗性强、耐践踏、弹性好、养护要求低、适应性广、寿命
长等优良特征，被世界公认为是一种优良的草坪草。目前广泛应用于各类运动场草坪、休憩草坪、观赏草坪及社
区庭院草坪等。我国拥有丰富的结缕草种质资源，是全球结缕草分布最广泛、储量最大的国家［１，２］。
杂交育种作为一种传统育种方法已相当成熟，是植物遗传改良中常用的技术策略，利用草坪草性状差异明显
的亲本进行杂交育种是选育优质、优良新品系的重要途径。目前，结缕草的杂交育种在国外已有多年的研究报
道，并培育出了一批优良的杂交后代［１］，而国内的研究报道甚少，仅台湾［３］和江苏省中国科学院植物研究所［１］有
些研究。结缕草的开花习性为雌蕊先熟，雄蕊后熟，郭海林和刘建秀［４］的研究表明，结缕草的自交结实率为０～
５４％，平均为１６．１５％，因此杂交后代有可能混杂有部分的自交种。据此，需要首先对结缕草的杂交后代进行真
实性的鉴定，以筛选出真正的杂种为后面的优良杂交品种选育提供基础。目前，在结缕草属植物杂交后代的鉴定
中，可以通过植株形态、细胞学、同工酶及分子标记等方面进行鉴定。本研究就是通过分子标记的方法对结缕草
的杂交后代进行鉴定。
随着分子标记技术的不断发展和广泛应用，在植物杂交育种的后代鉴定中也越来越多地应用各种分子标记
技术，如ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性 ＤＮＡ）［５～８］、ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅ
ｐｅａｔｓ，ＤＮＡ简单序列重复）［９，１０］、ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，简单序列重复区间扩增）［１１］、ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉ
ｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，扩增片段长度多态性）［１２］等分子标记已广泛应用于草莓属（犉狉犪犵犪狉犻犪）、落雨
杉（犜犪狓狌狊犱犻狊狋犻犮犺狌犿）、狼尾草（犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿犪犾狅狆犲犮狌狉狅犻犱犲狊）、海滨锦葵（犓狅狊狋犲犾犲狋狕犽狔犪狏犻狉犵犻狀犻犮犪）、斑茅（犈狉犻犪狀狋犺狌狊
犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲狌狊）、茶树（犆犪犿犲犾犾犻犪狊犻狀犲狀狊犻狊）、芸薹属（犅狉犪狊狊犻犮犪）作物等的杂种鉴定中，并得到了满意的结果。然而这
些分子标记都各有不足，ＲＡＰＤ标记重复性较差且产率较低，ＳＳＲ标记的引物具有高度特异性，引物设计需要较
高的成本；ＩＳＳＲ标记两侧引物具有物种特异性，具体试验中引物设计费时耗力；ＡＦＬＰ标记要求的试验程序和成
本都较高且对ＤＮＡ的纯度和内切酶要求严格。ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，相关序列扩增
７２－７９
２００９年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第１期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
收稿日期：２００８０３２６；改回日期：２００８０６１１
基金项目：江苏省科技攻关项目（ＢＥ２００６３３９），国家科技支撑项目（２００６ＢＡＤ０１Ａ１９３），国家自然科学基金项目（３０５７１３０７）和江苏省高技术项
目（ＢＧ２００６３２０）资助。
作者简介：薛丹丹（１９８２），女，河南济源人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｙｚ１２９＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｔｕｒｆｕｎｉｔ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
多态性）标记［１３］是一种基于ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，聚合酶链式反应）的新型分子标记技术，它的发明和
应用弥补了以上分子标记的不足且具备了它们的优点。与其他基于ＰＣＲ分子标记相比，ＳＲＡＰ标记的独特之处
在于针对基因组成的特点进行引物设计，根据基因外显子中富含ＧＣ（鸟嘌呤、胞嘧啶）区域，而内含子、启动子则
富含ＡＴ（腺嘌呤、胸腺嘧啶）区域，利用独特的引物设计对开放阅读框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ）进行扩增，正、反
向引物分别与外显子、内含子（或启动子）区域配对，因不同物种和不同个体的外显子、内含子及启动子与间隔区
长度的不同而产生多态性。ＳＲＡＰ标记简单、稳定可靠、重复性好、多态性高，在基因组中分布均匀、引物非特异
性、少量引物可组配多种引物对等优点使其在多种植物中得到广泛的应用，主要应用于遗传多样性、指纹图谱、纯
度鉴定、资源亲缘关系分析、连锁图谱构建、基因定位、比较基因组学研究等领域。在草坪草的研究中，国外学者
在野牛草（犅狌犮犺犾狅犱犪犮狋狔犾狅犻犱犲狊）的种质资源研究中有报道ＳＲＡＰ标记的应用［１４，１５］；Ｂｕｄａｋ等［１６］利用ＳＲＡＰ标记
研究了Ｃ３ 与Ｃ４ 型草坪草及部分作物的遗传及亲缘关系；郑轶琦等［１７］和王志勇等［１８］利用正交设计试验方法优化
和建立了假俭草（犈狉犲犿狅犮犺犾狅犪狅狆犺犻狌狉狅犻犱犲狊）和狗牙根（犆狔狀狅犱狅狀ｓｐｐ．）２种暖季型草坪草的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体
系。研究表明，ＳＲＡＰ标记可以获得满意的结果，为草坪草的研究提供了一种新的分子标记技术。本研究首次应
用ＳＲＡＰ标记鉴定结缕草属杂交后代的真实性，以期获得满意的结果。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
试验材料为结缕草属的５个杂交组合的亲本及其杂交后代，共６个亲本及３７个后代，均种植于江苏省中国
科学院植物研究所草业中心种质资源圃（北纬３２°０２′，东经１１８°２８′，海拔３０～４０ｍ）。亲本见表１，杂交组合及其
后代见表２。
１．２ 试验方法
１．２．１ 基因组ＤＮＡ的提取和检测 本试验于２００７年９月进行。材料ＤＮＡ的提取采用ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ
ｓｕｌｆａｔｅ，十二烷基硫酸钠）法，并做适当的修改。采用０．８％琼脂糖凝胶电泳检测基因组ＤＮＡ的质量和浓度（电
泳仪为ＤＹＣＰ３４型，电泳槽为ＤＹＹ５型）。电泳结束后，在自动凝胶图像分析仪（上海培清科技有限公司ＪＳ
３８０）上观测，确定ＤＮＡ浓度并拍照。最后将样品ＤＮＡ浓度稀释至５０ｎｇ／μＬ，并于－２０℃保存。
表１ 结缕草属杂交育种的亲本名称和来源
犜犪犫犾犲１ 犖犪犿犲狊犪狀犱狊狅狌狉犮犲狊狅犳狆犪狉犲狀狋狊犳狅狉犣狅狔狊犻犪犮狉狅狊狊犫狉犲犲犱犻狀犵
编号Ｃｏｄｅ 亲本Ｐａｒｅｎｔｓ 种名Ｓｐｅｃｉｅｓ 来源Ｓｏｕｒｃｅｓ 纬度Ｌａｔｉｔｕｄｅ 经度Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
１ Ｚ０２２ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 山东胶州湾Ｊｉａｏｚｈｏｕｗａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ ３６°２６′ １２０°００′
２ Ｚ０６８ 中华结缕草犣．狊犻狀犻犮犪 安徽南陵Ｎａｎｌｉｎｇ，Ａｎｈｕｉｐｒｏｖｉｎｃｅ ３０°５４′ １１８°１０′
３ Ｚ１０５ 中华结缕草犣．狊犻狀犻犮犪 山东烟台Ｙａｎｔａｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ ３７°３０′ １２１°２４′
４ Ｚ１１９ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 江苏响水 Ｘｉａｎｇｓｈｕｉ，Ｊｉａｎｇｓｕｐｒｏｖｉｎｃｅ ３４°１２′ １１９°３４′
５ Ｚ１２３ 沟叶结缕草犣．犿犪狋狉犲犾犾犪 美国引进 Ａｍｅｒｉｃａ － －
６ Ｚ３１３ 日本结缕草×细叶结缕草犣．
犼犪狆狅狀犻犮犪×犣．狋犲狀狌犻犳狅犾犻犪
日本结缕草（江西）和细叶结缕草（南京）的杂交
后代 Ｈｙｂｒｉｄｏｆ犣．犼犪狆狅狀犻犮犪ａｎｄ犣．狋犲狀狌犻犳狅犾犻犪
－ －
表２ 结缕草属杂交组合及其后代
犜犪犫犾犲２ 犎狔犫狉犻犱犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊犪狀犱犻狋狊狆狉狅犵犲狀犻犲狊狅犳犣狅狔狊犻犪
杂交组合（♀×♂）Ｈｙｂｒｉｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ 杂交后代Ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ
１９（Ｚ１１９×Ｚ１２３） １９１，１９２，１９３，１９４，１９６，１９７，１９８
０３（Ｚ０２２×Ｚ１２３） ０３２，０３４，０３５，０３６，０３７，０３８，０３９，０３１０，０３１１
１３（Ｚ３１３×Ｚ１２３） １３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１３６，１３８，１３１２
０９（Ｚ０６８×Ｚ１２３） ０９１
２１（Ｚ１０５×Ｚ１２３） ２１１，２１２，２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１８，２１９，２１１０，２１１１，２１１２
３７第１８卷第１期 草业学报２００９年
１．２．２ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增程序及扩增产物的检测 ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增反应用１０μＬ体系，包括５０ｎｇ模板ＤＮＡ
０．５μＬ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋０．６μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．８μＬ，２μｍｏｌ／Ｌ引物１．０μＬ，０．５ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶
１．０μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ５．１μＬ。其中ＳＲＡＰ引物购自上海博亚生物技术有限公司，ｄＮＴＰ和 Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶购自南京申能博彩公司，ＤＮＡｍａｒｋｅｒ购自南京ＴａＫａＲａ公司。
ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增程序为９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，３７℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１０ｓ，５个循环；９４℃
变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１０ｓ，３５个循环；循环结束后７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。扩增反应在英国
ＴＥＣＨＮＥ公司的ＴＣ４１２型ＰＣＲ仪上进行。
扩增结束后，在扩增产物中加入２μＬ６×ｌｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ缓冲液混匀，上样于１０％的聚丙烯酰胺凝胶进行分
离（电泳仪为ＤＹＹ８Ｂ型，电泳槽为ＪＹＳＣＺ６型），电泳结束后快速银染检测。
１．２．３ ＳＲＡＰ引物组合的筛选 根据ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系，随机选取５条正向引物和１０条反向引物［１３，１９，２０］，
共组合成５０对ＳＲＡＰ引物，其序列和组合见表３和４。对６份结缕草属亲本材料进行多态性ＳＲＡＰ引物组合筛
选，从中选出扩增条带较清晰、带型较丰富且父本能扩增出母本所没有的特异性条带的引物组合，用于后代的真
实性鉴定。
表３ 犛犚犃犘引物序列
犜犪犫犾犲３ 犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犳狅狉犛犚犃犘犪狀犪犾狔狊犻狊
编号Ｃｏｄｅ 正向引物Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓ 编号Ｃｏｄｅ 反向引物Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ
Ｍｅ１ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ３′ Ｅｍ１ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ３′
Ｍｅ２ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ３′ Ｅｍ２ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ３′
Ｍｅ３ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ３′ Ｅｍ３ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ３′
Ｍｅ４ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡ３′ Ｅｍ４ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ３′
Ｍｅ５ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ３′ Ｅｍ５ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ３′
Ｅｍ６ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ３′
Ｅｍ７ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ３′
Ｅｍ８ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ３′
Ｅｍ９ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＡ３′
Ｅｍ１０ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴ３′
表４ ５０对犛犚犃犘引物组合
犜犪犫犾犲４ 犉犻犳狋狔犛犚犃犘狆狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊狌狊犲犱犻狀狋犺犲狋犲狊狋
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
１ Ｍｅ１＋Ｅｍ１ １１ Ｍｅ１＋Ｅｍ３ ２１ Ｍｅ１＋Ｅｍ５ ３１ Ｍｅ１＋Ｅｍ７ ４１ Ｍｅ１＋Ｅｍ９
２ Ｍｅ２＋Ｅｍ１ １２ Ｍｅ２＋Ｅｍ３ ２２ Ｍｅ２＋Ｅｍ５ ３２ Ｍｅ２＋Ｅｍ７ ４２ Ｍｅ２＋Ｅｍ９
３ Ｍｅ３＋Ｅｍ１ １３ Ｍｅ３＋Ｅｍ３ ２３ Ｍｅ３＋Ｅｍ５ ３３ Ｍｅ３＋Ｅｍ７ ４３ Ｍｅ３＋Ｅｍ９
４ Ｍｅ４＋Ｅｍ１ １４ Ｍｅ４＋Ｅｍ３ ２４ Ｍｅ４＋Ｅｍ５ ３４ Ｍｅ４＋Ｅｍ７ ４４ Ｍｅ４＋Ｅｍ９
５ Ｍｅ５＋Ｅｍ１ １５ Ｍｅ５＋Ｅｍ３ ２５ Ｍｅ５＋Ｅｍ５ ３５ Ｍｅ５＋Ｅｍ７ ４５ Ｍｅ５＋Ｅｍ９
６ Ｍｅ１＋Ｅｍ２ １６ Ｍｅ１＋Ｅｍ４ ２６ Ｍｅ１＋Ｅｍ６ ３６ Ｍｅ１＋Ｅｍ８ ４６ Ｍｅ１＋Ｅｍ１０
７ Ｍｅ２＋Ｅｍ２ １７ Ｍｅ２＋Ｅｍ４ ２７ Ｍｅ２＋Ｅｍ６ ３７ Ｍｅ２＋Ｅｍ８ ４７ Ｍｅ２＋Ｅｍ１０
８ Ｍｅ３＋Ｅｍ２ １８ Ｍｅ３＋Ｅｍ４ ２８ Ｍｅ３＋Ｅｍ６ ３８ Ｍｅ３＋Ｅｍ８ ４８ Ｍｅ３＋Ｅｍ１０
９ Ｍｅ４＋Ｅｍ２ １９ Ｍｅ４＋Ｅｍ４ ２９ Ｍｅ４＋Ｅｍ６ ３９ Ｍｅ４＋Ｅｍ８ ４９ Ｍｅ４＋Ｅｍ１０
１０ Ｍｅ５＋Ｅｍ２ ２０ Ｍｅ５＋Ｅｍ４ ３０ Ｍｅ５＋Ｅｍ６ ４０ Ｍｅ５＋Ｅｍ８ ５０ Ｍｅ５＋Ｅｍ１０
４７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
１．２．４ 杂交后代真实性鉴定 根据筛选出的多态性高，父母本间有特异条带的引物组合对杂交后代进行真实性
鉴定。后代扩增结果中具有父本特异性带的即为真杂种，而只具有母本特异条带无父本特征带的后代为假杂种
或自交种。
２ 结果与分析
２．１ 材料基因组ＤＮＡ的检测
对６份亲本及３７份杂交后代共４３份材料的ＤＮＡ浓度和质量进行检测，结果表明，参试材料的ＤＮＡ浓度
和质量都较高，符合本试验的要求（图１和２）。
图１ 结缕草属亲本基因组犇犖犃原液（左）及部分杂交后代基因组犇犖犃原液（右）电泳
犉犻犵．１ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃犳狅狉狆犪狉犲狀狋狊（犔犲犳狋）犪狀犱犳狅狉狊狅犿犲犮狉狅狊狊犻狀犵狆狉狅犵犲狀犻犲狊（犚犻犵犺狋）狅犳犣狅狔狊犻犪
编号１～６分别为材料Ｚ０２２、Ｚ０６８、Ｚ１０５、Ｚ１１９、Ｚ１２３、Ｚ３１３１－６ｒｅｆｅｒｔｏＺ０２２、Ｚ０６８、Ｚ１０５、Ｚ１１９、Ｚ１２３、Ｚ３１３
图２ 稀释为５０狀犵／μ犔的亲本基因组犇犖犃（左）及部分杂交后代犇犖犃电泳检测（右）
犉犻犵．２ ５０狀犵／μ犔犱犻犾狌狋犻狅狀狅犳犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃犳狅狉狆犪狉犲狀狋狊（犔犲犳狋）犪狀犱犳狅狉狊狅犿犲犮狉狅狊狊犻狀犵狆狉狅犵犲狀犻犲狊（犚犻犵犺狋）
编号１～６分别为材料Ｚ０２２、Ｚ０６８、Ｚ１０５、Ｚ１１９、Ｚ１２３、Ｚ３１３，编号７为λＤＮＡ
１－６ｒｅｆｅｒｔｏＺ０２２、Ｚ０６８、Ｚ１０５、Ｚ１１９、Ｚ１２３、Ｚ３１３，７ｒｅｆｅｒｓｔｏλＤＮＡ
２．２ ＳＲＡＰ引物组合的筛选
本研究通过５０对引物对６个亲本的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增结果分析，共有２０对引物的扩增效果较好，即在这
２０对引物组合中父本能扩增出所有母本没有的特异性条带，另还有５对引物组合是父本能扩增出部分母本所没
有的特征带（表５，图３），共占５０％。从中选取９对扩增条带较清晰、带型较丰富的引物，即１，３，１４，１８，２３，２５，
３８，３９和４５号引物（表４），用于对５个杂交组合的后代进行鉴定，扩增出具有父本特异性条带的即为真杂种，否
则为假杂种。
２．３ 杂种鉴定
利用筛选出的９对引物对５个杂交组合、３７个后代进行鉴定，第１次用１和３号２对引物对所有杂交后代进
行鉴定，共有２２个后代具有父本特异性条带，为真杂种；然后用３９和４５号２对引物对其余的１５个后代再次鉴
定，其中８个因具有父本特异带被鉴定为真杂种，其他７个后代仍需引物进行鉴定；接着用２３和２５号引物对７
个杂交后代鉴定，有２个具有父本特征带，为真杂种；为了鉴定的准确性，本研究再次对以上未鉴定出的５个后代
用３对引物，即１４，１８，３８号引物对其扩增，结果表明，此５个后代未能扩增出父本特征带，确定为假杂种。
这９对引物的鉴定结果表明，在所鉴定的结缕草属５个杂交组合３７个后代中，共有３２个后代可以鉴定为真
杂种，其鉴定结果见表６及图４。以杂交组合３（Ｚ０２２×Ｚ１２３）和９（Ｚ０６８×Ｚ１２３）为例，首先用１号引物对其２个
组合的后代进行鉴定（图４Ａ），扩增结果表明后代０３２，０３５，０３７，０３９，０３１１在以Ｍａｒｋｅｒ为标准的２８０ｂｐ处有
父本Ｚ１２３的特异性条带，被鉴定为真杂种；接着用３９号引物对没有特异性条带２８０ｂｐ的后代进行第２次鉴定
（图４Ｂ），结果显示，后代０３４，０３８，０３１０，０９１具有父本特异带１５５和１３５ｂｐ的被确定为真杂种；接着用２５号
５７第１８卷第１期 草业学报２００９年
表５ ５０对犛犚犃犘引物组合筛选情况
犜犪犫犾犲５ 犛犲犾犲犮狋犻狅狀狊狅犳５０犛犚犃犘狆狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物筛选
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物筛选
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物筛选
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物筛选
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
编号
Ｃｏｄｅｓ
引物筛选
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
１ ● １１ √ ２１ ３１ ４１
２ １２ ２２ ３２ ● ４２ √
３ ● １３ ● ２３ ● ３３ ● ４３
４ √ １４ ● ２４ √ ３４ ● ４４
５ １５ ２５ ● ３５ ４５ ●
６ ● １６ ２６ ３６ ● ４６
７ ● １７ ２７ ● ３７ ４７
８ １８ ● ２８ ● ３８ ● ４８
９ １９ ２９ ● ３９ ● ４９
１０ √ ２０ ３０ ４０ ５０ ●
注：●为父本能扩增出所有母本没有的特异性条带的引物组合；√为父本能扩增出部分母本所没有的特征带的引物组合；为父母本间无特异带
的引物组合。
Ｎｏｔｅ：●ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｎｄｓｂｅｔｗｅｅｎ♂ａｎｄ♀（ａｌ）；√ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｎｄｓｂｅｔｗｅｅｎ♂ａｎｄ♀（ｐａｒｔｉａｌ）；ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓ
ｗｉｔｈｏｕｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｎｄｓｂｅｔｗｅｅｎ♂ａｎｄ♀．
图３ 部分引物组合筛选的扩增结果
犉犻犵．３ 犃犿狆犾犻犳犻犲犱狉犲狊狌犾狋狊狌狊犻狀犵狊狅犿犲狆狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２３～２６为表４编号对应的引物组合；每个引物组合的试验材料从左至右依次为Ｚ３１３、Ｚ１１９、Ｚ０２２、Ｚ１２３、Ｚ０６８、Ｚ１０５Ｍ：ＤＮＡ
ｍａｋｅｒ；２３－２６：Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔｈｅｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ（ｔａｂｌｅ４），ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍａｔｅｒｉａｌｓｗｅｒｅＺ３１３、Ｚ１１９、Ｚ０２２、Ｚ１２３、Ｚ０６８ａｎｄＺ１０５ｆｒｏｍｌｅｆｔ
ｔｏｒｉｇｈｔｉｎｅａｃｈｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
表６ ３７个杂交后代犛犚犃犘鉴定结果
犜犪犫犾犲６ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳３７犮狉狅狊狊犻狀犵狆狉狅犵犲狀犻犲狊犫狔犛犚犃犘
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
鉴定后代
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｐｒｏｇｅｎｉｅｓ
杂种
Ｈｙｂｒｉｄｓ
１，３ １９１，１９２，１９３，１９４，１９６，１９７，１９８，０３２，０３４，０３５，０３６，０３７，０３８，
０３９，０３１０，０３１１，１３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１３６，１３８，１３１２，０９１，
２１１，２１２，２１３，２１４，２１５，２１６，２１７，２１８，２１９，２１１０，２１１１，２１１２
１９１，１９２，１９４，０３２，０３５，０３７，０３９，０３１１，１３
１，１３２，１３３，１３５，１３６，１３８，１３１２，２１１，２１２，
２１４，２１８，２１９，２１１０，２１１２
３９，４５ １９３，１９６，１９７，１９８，０３４，０３６，０３８，０３１０，１３４，０９１，２１３，２１５，２１
６，２１７，２１１１
０３４，０３８，０３１０，１９６，１９８，１３４，０９１，２１５
２３，２５ １９３，１９７，０３６，２１３，２１６，２１７，２１１１ ０３６，２１１１
１４，１８，３８ １９３，１９７，２１３，２１６，２１７ －
６７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
图４ 杂交后代的犛犚犃犘分析
犉犻犵．４ 犛犚犃犘犪狀犪犾狔狊犻狊狅狀狋犺犲犮狉狅狊狊犻狀犵狆狉狅犵犲狀犻犲狊狅犳犣狅狔狊犻犪
Ａ：１号引物第１次鉴定组合３（Ｚ０２２×Ｚ１２３），组合９（Ｚ０６８×Ｚ１２３）；Ｂ：３９号引物第２次鉴定组合３（Ｚ０２２×Ｚ１２３），组合９（Ｚ０６８×Ｚ１２３）；Ｃ：２５号引
物第３次鉴定组合３（Ｚ０２２×Ｚ１２３）Ａ：Ｔｈｅｆｉｒｓｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｒｏｓｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ３（Ｚ０２２×Ｚ１２３）ａｎｄ９（Ｚ０６８×Ｚ１２３）ｗｉｔｈｐｒｉｍｅｒ１；Ｂ：Ｔｈｅｓｅｃ
ｏｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｒｏｓｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ３（Ｚ０２２×Ｚ１２３）ａｎｄ９（Ｚ０６８×Ｚ１２３）ｗｉｔｈｐｒｉｍｅ３９；Ｃ：Ｔｈｅｔｈｉｒｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｒｏｓｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ３（Ｚ０２２
×Ｚ１２３）ｗｉｔｈｐｒｉｍｅｒ１９
引物对组合３（Ｚ０２２×Ｚ１２３）的后代０３６再次鉴定（图４Ｃ），发现０３６在２７０ｂｐ处有父本的特异条带，确定为真
杂种。因此，利用不同的引物对３（Ｚ０２２×Ｚ１２３）和９（Ｚ０６８×Ｚ１２３）２个组合共１０个后代的鉴定结果表明，这１０
个后代因在不同的引物中都具有父本的特异条带而被确定为真杂种，且杂交后代即使被鉴定为真杂种，也并不一
定是双亲扩增条带之和，而会出现某些谱带的消失或新谱带的出现，同时同一杂交组合中的后代在相同的引物扩
增条件下谱带也不一致（图４），另外，为了更全面、更准确地对结缕草属杂交后代进行鉴定，本研究利用了多对不
同的ＳＲＡＰ引物进行鉴定。这些结果都表明了通过杂交，后代产生了丰富的变异，这也与郭海林［１］的研究结果
相一致。本研究中其他几个组合的后代也同样是根据后代是否具有父本特征带进行鉴定的，方法同上，不再一一
例举。
３ 讨论
３．１ 目前，用于植物杂交后代的鉴定方法主要有形态学、细胞学、同工酶及分子标记等。对形态学的研究是最直
接、最基础的鉴定方法。结缕草属的杂交后代从外部性状上来鉴别主要包括生殖和营养特征，生殖性状包括生殖
枝高度、穗轴长度、花序长度与宽度、小穗长度和宽度等，营养性状包括叶片长度和宽度、节间长度和直径、草层高
度、密度等，郭海林［１］的研究表明通过这些外部性状的调查和测量，可以初步把结缕草属杂交后代从形态学上进
行鉴定。但形态特征容易受环境条件的影响，不能真实、准确地反应其后代的遗传变异。细胞染色体是遗传物质
的载体，结缕草属植物的染色体非常小，为４２１Ｍｂ［２１］。Ｋｉｔａｍｕｒａ［２２］的研究表明，日本本土的结缕草属植物染色
体是２狀＝４０，在染色体上没有变异。Ｙａｎｅｓｈｉｔａ等［２３］通过ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，限
制性片段长度多态性）标记构建结缕草属植物的遗传连锁图谱，结果表明结缕草属植物的染色体倍性为２狀＝４ｘ
＝４０。这都说明在遗传学上结缕草属植物在物种的形成过程中没有造成染色体数量上的变化。因此结缕草属杂
交后代就无需从细胞学角度来鉴定了。同工酶是基因作用的产物，同工酶的差异在很大程度上反映了基因的差
异，这是鉴定杂交后代的理论依据。同工酶鉴定杂种在其他很多植物上已有报道，而在结缕草属杂种鉴定中，仅
郭海林等［２４］的研究中有所报道，即通过酯酶与过氧化物酶对结缕草的杂交后代进行了真实性鉴定。但同工酶的
试验结果会随着植物不同发育时期、器官及环境而变化，可利用的遗传位点数量相对较少，有些同工酶位点的变
异并不一定代表整个基因组的变异，而且有些变异可能无法通过电泳检测到等［２１］，这些缺点可能限制同工酶在
杂种鉴定中的应用。因此，为了更准确、全面地了解结缕草属杂交后代的变异情况及杂种鉴定，还必须从分子水
平上进行研究。
３．２ ＤＮＡ是生物的遗传物质，ＤＮＡ的多态性是生物多样性的本质内容。目前国内外许多学者都已经利用
ＤＮＡ分子标记技术在草坪草及牧草［２５～２７］上进行了各种研究。在结缕草属植物的研究中，ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、
ＡＦＬＰ、ＩＳＳＲ标记在亲缘关系鉴定、遗传分析、指纹图谱及遗传连锁图谱［２３，２８～３２］等应用中均有报道。但在结缕草
７７第１８卷第１期 草业学报２００９年
的杂交后代鉴定中仅有ＳＳＲ［１］标记的报道，但ＳＳＲ单个标记提供的信息量较少，引物具有物种特异性，开发难度
也大，成本较高，因此ＳＳＲ标记的应用也受到一定的影响。ＳＲＡＰ标记作为一种新型的分子标记，自从发明以来
已得到了广泛的应用。与ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ分子标记相比，ＳＲＡＰ标记具有简单、产率高、结果稳定可靠、在基
因组中分布均匀、易从序列中得到分离条带、引物合成成本较低且较少的正、反向引物即可组合成较多的引物组
合等优点，从而弥补了其他分子标记重复性差、引物开发成本高、操作复杂、基因组要求严格等不足。从本研究的
ＳＲＡＰ分析结果中可以看出，ＳＲＡＰ鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠。因此该分子标记及其反应体系都非常适
合结缕草的遗传分析及其他分子研究。
３．３ 本研究通过９对ＳＲＡＰ引物对结缕草属５个组合，３７个后代进行鉴定，结果表明，共有３２个后代因具有父
本的特征带而被鉴定为真杂种，而其他５个后代因不具有父本特征带，被鉴定为假杂种。同时，从杂种扩增的条
带看，杂种谱带并不是双亲谱带之和，而是出现了新谱带的增加或某些谱带的消失，同一杂交组合中的后代在相
同的引物下扩增的条带也不一致，另外，本研究利用不同的ＳＲＡＰ引物对同一组合的后代进行多次鉴定获得了
更准确、全面的结果。这些结果均表明结缕草属植物通过杂交育种导致了后代的基因重组，并产生了丰富的变
异，这都为杂交后代的选育工作提供了依据。同时杂交后代真实性的鉴定也为进一步选育优良杂交后代奠定了
基础。
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犎狔犫狉犻犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆狉狅犵犲狀犻犲狊狅犳犣狅狔狊犻犪犮狉狅狊狊犲狊犫狔犛犚犃犘犿犪狉犽犲狉
ＸＵＥＤａｎｄａｎ１，２，ＧＵＯＨａｉｌｉｎ１，ＺＨＥＮＧＹｉｑｉ１，ＣＨＥＮＸｕａｎ１，ＬＩＵＪｉａｎｘｉｕ１
（１．ＩｎｓｉｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅａｎｄＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＳｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ）ｉｓａｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｉｑｕｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｏｎ
ｔｈｅｂａｓｉｓｏｆＰＣＲ．Ｔｈｅａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙｏｆ３７ｐｒｏｇｅｎｉｅｓｏｆ５犣狅狔狊犻犪ｇｒａｓｓｃｒｏｓｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙ
ＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｔｏｓｅｌｅｃｔｏｕｔｔｈｅｔｒｕｅｈｙｂｒｉｄｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙ．Ｆｉｒｓｔ，ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｂａｎｄｓｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒ
ｔｈｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔｂｕｔａｂｓｅｎｔｆｒｏｍｔｈｅｆｅｍａｌｅ，ｔｈｅｎ９ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄａｐｐｌｉｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｈｙｂｒｉｄｓ．
Ｔｈｅａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｐｒｏｇｅｎｉｅｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｗｈｅｔｈｅｒｏｒｎｏｔｔｈｅｙｈａｄｔｈｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｂａｎｄｓ．
Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ３２ｐｒｏｇｅｎｉｅｓｗｉｔｈｔｈｅｓｅｓｐｅｃｉｆｉｃｂａｎｄｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｈｅｒｅｆｏｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｔｒｕｅｈｙｂｒｉｄｓ．Ｔｈｅａｍｐｌｉ
ｆｉｅｄｂａｎｄｓｏｆＳＲＡＰｗｅｒｅｃｌｅａｒａｎｄｓｔａｂｌｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｈｙｂｒｉｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｏｍｅ
ｗｉｔｈｎｅｗｂａｎｄｓａｎｄｓｏｍｅｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅｐａｒｅｎｔｂａｎｄｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｓｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｔｈｅａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｒｏｇｅｎｉｅｓｏｆ犣狅狔狊犻犪
ｇｒａｓｓ
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣狅狔狊犻犪；ｃｒｏｓｓｂｒｅｅｄｉｎｇ；ＳＲＡＰｍａｒｋｅｒ；ｈｙｂｒｉｄｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
９７第１８卷第１期 草业学报２００９年