全 文 ：星星草犘狋犌犃犘犇犎基因的克隆与表达分析
张１，郭海俊１，刘龙飚２，王卅１，梁颖１，聂玉哲１，李玉花１
（１．东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨１５００４０；２．中国石油天然气管道工程有限公司天津设计院，天津３００４５７）
摘要：本试验利用ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）克隆技术从星星草中克隆得到抗盐碱相关基因甘油醛
３磷酸脱氢酶（犌犃犘犇犎）的ｃＤＮＡ全长序列，其 ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号为ＪＸ４１１９５４。犘狋犌犃犘犇犎 基因开放阅读框为
１０１４ｂｐ，编码３３７个氨基酸。该氨基酸序列与高羊茅、大麦、小麦、水稻等禾本科作物具有较高的序列相似性。系
统进化分析表明，犘狋犌犃犘犇犎 基因编码蛋白与单子叶植物的ＧＡＰＤＨ具有较近的亲缘关系。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析显
示，在一定盐碱胁迫条件下，随着处理试剂Ｎａ２ＣＯ３ 溶液浓度的增加，犘狋犌犃犘犇犎 基因在盐碱胁迫下的叶片和根部
表达量都显著升高；超过最大耐受量后，犘狋犌犃犘犇犎 基因表达丰度逐渐降低。犘狋犌犃犘犇犎 基因的表达模式代表了
星星草在盐碱胁迫下其自身的生理生化变化对分子水平上的基因表达丰度产生的影响趋势。
关键词：星星草；盐碱胁迫；犘狋犌犃犘犇犎；ＲＡＣＥ克隆；表达分析
中图分类号：Ｓ５４０．３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１４）０２０２０７０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０２２５　　
　　星星草（犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪）俗称碱茅，属多年生旱中生盐生草本植物，广泛分布在我国北方和世界大部
分地区，具有适应性强、耐旱、耐寒、耐盐碱等特性，是一种较好的改良盐碱化土壤的先锋植物［１］。该植物的根系
发达，具有较强的耐盐碱能力，在生理上通过渗透调节作用减轻盐碱对细胞膜的损害，利用有限的水分散失获取
最大的ＣＯ２ 同化量，降低气孔导度、延缓蒸腾作用以适应盐碱胁迫下吸水困难的特性［２］。在分子水平上，通过构
建星星草ｃＤＮＡ文库及芯片杂交的方法，已获得部分与耐盐碱特性相关的高丰度表达基因［３］，包括离子和水分
转运、细胞代谢和防御、信号转导与转录调控等方面。
目前在星星草抗盐碱特性分子机制的研究中，已经获得采用ＮａＨＣＯ３ 胁迫的模拟盐碱环境中的星星草基因
表达谱，并通过差异显示技术获得了多个差异表达的基因片段［４］。
在从星星草中分离出的相关抗盐碱基因中，如 犎犓犜２［５］，犌犃犘犇犎 等基因都是其中重要的基因之一，而
犌犃犘犇犎 编码的蛋白（ＧＡＰＤＨ）是高等植物糖酵解过程中的关键酶，是维持生命活动能量形成的基本酶类之
一［６］，参与基因表达的转录后控制，作用于核ｔＲＮＡ运输、ＤＮＡ复制与修复等过程，以及调控组蛋白基因的表
达、调节端粒结构等［７８］。此外，ＧＡＰＤＨ通过抑制活性氧积累［９］、激活 ＭＡＰＫ级联反应［１０］等途径及多种修饰作
用［１１１２］参与多种生理过程，具有抵抗逆境胁迫的功能。然而，关于ＧＡＰＤＨ参与植物逆境胁迫响应的机制还需
进一步深入研究。
本研究以星星草为试材，采用ｃＤＮＡ末端快速扩增（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）的方法克隆
星星草犌犃犘犇犎 基因，并对其在盐碱胁迫下的表达情况进行了分析，为在分子水平上研究星星草的耐盐碱机制、
深入了解星星草犌犃犘犇犎 基因的功能提供依据。
１　材料与方法
１．１　试验材料
星星草种子来源于２００８年５月份返碱期在黑龙江省青冈县（东经１２６°０６″，北纬４６°４１″）天然盐碱地（ｐＨ
９．５）草场，采摘后于２０１０年种于温室，栽培基质采用草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝３∶２∶１，温度２５℃，光照强度为
第２３卷　第２期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
２０７－２１４
２０１４年４月
收稿日期：２０１３０８２２；改回日期：２０１３１０２２
基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（２０１３ＡＡ１０２７０６）和东北林业大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（ＤＬ１２ＢＡ０８）资助。
作者简介：张（１９７７），女，黑龙江哈尔滨人，副教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｓｕｍｍｅｒｚｈａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｙｈｓｈｅｎ＠１２６．ｃｏｍ
４００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），相对湿度６５％～７５％，生长到８周龄时用０，５０，１００，１５０和２００ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＣＯ３ 分别处理
２４ｈ后取其地上部分，每组同时取３次样，用于实验重复，然后用液氮速冻，于－８０℃保存备用。在此基础上，采
用２００ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＣＯ３ 分别处理０，２，６，１２，２４，４８和７２ｈ，将草的叶片和根部剪下，每组同时取３次样用于实验
重复，用液氮速冻，于－８０℃冰箱保存备用。
１．２　ＲＮＡ提取与ＲＡＣＥ库构建
采用十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）的方法提取
星星草地上部总ＲＮＡ，灭菌去离子水溶解ＲＮＡ，利用
ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００微量紫外分光光度计测量样品的
ＯＤ２６０和 ＯＤ２８０比值及浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测
ＲＮＡ的完整性。利用 ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（购自
ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司）对星星草ＲＮＡ进行纯
化，然后利用 ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ ｃＤＮＡ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ
（购自ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司）构建星星草ＲＡＣＥｃＤＮＡ
库，最后利用ＲＡＣＥｃＤＮＡ库进行基因克隆。
星星草犌犃犘犇犎 基因克隆及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交探针
引物通过ＰｒｉｍｅｒＰｒｉｍｅｒ５软件设计，并由上海生物工
程有限公司进行合成。引物序列见表１。
１．３　星星草犌犃犘犇犎 基因克隆及序列测定
对星星草犌犃犘犇犎 基因３′序列的克隆，根据星星
表１　星星草犌犃犘犇犎基因同源克隆及表达分析所用引物
犜犪犫犾犲１　犔犻狊狋狅犳狆狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犳狅狉犮犾狅狀犻狀犵犪狀犱犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀
犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犌犃犘犇犎犳狉狅犿犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪
编号
Ｎｏ．
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ
核苷酸序列（５′→３′）
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ５′ｔｏ３′
１ ＡＰ１ ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
２ ＡＰ２ ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ
３ ＧＳＰ５′１ ＣＧＴＴＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＣＧＴＧＣＧＡＴＧ
４ ＧＳＰ５′２ ＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣＴＧＧ
５ ＧＳＰ３′１ ＴＣＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣ
６ ＧＳＰ３′２ ＴＣＧＣＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＣＧＧＧ
７ ＧＡＰＤＨＬＦ ＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＧＧＣＡ
８ ＧＡＰＤＨＬＲ ＧＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＧＴＴＣＡＣＴＴＧＧ
９ ＧＡＰＤＨＮＦ ＡＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧ
１０ ＧＡＰＤＨＮＲ ＴＣＣＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＡＡＣＣＴＡ
草抑制性消减杂交文库中犌犃犘犇犎 基因的ＥＳＴ序列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号ＧＷ４０５８２０），设计２条３′ＲＡＣＥ上游引
物ＧＳＰ３′１和ＧＳＰ３′２，然后以ＲＡＣＥｃＤＮＡ库为模板进行巢式ＰＣＲ扩增。第一轮ＰＣＲ反应引物采用ＧＳＰ３′１
及ＡＰ１，反应程序为９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６８℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３５个循环；７２℃，７ｍｉｎ。第二轮ＰＣＲ反应引
物采用ＧＳＰ３′２及ＡＰ２，反应程序为９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５７℃３０ｓ，７２℃１．５ｍｉｎ，３５个循环；７２℃，７ｍｉｎ。
对于星星草犌犃犘犇犎 基因５′序列的克隆，根据星星草犌犃犘犇犎 基因片段，设计２条５′ＲＡＣＥ上游引物
ＧＳＰ５′１和ＧＳＰ５′２。然后以ＲＡＣＥｃＤＮＡ库为模板进行巢式ＰＣＲ扩增。第一轮ＰＣＲ反应引物采用ＧＳＰ５′１及
ＡＰ１，反应程序为９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６８℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３５个循环；７２℃，７ｍｉｎ。第二轮ＰＣＲ反应引物采
用ＧＳＰ５′２及ＡＰ２，反应程序为９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１．５ｍｉｎ，３５个循环；７２℃，７ｍｉｎ。
对于克隆得到星星草犌犃犘犇犎３′和５′的基因片段测序并拼接，并在 ＮＣＢＩ网站上利用 ＯＲＦ（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅｆｉｎｄｅｒ）预测氨基酸序列，并根据ＯＲＦ两端序列设计特异引物ＧＡＰＤＨＬＦ和 ＧＡＰＤＨＬＲ扩增犌犃犘犇犎
基因的编码区。反应程序为９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５６℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３５个循环；７２℃，７ｍｉｎ。
将所有ＰＣＲ产物利用天根公司的胶回收试剂盒对电泳后产物进行回收纯化，并与天根公司的ｐＢＳＴＴＡ载
体进行连接，转化到ＴａＫａＲａ公司Ｔｏｐ１０大肠杆菌感受态细胞中，提取重组质粒，质粒经过ＰＣＲ鉴定后送北京
六合华大基因进行测序。
１．４　序列比对及系统发育分析
为了明确所克隆基因在生物信息学中的进化地位，将所得序列与ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ数据库中序列进
行ＢＬＡＳＴ检索比对，获得与所克隆序列高度相似的同源基因序列，使用ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８３软件进行碱基序列比对，
使用ＧｅｎｅＤｏｃ软件进行氨基酸序列比对分析及保守域的信息标注；使用ＮＣＢＩ提供的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ与保守区数据
库（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｄａｔａｂａｓｅ，ＣＤＤ）分别进行基因开放阅读框分析与蛋白保守结构域分析，并将克隆所得碱基
序列按照标准遗传密码子的翻译方式转换为氨基酸序列。使用ＥｘＰＡＳＹ软件计算蛋白的理论分子量、等电点、
不稳定系数等参数；使用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ预测和分析蛋白质的疏水性／亲水性。利用ＳｉｇｎａｌＰ３．０（或４．０）Ｓｅｒｖｅｒ程序
预测信号肽结构。用 ＭＥＧＡ４软件的邻位相连法（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ）构建系统树。参数设定１０００个抽样重
８０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
复进行Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ验证，泊松校验（ＰｏｉｓｓｏｎＣｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）作为计算距离的方法。
１．５　星星草犘狋犌犃犘犇犎 基因的表达分析
利用ＣＴＡＢ试剂提取经不同浓度Ｎａ２ＣＯ３（０，５０，１００，１５０，２００ｍｍｏｌ／Ｌ）处理及不同处理时间（０，２，６，１２，
２４，４８，７２ｈ）的星星草地上部及根部样品总ＲＮＡ；分别取１０μｇ总ＲＮＡ样品进行１．０％的甲醛琼脂糖变性凝胶
电泳，并转移到ＨｙｂｏｎｄＮ＋尼龙膜上，６５℃预杂交１ｈ，使用地高辛标记的犌犃犘犇犎 特异探针（探针引物ＧＡＰ
ＤＨＮＦ及ＮＲ，探针长度３００ｂｐ）杂交１ｈ，显影，通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测犌犃犘犇犎 基因在不同处理条件下的表
达量变化。
２　结果与分析
２．１　星星草犌犃犘犇犎 基因全长ｃＤＮＡ序列的克隆及序列比对
根据星星草犌犃犘犇犎 基因的ＥＳＴ序列，设计犌犃犘犇犎 基因的３′端和５′端基因特异引物，利用构建的星星草
ＲＡＣＥｃＤＮＡ库，分别克隆得到基因３′端（２４１ｂｐ）和５′端（９５３ｂｐ），经过拼接得到１３００ｂｐ全长基因序列（图１）。
去除该基因的３′端非编码区和５′端非编码区，该基因ＣＤＳ长为１０１４ｂｐ，包含１个编码３３７个氨基酸的开放阅读
框。将此基因序列及其推导的氨基酸序列在ＮＣＢＩ的数据库中进行Ｂｌａｓｔｎ和Ｂｌａｓｔｐ比对分析，该基因与大麦
（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）等植物的犌犃犘犇犎 基因具有极高的相似
性，因而将该基因片段命名为犘狋犌犃犘犇犎，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＪＸ４１１９５４。该基因编码蛋白的预测分子量为３６．５
ｋＤａ，理论等电点（ｐＩ）为６．４０，负电荷残基总数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为４１，正电荷残基总数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为３９，不稳定系数
为２３．１７，属于稳定蛋白；亲水性（ｇｒａｎｄａｖｅｒａｇｅｏｆｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ，ＧＲＡＶＹ）值为－０．０６８，说明此蛋白属于亲水
蛋白。信号肽预测表明，犘狋犌犃犘犇犎 基因编码的蛋白无信号肽结构，为非分泌性蛋白（ｎｏｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ）。
图１　犘犆犚产物检测
犉犻犵．１　犜犺犲犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犘狋犌犃犘犇犎
Ｍ：ＤＬ２０００标记；Ａ：３′ＰＣＲ产物；Ｂ：５′ＰＣＲ产物；Ｃ：ＣＤＳ产物。Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ａ：３′ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；Ｂ：５′ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；Ｃ：ＣＤＳｐｒｏｄｕｃｔ．
利用ＮＣＢＩ的蛋白保守区数据库（ＣＤＤ）对ＰｔＧＡＰＤＨ蛋白进行蛋白保守区预测。结果显示，犘狋犌犃犘犇犎 基
因编码的蛋白具有２个保守区，分别是 Ｇｐ＿ｄｈ＿Ｎ 末端（Ｇｐ＿ｄｈ＿Ｎｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）和Ｇｄ＿ｐｈ＿Ｃ末端超家族
（Ｇｄ＿ｐｈ＿Ｃｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）。结合已有报道，如毛竹（犘犺狔犾犾狅狊狋犪犮犺狔狊狆狌犫犲狊犮犲狀狊）ＧＡＰＤＨ蛋白［１２］为糖酵解和糖异生
的关键酶，也具有２个保守的结构域：其中保守区的Ｃ端为Ｇｄ＿ｐｈ＿Ｃα螺旋和反平行β折叠的混合结构，是行使
糖运输和糖代谢的催化功能域；另一个保守区是Ｇｄ＿ｐｈ＿Ｎ，为ＮＡＤ＋结合功能域（图２），由此类比表明ＰｔＧＡＰ
ＤＨ蛋白具有高度的保守性。
ＰｔＧＡＰＤＨ与其他近缘物种ＧＡＰＤＨ蛋白质的多重氨基酸序列比对结果表明，星星草犘狋犌犃犘犇犎 基因编码
的氨基酸序列与其他近源物种的ＧＡＰＤＨ蛋白均具有较高的相似性，相似度约在８７％～９７％之间，其中与禾本
科植物高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）、大麦、小麦、水稻的相似性最高，分别为９７％，９６％，９５％和９１％，显示了
犌犃犘犇犎 基因在物种进化过程中的保守性；ＭＥＭＥＭｏｔｉｆ分析表明在ＰｔＧＡＰＤＨ蛋白的第１３５～１４２个氨基酸
９０２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
位置以及第３１４～３２２个氨基酸位置分别含有２个保守的基序结构，推测其与ＧＡＰＤＨ作为甘油醛３磷酸脱氢
酶在糖酵解中行使的功能相关（图３）。
２．２　犘狋犌犃犘犇犎 与其他近缘物种的犌犃犘犇犎 基因的系统发育关系
为了确定犘狋犌犃犘犇犎 基因的系统发生位置，从ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ数据库中选取１６个近源物种的
犌犃犘犇犎 基因的序列信息来构建系统发生树。图４显示了系统发生树构建的结果，星星草犘狋犌犃犘犇犎 基因编码
蛋白与单子叶植物的ＧＡＰＤＨ为同一起源，并与高羊茅的同源性最高，在进化上属于同一类分支。
图２　犘狋犌犃犘犇犎基因编码蛋白的氨基酸保守区
犉犻犵．２　犜犺犲犮狅狀狊犲狉狏犲犱犱狅犿犪犻狀狅犳犘狋犌犃犘犇犎
　Ｇｐ＿ｄｈ＿Ｎｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：甘油醛３磷酸脱氢酶，Ｎ端结构域。Ｇｐ＿ｄｈ＿Ｃｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：甘油醛３磷酸脱氢酶，Ｃ端结构域。ＰＬＮ０２３５８：甘油醛３磷酸
脱氢酶。
　
图３　不同植物来源的犌犃犘犇犎氨基酸序列多重比对
犉犻犵．３　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犌犃犘犇犎犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犾犪狀狋狊
０１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
续图３　不同植物来源的犌犃犘犇犎氨基酸序列多重比对
犆狅狀狋犻狀狌犲犉犻犵．３　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犌犃犘犇犎犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犾犪狀狋狊
　犘狋犌犃犘犇犎 （ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＪＸ４１１９５４）：星星草犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪；ＴｍＧＡＰＤＨ （ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，
ＡＹ８５７７６５）：一粒小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犿狅狀狅犮狅犮犮狌犿；ＺｍＧＡＰＤＨ （ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＥＵ９６３９９１）：玉米犣犲犪犿犪狔狊；ＳｉＧＡＰＤＨ （Ｇｅｎｅ
Ｂａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＸＭ＿００４９７２９１６）：小米犛犲狋犪狉犻犪犻狋犪犾犻犮犪；ＬｔＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＥＵ３２８５３３）：毒麦犔狅犾犻狌犿
狋犲犿狌犾犲狀狋狌犿；ＦａＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＧＱ４８０７７２）：高羊茅犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪；ＨｖＡＫ３５９５００（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ，ＡＫ３５９５００）：大麦芽犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲；ＯｓＧＡＰＤＨ （ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＧＱ８４８０４９）：水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪；ＴａＧＡＰＤＨ
（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＦＮ４２９９８５）：小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿；ＨｖＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，Ｘ６０３４３）：大麦芽
犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲；ＢｄＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＸＭ＿００３５７３２７６）：二穗短柄草犅狉狅犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀；ＰｓＧＡＰＤＨ（Ｇｅｎｅ
Ｂａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＤＱ９２２６８０）：西伯利亚蓼犘狅犾狔犵狅狀狌犿狊犻犫犻狉犻犮狌犿；ＡｌＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＪＮ６０４５３１）：獐草
犃犲犾狌狉狅狆狌狊犾犪犵狅狆狅犻犱犲狊；ＰｐＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＢ８２６１２３）：沙梨犘狔狌狉狊狆狔狉犻犳狅犾犻犪．
２．３　盐碱胁迫下犘狋犌犃犘犇犎 基因的表达分析
为了检测星星草犘狋犌犃犘犇犎 基因与盐碱逆境的应答关系，利用Ｎａ２ＣＯ３ 溶液模拟盐碱胁迫，对星星草犘狋
犌犃犘犇犎 基因的表达特性进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测。采用不同浓度的Ｎａ２ＣＯ３ 溶液对星星草植株进行处理，图５
所示的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明，５０～２００ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＣＯ３ 溶液处理２４ｈ后植株地上部犘狋犌犃犘犇犎 基因的表达
量均比对照组未处理的植株样品有不同程度的增加，且２００ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＣＯ３ 处理后表达量处于较高的稳定水
平。
选择２００ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＣＯ３ 溶液对星星草进行处理，并进行时间梯度的表达分析。图６和图７所示的结果表
明，植株地上部及根部犘狋犌犃犘犇犎 对Ｎａ２ＣＯ３ 处理后的胁迫均具响应。在星星草的叶片中，犘狋犌犃犘犇犎 基因在
无盐碱处理的样品（０ｈ）中几乎没有表达，在盐碱处理２和６ｈ后表达量增加；但在处理１２ｈ时，表达量又有所下
降；当处理２４ｈ时表达量又上升且达到最高，在处理４８及７２ｈ后表达量又回落，呈逐渐下降趋势。在根部中，
犘狋犌犃犘犇犎 基因在无盐碱胁迫处理时几乎不表达，在２ｈ后开始出现表达丰度，且表达量缓慢升高，在２４ｈ后表
１１２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
达量达到最大值，但在４８及７２ｈ后表达量又有所回落，呈逐渐下降趋势。表明一定浓度的盐碱胁迫诱导犘狋
犌犃犘犇犎 基因的高丰度表达，但是当胁迫程度（包括胁迫时间和浓度）超过可承受范围后，星星草样品的生理生
化机制发生变化，犘狋犌犃犘犇犎 基因的表达、应答通路受到干扰，导致其表达量回落到低水平。
图４　犘狋犌犃犘犇犎进化树分析
犉犻犵．４　犘犺狔犾狅犵犲狀犻犮犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犘狋犌犃犘犇犎犻狀狏犪狉犻狅狌狊狆犾犪狀狋狊狆犲犮犻犲狊
　犘狋犌犃犘犇犎（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＪＸ４１１９５４）：星星草犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪；ＡｔＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，
ＮＰ１７２８０）：拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪；ＡｃＧＡＰＤＨ （ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＤＱ４３８１４）：菠萝犃狀犪狀犪狊犮狅犿狅狊狌狊；ＳｔＧＡＰＤＨ（Ｇｅｎｅ
Ｂａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＢＢ７２８０４）：马铃薯犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿；ＰｐＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＥＭＪ２３６７３）：碧桃
犘狉狌狀狌狊狆犲狉狊犻犮犪；ＭｔＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＸＰ００３６０１８２８）：蒺藜苜蓿 犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪；ＯｓＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＮＰ００１０５３１３９）：水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪；ＴａＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＢＱ８１６４８）：小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿；
ＨｖＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＢＡＪ９０７０９）：大麦 犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲；ＳｌＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＸＰ
００４２３９１８１）：番茄犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿；ＦａＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＣＶ８６０３４）：高羊茅犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪；ＡｍＧＡＰＤＨ
（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＣＡＡ４２１０３）：金鱼草犃狀狋犻狉狉犺犻狌犿犿犪犼狌狊；ＬｃＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＥＯ７２１４３）：荔枝
犔犻狋犮犺犻犮犺犻狀犲狀狊犻狊；ＶｖＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＸＰ＿００２２６３１４５）：葡萄犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪；ＴｈＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ，ＢＡＪ３３９２６）：盐芥犜犺犲犾犾狌狀犵犻犲犾犾犪犺犪犾狅狆犺犻犾犪；ＳｄＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＥＯ４５７８５）：野甘草犛犮狅狆犪狉犻犪犱狌犾犮犻狊；Ｚｍ
ＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＤＺ５５２８３）：玉米犣犲犪犿犪狔狊．
图５　不同浓度犖犪２犆犗３ 处理后犘狋犌犃犘犇犎
基因的表达
犉犻犵．５　犘狋犌犃犘犇犎犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪犳狋犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋
犖犪２犆犗３犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狋狉犲狊狊
图６　２００犿犿狅犾／犔犖犪２犆犗３ 处理不同时间
后星星草叶片犘狋犌犃犘犇犎基因的表达
犉犻犵．６　犘狋犌犃犘犇犎犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪犳狋犲狉狋犻犿犲犵狉犪犱犻犲狀狋
狊狋狉犲狊狊狑犻狋犺２００犿犿狅犾／犔犖犪２犆犗３犻狀犾犲犪犳
３　讨论
在植物的抗盐生理研究中，先前多以 ＮａＣｌ为研究对象。然而在自然界的盐害胁迫中，除了 ＮａＣｌ外，以
Ｎａ２ＣＯ３ 为主的碱性盐也对植物产生重要影响。盐、碱２种胁迫机理有着明显的不同，但较ＮａＣｌ产生的盐胁迫
２１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
而言，Ｎａ２ＣＯ３带来的碱胁迫由于其能够提高土壤的
图７　２００犿犿狅犾／犔犖犪２犆犗３ 处理不同时间
后星星草根部犘狋犌犃犘犇犎基因的表达
犉犻犵．７　犘狋犌犃犘犇犎犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪犳狋犲狉狋犻犿犲犵狉犪犱犻犲狀狋
狊狋狉犲狊狊狑犻狋犺２００犿犿狅犾／犔犖犪２犆犗３犻狀狉狅狅狋　
ｐＨ 值，因而具有更大的生态破坏力。本研究以
Ｎａ２ＣＯ３ 胁迫下的星星草为研究对象，对挖掘该植物
的抗逆潜力，揭示其抗性特点，讨论其耐盐碱机理具有
重要意义。研究表明星星草对盐胁迫的耐受强度要高
于碱胁迫［１３］。处理结束时，ＮａＣｌ胁迫的最高存活浓
度为６００ｍｍｏｌ／Ｌ，而 Ｎａ２ＣＯ３ 的处理浓度超过２００
ｍｍｏｌ／Ｌ时即导致死亡。并且ＮａＣｌ对植株产生的影
响比较缓慢，而Ｎａ２ＣＯ３ 在处理浓度大于１００ｍｍｏｌ／Ｌ
后胁迫效应会明显加剧，使植物体的生长状态发生明
显变化，植物体内的一些渗透调节物质如脯氨酸等的积累量大幅升高［１４］，细胞内Ｎａ＋含量较ＮａＣｌ处理的植物
体有显著提高。而且与羊草（犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊）具有相似的生长适应策略及 Ｎａ＋、Ｋ＋ 代谢响应［１５］。尹尚军
等［１６］研究指出，星星草的各种胁变指标的最大变化多发生在Ｎａ２ＣＯ３ 浓度为１５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，本实验结果表明
星星草在Ｎａ２ＣＯ３ 胁迫条件下的致死浓度为２００ｍｍｏｌ／Ｌ，因此在研究不同浓度盐碱胁迫对星星草抗逆基因表
达的影响中设计５个特定浓度，即：０，５０，１００，１５０和２００ｍｍｏｌ／Ｌ。此外，本研究中选取８周龄的星星草作为试
材的原因是因为星星草的草龄一般在４个月左右，而８周龄正好是该草的生理成熟期，在该时间段上基因的表达
和一些生理指标呈现稳定趋势，受外界环境的影响较小。而太老或太嫩的植株会在各种数据上产生波动，不宜揭
示植物耐盐碱特性。
植物在经受盐碱胁迫的过程中，随着盐碱浓度的增加，细胞膜的透性增强，对离子的选择性吸收减弱，从而使
细胞内积累大量Ｎａ＋，保证细胞内外的渗透平衡。同时，盐碱胁迫会导致植物体内一些代谢副产物的累积，如活
性氧。Ｂａｅｋ等［１７］将犌犃犘犇犎 基因转化到拟南芥原生质体中，发现该基因能强烈抑制热胁迫时 Ｈ２Ｏ２ 的产生和
细胞的死亡。而ＰｔＧＡＰＤＨ就是该抗氧化系统中的重要酶类。随着对甘油醛３磷酸脱氢酶研究的不断深入，已
发现许多植物犌犃犘犇犎 基因可被多种环境胁迫所诱导，说明犌犃犘犇犎 基因的表达可能增强了植物抵抗这些胁
迫的能力。崔丽蓉等［１８］对小麦进行胁迫处理后发现犌犃犘犇犎 基因被诱导，表达量迅速增加，进而强化其抵御环
境变化的胁迫。于丽丽等［１９］利用ＰＥＧ、ＮａＣｌ及ＣｄＣｌ２ 处理诱导柽柳（犜犪犿犪狉犻狓），发现犜犺犌犃犘犇犎 基因在根中
的表达上升，但抑制其在茎和叶中的表达，而ＮａＨＣＯ３处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。在本项研究
中，盐碱胁迫处理会导致犘狋犌犃犘犇犎 基因的高量表达。同时从各部分杂交结果体现的趋势来看，对于星星草的
叶片和根部，该基因在表达量上存在差异。
对星星草在不同浓度的盐碱胁迫下的犘狋犌犃犘犇犎 基因的表达情况进行研究发现，在Ｎａ２ＣＯ３ 胁迫的致死浓
度范围内，不同浓度的Ｎａ２ＣＯ３ 胁迫对基因的表达并没有太大影响，说明不同程度的胁迫都会引起该基因的表
达，但在表达量上却没有太大的差异。虽然在对关于不同浓度盐碱胁迫处理的 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交试验中不能得到
犘狋犌犃犘犇犎 基因表达量上的线性变化规律，但从Ｎａ２ＣＯ３ 在处理浓度大于１００ｍｍｏｌ／Ｌ后胁迫效应会明显加剧
这一现象中可以推测，不同浓度盐碱胁迫对星星草生理指标的胁迫作用要强于基因表达方面对其的影响。因此
展开星星草不同浓度盐碱胁迫下生理指标的研究是进一步探讨抗逆植物耐盐碱机制的良好途径。
犘狋犌犃犘犇犎 基因在没有盐碱胁迫条件下，无论是叶片还是根部均几乎不表达。叶片在６和２４ｈ盐碱胁迫处
理后表达量达到最大值，其余的处理时间段上该基因都呈现弱的表达状态。而根部在２４ｈ处理后达到高峰，在
４８ｈ处理后表达量呈下降趋势，表明该基因在２４ｈ左右对胁迫的响应最大，而且在植物不同的部位，基因虽一直
持续对胁迫做出响应，但对胁迫的响应程度是有差异的。这可能是由于植株不同组织部位的渗透调节作用不同，
含水量以及无机离子和有机渗透调节物质的积累量也不同，所以叶片和根部在对胁迫的响应上可能存在时间和
空间上的差异。抗逆基因的表达量在盐碱胁迫下的规律性变化可以反应抗逆植株在抵御逆境胁迫过程中基因的
表达规律，为进一步深入地探讨植物耐盐碱机理奠定了理论基础。
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犘狋犌犃犘犇犎犳狉狅犿犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪
ＺＨＡＮＧＹａｎｇ１，ＧＵＯＨａｉｊｕｎ１，ＬＩＵＬｏｎｇｂｉａｏ２，ＷＡＮＧＳａ１，
ＬＩＡＮＧＹｉｎｇ１，ＮＩＥＹｕｚｈｅ１，ＬＩＹｕｈｕａ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｈｉｎａＰｅｔｒｏｌｅｕｍ
ＰｉｐｅｌｉｎｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＴｉａｎｊｉｎＤｅｓｉｇｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００４５７，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｎａｍｅｄ犘狋犌犃犘犇犎ｒｅｌａｔｅｄｔｏｓａｌｉｎｅａｌｋａｌｉｔｏｌｅｒａｎｃｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍ犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪
狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪ｂｙＲＴＰＣＲａｎｄＲＡＣＥ （ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）．犘狋犌犃犘犇犎 ｇｅｎｅｗｉｔｈ１０１４ｂｐｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｅｎｃｏｄｅｄａｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｐｒｅｄｉｃｔｅｄｌｅｎｇｔｈｏｆ３３７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔ
ｔｈｉｓｇｅｎｅ，ｄｅｎｏｔｅｄ犘狋犌犃犘犇犎，ｈａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｏｔｈｅｒｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎ犌犃犘犇犎ｇｅｎｅｓ．
Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｓｈｏｗｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犘狋犌犃犘犇犎 ｈａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ
Ｎａ２ＣＯ３ｉｎｔｈｅｐｒｏｐｅｒｒｅａｌｍ，ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ，ｈａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｏｔｈｉｎｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆ犘狋
犌犃犘犇犎ｇｅｎｅｓｔａｎｄｓｆｏｒｔｈｅｒｅｇｕｌａｒｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｓａｌｉｎｅａｌｋａｌｉｓｔｒｅｓｓｏｎｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪ｏｎ
ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔａｎｄａｒｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪；ｓａｌｉｎｅａｌｋａｌｉｓｔｒｅｓｓ；犘狋犌犃犘犇犎；ＲＡＣＥｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ
４１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２