全 文 ：书柱花草种质遗传多样性的犐犛犛犚分析
唐燕琼１，胡新文１，郭建春２，白昌军３，何华玄３
（１．海南大学农学院，海南 儋州５７１７３７；２．中国热带农业科学院生物技术研究所，海南 海口５７１１０１；
３．中国热带农业科学院品种资源研究所，海南 儋州５７１７３７）
摘要：应用ＩＳＳＲ标记，对４８份柱花草种质的遗传多样性进行研究。从６８个ＩＳＳＲ引物中筛选出１４个多态性明
显、反应稳定的引物，共扩增出１５６条谱带，平均每个引物能扩增出１１．１条带，多态性条带比率达９９．３６％。材料
间遗传相似系数为０．４４５～０．９７５，ＰＯＰＧＥＮＥ结果分析表明，平均Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数（犐）为０．３５５３，平均Ｎｅｉ’ｓ基
因多样性（犎）为０．２２７９，每位点平均有效等位基因数（犖犈）为１．３８８７。利用聚类分析和主成分分析表明，４８份供
试材料可聚为５类：有钩柱花草类、头状柱花草类、圭亚那柱花草类、西卡柱花草类和灌木柱花草类，其中，圭亚那
柱花草类种内材料遗传变异较大。
关键词：柱花草；种质；遗传多样性；ＩＳＳＲ
中图分类号：Ｓ５４０．３２；Ｑ９４３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０１００５７０８
　 柱花草属（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊）有４４个种和亚种，其中心起源地在巴西和哥伦比亚。绝大部分柱花草种分布在南
美洲，极少部分在北美洲、非洲及东南亚和印度［１］。许多柱花草种是优良的热带豆科牧草，具有茎叶产量高、草品
质好、耐旱、耐酸性瘦土的特点，广泛用于青饲料、草粉生产、放牧、水土保持、果园覆盖和绿肥作物等。我国于２０
世纪６０年代初从马来西亚引进柱花草，当时主要作为橡胶种植园的覆盖作物。目前，柱花草已被推广种植到广
东、海南、广西、云南、贵州、福建及四川攀枝花等干热河谷地区［２］。柱花草属内种和亚种的形态学上鉴定非常难，
种的概念及其特性存在多种观点［３，４］，分子标记方法对阐述物种间遗传关系提供了有力的手段。目前，利用随机
扩增多态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）［５，６］、限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇ
ｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＡＦＬＰ）［７，８］、序列标记位点（ｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｇｅｄｓｉｔｅｓ，ＳＴＳ）［９，１０］、微卫星标记（ｍｉｃｒｏｓａｔ
ｅｌｉｔｅ）［１１，１２］、核糖体ＤＮＡ转录间隔区（ｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ｎｒＤＮＡ
ＩＴＳ）［１３，１４］等分子标记技术已用于柱花草的遗传差异研究。
简单重复间序列区间（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，ＩＳＳＲ）ＰＣＲ扩增技术于１９９４年由加拿大蒙特利尔大
学的Ｚｉｅｔｉｋｉｅｗｉｃｚｅ等［１５］提出。由于该技术具备简单、快速、高效、多态性高、重复性好等优点［１６］，已广泛用于植物
遗传连锁图谱的构建［１７］、基因定位［１８］、种质资源鉴定［１９］、植物分类［２０］、进化和遗传多样性分析［２１，２２］等。尽管众
多分子标记方法已在柱花草中得到应用，但ＩＳＳＲ分子标记方法探讨柱花草品种间遗传多样性的研究还未见报
道。本研究运用ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增技术对４８份柱花草种质进行了遗传多样性分析，从分子水平上探讨这些柱花
草种质的遗传多样性，这对柱花草种质资源的鉴定、利用及其育种实践等具有一定的参考价值。
１　材料与方法
１．１　供试材料
参试的４８份柱花草属种质（表１），由中国热带农业科学院作物品种资源研究所提供。
１．２　总ＤＮＡ的提取与浓度测定
２００７年４月采集各种质盆栽柱花草上的嫩叶约０．５ｇ，用改良ＣＴＡＢ法［６］提取柱花草基因组ＤＮＡ，用０．８％
琼脂糖凝胶检测ＤＮＡ质量。用美国ＢＥＣＫＭＡＮＤＵ５３０型核酸／蛋白分析仪检测ＤＮＡ纯度和浓度，并将其稀
释为２０ｎｇ／μＬ的工作液备用。
第１８卷　第１期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
５７－６４
２００９年２月
 收稿日期：２００８０３１０；改回日期：２００８０４０９
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２００７ＣＢ１０８９０３），作物遗传育种国家重点学科和海南省自然科学基金项目资助。
作者简介：唐燕琼（１９６８），女，湖南衡阳人，副教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｔｙｑ６８＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈｕｘｗ３３３＠１６３．ｃｏｍ
表１　４８份柱花草属种质的编号、名称和来源
犜犪犫犾犲１　犖狌犿犫犲狉狊犪狀犱狅狉犻犵犻狀狊狅犳４８犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
序号Ｎｏ． 种名或亚种名Ｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ 来源地Ｏｒｉｇｉｎ
１ 维拉诺有钩犛．犺犪犿犪狋犪ｃｖ．Ｖｅｒａｎｏ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
２ 西卡犛．狊犮犪犫狉犪ｃｖ．Ｓｅｃａ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
３ ＴＰＲＣ９０１３９犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣ９０１３９ 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
４ 澳克雷犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｏｘｌｅｙ① 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
５ ＣＩＡＴ１１３６９犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＣＩＡＴ１１３６９ 国际热带农业中心ＣＩＡＴ
６ 格拉姆犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｇｒａｈａｍ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
７ ＵＳＦ８７３０１５（黄种）犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＵＳＦ８７３０１５（Ｙｅｌｏｗｓｅｅｄ） 美国 Ａｍｅｒｉｃａ
８ ＣＩＡＴ１１３６２犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＣＩＡＴ１１３６２ 国际热带农业中心ＣＩＡＴ
９ 爱德华犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ① 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
１０ 热研５号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．５ 中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
１１ ＵＳＦ８７３０１６（黑种）犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＵＳＦ８７３０１６（Ｂｌａｃｋｓｅｅｄ） 美国 Ａｍｅｒｉｃａ
１２ ＵＳＦ８７３０１５（黑种）犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＵＳＦ８７３０１５（Ｂｌａｃｋｓｅｅｄ） 美国 Ａｍｅｒｉｃａ
１３ ９００８９犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣ９００８９ 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
１４ Ｒ２９１犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣＲ２９１ 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
１５ ＵＳＦ８７３０１６犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＵＳＦ８７３０１６ 美国 Ａｍｅｒｉｃａ
１６ 热研１０号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１０ 海南东方 Ｄｏｎｇｆａｎｇ，Ｈａｉｎａｎ
１７ ＣＯＯＫ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＣＯＯＫ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
１８ ＴＰＲＣ９００２８犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣ９００２８ 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
１９ ＴＰＲＣ９００３７犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣ９００３７③ 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
２０ ＴＰＲＣＲ２７３犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣＲ２７３ 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
２１ 热研７号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．７ 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
２２ 热研１３号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１３ 国际热带农业中心ＣＩＡＴ
２３ Ｔａｒｄｉｏ柱花草犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴａｒｄｉｏＣＩＡＴ１２８３ 国际热带农业中心ＣＩＡＴ
２４ ２５０西卡柱花草犛．狊犮犪犫狉犪ＣＩＡＴ２５０ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
２５ ８７８３０柱花草犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊８７８３０，ＴＰＲＣ２５２ 菲律宾Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ
２６ ＣＩＡＴ１１３６８（Ｌ８）犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＣＩＡＴ１１３６８（Ｌ８） 海南东方 Ｄｏｎｇｆａｎｇ，Ｈａｉｎａｎ
２７ ＴＰＲＣＹ３（Ｅ９）犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣＹ３（Ｅ９） 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
２８ ＴＰＲＣＲ９３犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣＲ９３ 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
２９ ＧＣ１４８０犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＧＣ１４８０ 菲律宾Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ（ＩＲＲＩ）
３０ ＧＣ１４６３犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＧＣ１４６３ 菲律宾Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ（ＩＲＲＩ）
３１ ＧＣ１５７９犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＧＣ１５７９ 巴西ＥＭＢＲＡＰＡ
３２ 热研２号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２ 国际热带农业中心ＣＩＡＴ
３３ Ｍｉｎｅｉｒａｏ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊Ｍｉｎｅｉｒａｏ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
３４ ＧＣ１５８１犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＧＣ１５８１ 菲律宾Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ
３５ 斯柯非犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
３６ 格拉姆犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｇｒａｈａｍ② 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
３７ 爱德华犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ② 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
３８ 澳克雷犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｏｘｌｅｙ② 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
３９ ２３２３柱花草犛．狊犲犪犫狉犪狀犪ＣＩＳＲＯ２３２３ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
４０ ９０７犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．９０７ 广西 Ｇｕａｎｇｘｉ
４１ ＴＰＲＣ２０００７１犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣ２０００７１ 中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
４２ ＴＰＲＣ２００１２４犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣ２００１２４ 中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
４３ ＴＰＲＣ２００１８１犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣ２００１８１ 中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
４４ ＣＰＩ１８７５０Ａ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＣＰＩ１８７５０Ａ 澳大利亚 Ａｕｓｔｒａｌｉａ
４５ ＴＰＲＣ９００３７犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＴＰＲＣ９００３７② 海南三亚Ｓａｎｙａ，Ｈａｉｎａｎ
４６ 灌木犛．狊犲犪犫狉犪狀犪 菲律宾Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ
４７ 头状柱花草犛．犮犪狆犻狋犪狋犪 菲律宾Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ
４８ ＣＡＴＡＳ１０９犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ＣＡＴＡＳ１０９ 中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
　注：表中种后加①②③表示该种具有不同变异的品种或种质。
　Ｎｏｔｅ：① ②ｏｒ③ａｆｔｅｒｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｍｅａｎｔｈｅｓａｍｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｒｉａｔｉｏｎ；ＣＩＡＴ：ＣｅｎｔｒｏＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｄｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＴｒｏｐｉｃａｌ；ＣＡ
ＴＡＳ：ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ．
８５ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
１．３　ＩＳＳＲ反应体系的建立及优化
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反应条件经正交优化试验确定为２０μＬ体系
［２３］，各反应成分用量分别为：１０×ＰＣＲ缓冲液
［１００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ、８０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ值９．０］２．０μＬ、１．６μＬ的２５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２、２．０μＬ的２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、４．０μＬ的２．０μｍｏｌ／Ｌ引物、３．０μＬ的２０ｎｇ／μＬ模板ＤＮＡ、０．２μＬ的Ｔａｑ
酶（５Ｕ）、７．２μＬ的ｄｄＨ２Ｏ。ＩＳＳＲ引物由上海生物工程技术服务有限公司（简称上海生工）合成，ＴａｑＤＮＡ聚合
酶和ｄＮＴＰ均购自华美生物工程公司。ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ、５１℃退火４５
ｓ、７２℃延伸１．５ｍｉｎ，循环４５次，７２℃终延伸７ｍｉｎ，４℃下保存。
１．４　ＩＳＳＲ引物的筛选
利用加拿大哥伦比亚大学（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａ，ＵＢＣ）提供的６８个公用ＩＳＳＲ引物，根据上海生
工合成引物的熔解温度（ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，犜犿）值，用热研２号柱花草、斯柯非柱花草和澳克雷②柱花草３份
材料的ＤＮＡ为模板，进行梯度ＰＣＲ扩增，筛选的引物遵守如下原则：１）产生的ＤＮＡ带清晰可辨；２）在分析的样
品之间有较高的多态性；３）产生多态性ＤＮＡ谱带具有重复性。筛选出多态性高的引物及其最适退火温度，再对
全部材料进行ＰＣＲ扩增。
１．５　ＰＣＲ扩增及电泳
ＰＣＲ扩增在ＢｉｏｍｅｔｒａＴＧＲＡＤｉｅｎｔ型ＰＣＲ仪上进行。ＰＣＲ反应结束后向扩增产物中加入４μＬ上样缓冲
液，在１×ＴＢＥ缓冲系统中，用含有０．５ｇ／Ｌ溴化乙锭（ＥＢ）的１．８％琼脂糖凝胶电泳（５Ｖ／ｃｍ），电泳２ｈ后，用法
国ＶＬ（Ｖｉｌｂｅｒｌｏｕｒｍａｔ）凝胶电泳成像系统对凝胶检测并照相、保存。
１．６　数据处理
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增产物以０或１统计建立二元数据矩阵，在相同迁移位置，有扩增带记为１，无带记为０。采
用ＰＯＰＧＥＮＥ１．３２软件，计算ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增产物的多态位点数、多态位点比例、Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数（犐）、Ｎｅｉ’ｓ
基因多样性（犎）、每位点有效等位基因数（犖犈）。用ＮＴＳＹＳｐｃ２．０２ｃ软件计算材料间遗传相似系数（犌犛），非加
权成组配对算术平均法（ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析和主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）。
２　结果与分析
２．１　ＩＳＳＲ标记多态性分析
从６８条ＩＳＳＲ引物中共筛选出１４条多态性好、条带清晰的引物，对４８份柱花草种质扩增的结果见表２。１４
条引物共扩增出１５６条带，平均每条引物扩增出１１．１条带，最多的能得到２１条清晰带（ＩＳＳＲ５７），最少有７条
（ＩＳＳＲ２８，ＩＳＳＲ３６和ＩＳＳＲ５２）。在１５６条带中，有１５５条重复性好、清晰的多态带，多态性条带比率为９９．３６％。
ＰＯＰＧＥＮＥ分析结果表明，平均Ｓｈａｎｎｏｎ信息指数（犐）为０．３５５３，平均Ｎｅｉ’ｓ基因多样性（犎）为０．２２７９，每位点
平均有效等位基因数（犖犈）为１．３８８７。柱花草的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增片段大约集中在３００～２５００ｂｐ（图１），也有
一些少数特异位点在此范围以外。
２．２　柱花草的ＩＳＳＲ聚类分析
用ＮＴＳＹＳｐｃ软件算出４８份柱花草种质间的遗传相似系数（犌犛）值变化范围为０．４４５～０．９７５，平均为
０．７８１。其中犌犛值最大（０．９７５）的分别为来自海南三亚的１９号与２０号、来自海南东方的１６号与来自美国的１５
号，说明它们之间的亲缘关系最近。来自海南三亚的ＴＰＲＣ９０１３９柱花草（３号）与来自澳大利亚的２５０西卡柱花
草（２４号）的相似系数最低（０．４４５），说明其亲缘关系最远。
基于遗传相似系数，按ＵＰＧＭＡ法作聚类分析，获得了聚类树系（图２）。由聚类图可把４８份柱花草种质聚
为５类（等值线 Ｍ处，犌犛＝０．７２），其中１号有钩柱花草（犛．犺犿犪犿犪狋犪）（第Ｉ类）和４７号头状柱花草（犛．犮犪狆犻狋犪
狋犪）（第ＩＶ类）分别单独聚为一类，２号和２４号属西卡柱花草类（犛．狊犮犪犫狉犪）（第ＩＩ类），３９号和４６号属灌木柱花草
类（犛．狊犲犪犫狉犪狀犪）（第ＩＩＩ类），其他４２份属圭亚那柱花草类（犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊）（第Ｖ类）。这５类亲缘关系由近到远
的顺序为，第ＩＩＩ类灌木柱花草类与第ＩＩ类西卡柱花草类遗传距离最近（１－犌犛＝０．３０），均为半灌木型植物，与第
Ｉ类有钩柱花草类较近（１－犌犛＝０．３７），其次是第ＩＶ类头状柱花草类（１－犌犛＝０．３９），与第Ｖ类圭亚那柱花草类
遗传距离最远（１－犌犛＝０．４４）。同时，也可大致把４８份柱花草种质聚为２类 （犌犛＝０．６１），即圭亚那种为一类，
有钩种、西卡种、头状种和灌木种组成的非圭亚那种为另一类。
９５第１８卷第１期 草业学报２００９年
表２　１４条犐犛犛犚引物序列、退火温度和扩增结果
犜犪犫犾犲２　犛犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳１４犐犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊，犪狀狀犲犪犾犻狀犵狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊犪狀犱犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列（５′－３′）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
总扩增带数
Ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｓｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ
多态性条带
Ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ（％）
ＩＳＳＲ１ （ＡＧ）８Ｔ ５２．３ １２ １２ １００
ＩＳＳＲ３ （ＣＴ）８Ｇ ５１．０ １３ １３ １００
ＩＳＳＲ４ （ＧＡ）８Ｔ ５２．３ １１ １１ １００
ＩＳＳＲ５ （ＧＡ）８Ｃ ５４．９ ８ ８ １００
ＩＳＳＲ１２ （ＴＣ）８Ａ ５２．３ １２ １２ １００
ＩＳＳＲ１７ （ＡＣ）８Ｇ ５１．５ １２ １２ １００
ＩＳＳＲ２３ （ＡＧ）８ＹＡ ５４．３ １０ １０ １００
ＩＳＳＲ２８ （ＣＴ）８ＲＣ ５４．０ ７ ７ １００
ＩＳＳＲ３６ （ＴＣ）８ＲＡ ５３．３ ７ ７ １００
ＩＳＳＲ３７ （ＴＣ）８ＲＴ ５２．３ １３ １２ ９２．３
ＩＳＳＲ５１ （ＧＡＴＡ）４ ４０．５ １３ １３ １００
ＩＳＳＲ５２ （ＧＡＣＡ）４ ５３．５ ７ ７ １００
ＩＳＳＲ５４ （ＧＡＴＡ）２（ＧＡＣＡ）２ ５２．０ １０ １０ １００
ＩＳＳＲ５７ （ＧＧＡＧＡ）３ ５１．１ ２１ ２１ １００
图１　引物犐犛犛犚５１对４８份柱花草材料的犘犆犚扩增结果
犉犻犵．１　犚犲狊狌犾狋狅犳犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犫狔犐犛犛犚５１狆狉犻犿犲狉犻狀４８犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊
对第Ｖ类圭亚那种的４２份柱花草材料进行分析，１４条引物共扩增出１２２条带，有１１５条为清晰的多态带，
多态性条带比率为９４．２６％。圭亚那柱花草种内的遗传相似系数范围为０．７６～０．９７，说明圭亚那柱花草种内有
较大的遗传分化。从图中Ｌ线（犌犛＝０．８２）处可将圭亚那种柱花草分为４组：其中２７号柱花草为一组（Ａ）；２１
号、３８号、４８号柱花草为一组（Ｂ），这３份柱花草都具有结实率低的特征，按低育种质保存；３３号、３４号柱花草归
为一组（Ｃ），这２个品种均有晚花、抗病性强、枝条分泌粘性物质的特点。其他３８份材料构成最大的一组（Ｄ），
犌犛为０．８２～０．９７，亲缘关系较近，多数材料与ＣＩＡＴ１８４柱花草（商品种）有关。其中的９０７柱花草是ＣＩＡＴ１８４
诱变获得的抗病品种［２４］，热研２号、热研５号［２５］柱花草品种均选育于ＣＩＡＴ１８４，ＴＰＲＣ２０００７１、ＴＰＲＣ２００１２４和
ＴＰＲＣ２００１８１，均由热研２号太空诱变筛选的优良种质。
从１４个ＩＳＳＲ引物中挑取７个引物（ＩＳＳＲ１，ＩＳＳＲ３，ＩＳＳＲ１２，ＩＳＳＲ１７，ＩＳＳＲ３７，ＩＳＳＲ５１和ＩＳＳＲ５７），也可将４８
份供试柱花草材料区分开，其ＵＰＧＭＡ聚类图如图３所示，４８份供试材料可聚为５类：有钩柱花草类、头状柱花
草类、圭亚那柱花草类、西卡柱花草类和灌木柱花草类，其中，圭亚那柱花草类种内材料遗传变异较大（聚类结果
与图２相似）。这７个ＩＳＳＲ引物共扩增出９４条多态性带，平均每个引物扩增的多态带数为１３．４条，多态性比率
为９９％，其聚类结果与１４个引物的基本一致。
０６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
图２　基于１４个犐犛犛犚引物４８份柱花草种质的犝犘犌犕犃聚类
犉犻犵．２　犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳４８犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊犫犪狊犲犱１４犐犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊
图３　基于７个犐犛犛犚引物的４８份柱花草种质犝犘犌犕犃聚类
犉犻犵．３　犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳４８犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊犫犪狊犲犱７犐犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊
１６第１８卷第１期 草业学报２００９年
２．３　柱花草主成分分析
通过ＮＴＳＹＳｐｃ２．０２ｃ软件，对１４个引物对４８份柱花草种质的ＩＳＳＲ标记原始矩阵进行主成分分析，前２个
主成分所能解释的遗传变异分别为２８．５３％和１０．３１％，并根据第１、第２主成分作出４８种材料的位置分布图（图
４），位置相靠近者表示关系密切，远离者表示关系疏远。结果表明主成分分析结果与聚类分析结果基本一致。
图４　基因犐犛犛犚谱型的４８份柱花草种质主成分分析
犉犻犵．４　犘狉犻狀犮犻狆犪犾犮狅犿狆狅狀犲狀狋犪狀犪犾狔狊犻狊犫犪狊犲犱５１犐犛犛犚狆犪狋狋犲狉狀狊犻狀４８犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊
３　讨论
一般认为，ＡＦＬＰ相对于其他标记，具有极高的多态性检测效率。Ｊｉａｎｇ等［８］和蒋昌顺［１２］用ＳＳＲ、ＡＦＬＰ技术
对４２份感病与抗病的柱花草遗传多样性分析表明，其平均多态性水平分别为８４．５％和９５．５％，犌犛分别为０．２６
～０．９４和０．３１～０．９５。本试验首次用ＩＳＳＲ分子标记对柱花草种质进行遗传多样性分析，结果表明，利用１４个
ＩＳＳＲ引物能够将４８份供试材料分开，平均每条引物能产生１１．１条带，多态性条带比率高达９９．４％，相似系数
为０．４４～０．９７，平均犌犛值为０．７８。从而在分子水平上证实了不同柱花草之间差异较大，遗传多样性较丰富。并
利用ＵＰＧＭＡ法作聚类分析和主成分分析表明，供试材料可聚为圭亚那柱花草类、有钩柱花草类、西卡柱花草
类、灌木柱花草类和头状柱花草类５类柱花草种，其中圭亚那类的４２份种质均能区分开。说明ＩＳＳＲ是一种重
复性好、效率高的分子标记，可用于柱花草种质遗传多样性研究。
ＩＳＳＲ标记的遗传多态性很高，而且引物具有通用性，可在多种植物中通用［２６，２７］，提高了其利用率，故在遗传
关系研究方面有更广阔的应用背景。Ｐｒｅｖｏｓｔ和 Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ［２８］仅用４个ＩＳＳＲ引物就将３０多个马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿
狋狌犫犲狉狅狊狌犿）品种区分开，Ｃｈａｒｔｅｒｓ等［２９］用了２个ＩＳＳＲ引物获得５６个多态带，将使用的１２个品种区分开，邓春婷
和包满珠［３０］用７个ＩＳＳＲ引物将２０份野牛草（犅ü犮犺犾狅犲犱犪犮狋狔犾狅犻犱犲）单株区分开，Ｈｕａｎｇ和Ｓｕｎ［３１］用１５个ＩＳＳＲ
引物对４０个番薯（犐狆狅犿狅犲犪犫犪狋犪狋犪狊）植物扩增出２０７１个片段。本研究从１４个ＩＳＳＲ引物中挑取７个引物，能将
４８份供试柱花草材料区分开，也揭示了ＩＳＳＲ标记的多态性和高效性。
ＩＳＳＲ标记为显性标记，符合孟德尔遗传规律，它结合ＲＡＰＤ标记技术和ＳＳＲ标记技术的优点。然而，主要
２６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
不足之处在于ＰＣＲ扩增反应的最适条件需要一定时间摸索［３２］。本研究用ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增技术对柱花草种质
的遗传多样性分析，从分子水平上探讨和验证柱花草种质的分类，明确其间的遗传距离，有利于柱花草种质资源
的利用、遗传学研究及育种实践。也为有效鉴别柱花草品种，保护产权提供了较好的手段。柱花草资源丰富，种
质繁多，将综合农艺性状优良的种质杂交进行选育，有利于改良我国的柱花草品质。利用基于ＩＳＳＲ－ＰＣＲ技术
的聚类分析将不同组间遗传相似性较小的柱花草种质作为杂交亲本，有利于在育成种质中体现杂种优势。
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狋犪ａｒｅｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｏｆａｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犺犪犿犪狋犪ｃｖ‘Ｖｅｒａｎｏ’［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，１９９５，３８：３４４３４８．
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狊犲犪犫狉犪狀犪，ａｎｄ犛．犳狉狌狋犻犮狅狊犪ｂｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｗｏｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｒｅｇｉｏｎｓ［Ｊ］．ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ，１９９９，（３）：１９９２０２．
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［３２］　隋晓青，王．克氏针茅ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（３）：７１７８．
犃狀犪狀犪犾狔狊犻狊犫狔犐犛犛犚狅犳犵犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋犻犲狊犻狀犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊
ＴＡＮＧＹａｎｑｉｏｎｇ１，ＨＵＸｉｎｗｅｎ１，ＧＵＯＪｉａｎｃｈｕｎ２，ＢＡＩＣｈａｎｇｊｕｎ３，ＨＥＨｕａｘｕａｎ３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｎｚｈｏｕ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｈａｉｋｏｕ５７１１０１，Ｃｈｉｎａ；３．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓＧｅｎｅｔｉｃ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＣＡＴＡＳ，Ｄａｎｚｈｏｕ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｆｏｒｔｙｅｉｇｈｔ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｆｏｒａｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｂｙＩＳＳＲ．Ｆｏｕｒ
ｔｅｅｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｐｒｉｍｅｒｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ６８ＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒＰＣＲ，ａｎｄ１５５ｏｆｔｈｅ１５６ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｓｈｏｗｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｂｉｎｄｓｆｒｏｍｅａｃｈｐｒｉｍｅｒｗａｓ１１．１ａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｗａｓ９９．３６％．Ｔｈｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｇｅｎｅｔｉｃｃｏｎｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙａｍｏｎｇｔｈｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｗａｓ０．４４５－
０．９７５．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍＰＯＰＧＥＮＥａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅａｖｅｒａｇｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ（犐）ｏｆＳｈａｎｎｏｎｗａｓ
０．３５５３，ｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（犎）ｏｆＮｅｉｗａｓ０．２２７９，ａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｌｅｌｅｓ（犖犈）ｗａｓ１．３８８７．Ｂａｓｅｄｏｎ
ａｎａｌｙｓｅｓｏｆｃｌｕｓｔｅｒａｎｄｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｔｈｅ４８犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄ
ｅｄｉｎｔｏ５ｇｒｏｕｐｓ：犛．犺犪犿犪狋犪，犛．犮犪狆犻狋犪狋犪，犛．狊犮犪犫狉犪，犛．狊犲犪犫狉犪狀犪ａｎｄ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊，ｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｇｒｏｕｐｗａｓｔｈｅｌａｒｇｅｓｔ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊；ｇｅｒｍｐｌａｓｍ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＩＳＳＲ
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