全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（４）：６１０ ６１４
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０４０６１００５
白蜡虫蜡酯合酶基因 ｃＤＮＡ全长克隆及原核表达
刘博文，王雪庆，孙 涛，亓 倩，于淑惠，杨 璞，陈晓鸣
（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 ６５０２２４）
收稿日期：２０１６０２１５
基金项目：国家 ８６３计划（２０１４ＡＡ０２１８０１）；林业公益性行业科研专项（２０１５０４３０２、２０１３０４８０８）；云南省应用基础研究重点项目
（２０１３ＦＡ０５２）；国家自然科学基金（３１５７２３３７）
作者简介：刘博文（１９９０—），男，硕士研究生，主要从事分子生物学、资源昆虫研究．
通讯作者．
关键词：白蜡虫；蜡酯合酶；ｃＤＮＡ全长基因；原核表达
中图分类号：Ｓ８９９．１ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＷａｘＳｙｎｔｈａｓｅＧｅｎｅｏｆ
ｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＷｈｉｔｅＷａｘＳｃａｌｅ
ＬＩＵＢｏｗｅｎ，ＷＡＮＧＸｕｅｑｉｎｇ，ＳＵＮＴａｏ，ＱＩＱｉａｎ，ＹＵＳｈｕｈｕｉ，ＹＡＮＧＰｕ，ＣＨＥＮＸｉａｏｍｉｎｇ
（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｅｃｔｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＫｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｕｌｔｉｖａｔｉｎｇａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓ
ＩｎｓｅｃｔｓｏｆＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｗａｘｓｙｎｔｈａｓｅ（ｗｓ）ｇｅｎｅｏｆｔｈｅｗｈｉｔｅｗａｘｉｎ
ｓｅｃｔ，ＥｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａＣｈａｖａｎｎｅｓ，ａｎｄｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｅｎｚｙｍｅｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｔｈｅ３′ａｎｄ５′
ｅｎｄｓｏｆｔｈｅｗｓｇｅｎｅｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｅｐａｒａｔｅｌｙｂｙｕｓｉｎｇＲＡＣＥ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ａｆｔｅｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｗｓｇｅｎｅ．Ｆｉｎａｌｙ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＷＳｉｎＥｒｉｃｅｒｕｓｃｏｌｉ
ＢＬ２１ｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆｔｈｅｗｓｇｅｎｅｗａｓ
１５１８ｂｐ，ｗｈｉｃｈｉｎｃｌｕｄｅｄｔｈｅ５′ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ）ｗｉｔｈ９４ｂｐ，３′ＵＴＲｗｉｔｈ６８ｂｐ，ａｎｄｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅｗｉｔｈ１３５６ｂｐ．Ｔｈｅｇｅｎｅｗａｓｄｅｄｕｃｅｄｔｏｅｎｃｏｄｅ４５２ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓｗｉｔｈｔｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔｏｆ５１．８ｋＤａ，ａｎｄｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｏｆ６．３５．ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，ｔｈｅＷＳｅｎｚｙｍｅ
ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｉｎＥｒｉｃｅｒｕｓｃｏｌｉ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆｔｈｅｗｓｇｅｎｅｏｆ
Ｅｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄｔｈｉｓｅｎｚｙｍｅｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥｒｉｃｅｒｕｓｃｏｌｉ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
ｆｏｒｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｗａｘｅｓｔｅｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｏｔｈｅｒｉｎｓｅｃｔｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ；ｗａｘｓｙｎｔｈａｓｅ；ｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
白蜡虫（Ｅｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ）是我国特有的资源昆虫，
泌蜡是白蜡虫二龄雄虫最为特化的性状［１］。白蜡虫
分泌的白蜡在食品、医药、纺织等行业具有重要的经
济价值［２］。白蜡的主要成分是２６酸２６酯［３］，已有
研究表明，蜡酯的生物合成在动植物中存在保守途
径［４］。蜡酯生物合成的第一步由脂酰辅酶 Ａ还原
酶催化脂酰辅酶Ａ转化为脂肪醇，第二步由蜡酯合
酶（ＷＳ）催化脂肪醇和脂肪酸的酯化反应［５］。ＷＳ
是催化蜡酯合成过程最后一步的关键酶，是研究生
物蜡酯合成的关键。
前期研究通过转录组测序及实时定量 ＰＣＲ分
析，鉴定到了白蜡虫泌蜡的关键酶基因 ｗｓ，但从转
录组中获得的序列只有编码区的一部分，无法进行
进一步的基因功能研究［６］。为了解白蜡虫 ｗｓ基因
的序列特征，并开展基因功能、表达定位等研究，本
研究采用ＲＡＣＥ的方法扩增白蜡虫ｗｓ基因的ｃＤＮＡ
第４期 刘博文，等：白蜡虫蜡酯合酶基因ｃＤＮＡ全长克隆及原核表达
全长，并在大肠杆菌中进行表达，为白蜡虫 ＷＳ抗体
制备以及功能研究奠定基础。
１ 试验材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 供试昆虫 ２０１３年４月至６月份期间，从资
源昆虫研究所人工大棚的女贞树上采集白蜡虫雄虫
幼虫。
１．１．２ 试验试剂 ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｋｉｔ试剂盒购自美国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉＪＭ１０９感受态细胞、ＤＬ２０００及 ＤＬ１００００ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ购自大连宝生物工程有限公司。ｐＧＥＭＴ
ＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司。ＢａｍＨＩ、
ＨｉｎｄＩＩ限制酶购自美国ＮＥＢ公司。ｐＥＴ２２ｂ表达载
体、ＢＬ２１表达菌株购自美国Ｎｏｖａｇｅｎ公司。Ｔｒｉｚｏｌ试
剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ
购自北京天根生化科技有限公司。ＤＮＡ胶回收试剂
盒、小量质粒抽提试剂盒购自杭州Ａｘｙｇｅｎ公司。Ｐａｇｅ
ＲｕｌｅｒｐｌｕｓＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ蛋白Ｍａｒｋｅｒ购自
美国 Ｔｈｅｒｍｏ公司。溶菌酶、脱氧胆酸、ＰＭＳＦ、ＤＥＰＣ
购自上海生工生物工程有限公司。ＩｍｍｕｎｏＢｌｏｔ
ＰＶＤＦ膜、ＣｌａｒｉｔｙＷｅｓｔｅｒｎＥＣＬ购自美国 ＢｉｏＲａｄ公
司。ＭｏｕｓｅＨｉｓｔａｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰｇｏａｔａｎｔｉ
ｍｏｕｓｅＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ购自英国Ａｂｃａｍ公司。
大肠杆菌细胞裂解缓冲液 Ｉ配方、１０％ＳＤＳ
ＰＡＧＥ分离胶及浓缩胶配方、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ转膜缓冲液
配方、ＰＢＳ、ＰＢＳＴ缓冲液配方见《分子克隆指南》［７］。
１．１．３ 试验仪器 ＰＣＲ仪：Ｃ１０００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ
（美国ＢｉｏＲａｄ公司）；小型垂直电泳槽：ＭｉｎｉＰｒｏｔｅｉｎ
ＴｅｔｒａＳｙｓｔｅｍ（美国 ＢｉｏＲａｄ公司）；半干转膜仪：
ＴｒａｎｓＢｌｏｔＴｕｒｂｏＴｒａｎｓｆｅｒＳｙｓｔｅｍ（美国 ＢｉｏＲａｄ公
司）；化学发光成像系统：ＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ（美国 Ｂｉｏ
Ｒａｄ公司）。
１．２ 试验方法
１．２．１ ＲＮＡ提取 将收集的２龄雄虫用 ＤＥＰＣ处
理过的灭菌ｄｄＨ２Ｏ漂洗３次，Ｔｒｉｚｏｌ匀浆，ＲＮＡ提取
方法按照Ｔｒｉｚｏｌ试剂说明书操作。
１．２．２ ３’ＲＡＣＥ 按照 ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ试剂盒说明书操作，合成用于３’ＲＡＣＥ
的模板，３’ＲＡＣＥ上游特异性引物 ３’ＲＡＣＥＰｒｉｍｅｒ
Ｆ１（５’ＡＣＴＴＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＡＴＣＣＴＣ３’），下游引物
为试剂盒中提供的通用引物。ＰＣＲ体系：上下游引
物各０．２μＬ（２０μｍｏｌ·Ｌ－１），模板０．１μＬ，２×Ｔａｑ
ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ５μＬ，用 ｄｄＨ２Ｏ补至 １０μＬ。ＰＣＲ
反应条件为：９４℃４ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５０℃１ｍｉｎ，７２℃９０
ｓ，３０个循环；７２℃延伸 １０ｍｉｎ。ＰＣＲ反应产物在
１％琼脂糖凝胶电泳下进行。在紫外灯下拍照，并切
下目的条带，按照 ＤＮＡ胶回收试剂盒回收目的片
段。按照ｐＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ试剂盒操作，用Ｔ４连
接酶将回收的目的片段与 ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体４℃过
夜连接，连接产物转化 ＪＭ１０９感受态细胞。经菌液
ＰＣＲ检测筛选重组克隆测序。
１．２．３ ５’ＲＡＣＥ 利用 ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５设计 ５’
ＲＡＣＥ特异性引物 ５’ＲＡＣＥＰｒｉｍｅｒＲ１（５’ＣＴ
ＴＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＡＴＣＣＴＣＡ３’）。按照试剂盒说明书
操作合成５’ＲＡＣＥ的模板，ＰＣＲ、克隆同３’ＲＡＣＥ。
１．２．４ 序列分析 通过 ＤＮＡＭＡＮ软件拼接３’和
５’ＲＡＣＥ测序结果，获得白蜡虫ｗｓ基因ｃＤＮＡ全长。
利用ＣｌｕｓｔａｌＸ２．０进行多序列联配，并用 ＭＥＧＡ５．１
制作进化树。在线软件 ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘ
ｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）预测蛋白相对分子质量及等电
点［８］，ＴＭＨＭＭ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭ
ＨＭＭ）预测跨膜序列［９］，ＳｉｇｎａｌＰ４．１（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．
ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）预测信号肽［１０］。
１．２．５ 原核表达载体构建 针对基因编码框设计
引物扩增ｗｓ基因编码框序列，克隆方法同上，重组
质粒命名为ｐＧＥＭ／ＥｐｅｌＷＳ。在基因跨膜结构、信号
肽、疏水性分析的基础上，针对编码区的部分序列，
设计带有 ＢａｍＨＩ和 ＨｉｎｄＩＩ酶切位点的引物，上游
引物 ＢａｍＨＩＦ（５’ＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＧＣＴＴＧＧＡ
ＣＡＴ３’），下 游 引 物 ＨｉｎｄＩＩＲ（５’ＴＣＴＴＴＡＣＡ
ＣＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＧＴＧＧＣＡＴ３’）。以 ｐＧＥＭ／ＥｐｅｌＷＳ
重组质粒为模板，进行 ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应条件同
上，切胶纯化。ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ３７℃过夜双酶切回
收的ＰＣＲ产物及 ｐＥＴ２２ｂ载体。酶切产物电泳检
测后分别切胶纯化，Ｔ４连接酶４℃过夜连接双酶切
的目的片段和表达载体。连接产物转化大肠杆菌
ＤＨ５α，挑选单菌落，３７℃，１６０ｒ·ｍｉｎ－１过夜培养。
采用Ｔ７引物进行菌液 ＰＣＲ检测，挑选阳性重组克
隆测序。重组质粒命名为ｐＥＴ２２ｂ／ＥｐｅｌＷＳ。
１．２．６ ＩＰＴＧ诱导原核表达 抽提 ｐＥＴ２２ｂ／Ｅｐｅｌ
ＷＳ重组质粒，转化大肠杆菌 ＢＬ２１，挑取阳性克隆，
接种于氨苄抗性的（１００μｇ·ｍＬ－１）ＬＢ液体培养基
中，３７℃、１６０ｒ·ｍｉｎ－１摇床扩繁至 ＯＤ６００≈０．６。在
每１ｍＬ菌液中加入 ＩＰＴＧ至终浓度为１．０ｍｍｏｌ·
Ｌ－１，２８℃、１００ｒ·ｍｉｎ－１摇床中诱导５ｈ。
１１６
林 业 科 学 研 究 第２９卷
１．２．７ 蛋白提取及 ＳＤＳＰＡＧＥ ＩＰＴＧ诱导后的菌
液４０００×ｇ离心５ｍｉｎ，弃上清，加入１５０μＬ大肠杆
菌细胞裂解缓冲液Ｉ重悬沉淀，加入２００μＬ溶菌酶
（１０ｍｇ·ｍＬ－１）和０．２５μＬＰＭＳＦ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１），
反复吸打，冰浴２０ｍｉｎ。加入０．２５ｍｇ脱氧胆酸，室
温下放置３０ｍｉｎ且不时震荡以充分裂解细胞，直至
溶液不再粘稠，测定总蛋白质浓度。抽提的总蛋白
与５×ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｅｒ沸水浴５ｍｉｎ变性，取２０μｇ样
品进行 ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳。考马斯亮蓝染色过
夜，脱色，拍照记录结果。
１．２．８ ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ １０％ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分离样
品后，在转膜缓冲液中浸泡凝胶、同胶大小的 ＰＶＤＦ
膜３０ｍｉｎ，浸透滤纸。从下到上以１０层滤纸、ＰＶＤＦ
膜、凝胶、１０层滤纸的顺序放置在半干转膜仪中，恒
压２５Ｖ转膜 ６０ｍｉｎ。ＰＶＤＦ膜用 ＰＢＳ缓冲液漂洗
后，在封闭液（含５％ＢＳＡ的 ＰＢＳＴ缓冲液）中３７℃
封闭１ｈ，后加入 ＭｏｕｓｅＨｉｓｔａｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ
（１∶４００）４℃过夜孵育。用ＰＢＳ溶液漂洗ＰＶＤＦ膜３
次，再 加 入 ＨＲＰ ｇｏａｔａｎｔｉｍｏｕｓｅＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ
（１∶５００），在 ＰＢＳ溶液中室温放置２ｈ。ＰＢＳ溶液漂
洗ＰＶＤＦ膜后与ＣｌａｒｉｔｙＷｅｓｔｅｒｎＥＣＬ显色，在化学发
光成像系统中检测。
２ 结果与分析
２．１ 白蜡虫ｗｓ基因３’及５’ＲＡＣＥ结果
电泳检测３’ＲＡＣＥ产物表明：扩增片段大小在
１０００ｂｐ左右（图１Ａ）。测序结果去除载体后片段
大小为１００１ｂｐ，序列联配表明该片段与已知序列
重叠部分序列完全一致。电泳检测５’ＲＡＣＥ产物表
明：扩增片段大小在６００ｂｐ左右（图１Ｂ）。测序结
果去除载体后片段大小为５２１ｂｐ，序列联配表明该
片段与已知序列重叠部分序列完全一致。
Ａ：泳道１为５’ＲＡＣＥＰＣＲ产物；Ｂ：泳道１为
３’ＲＡＣＥＰＣＲ产物；Ｍ为ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ
图１ ３’及５’ＲＡＣＥＰＣＲ产物凝胶电泳图
２．２ 序列分析
白蜡虫ｗｓ基因ｃＤＮＡ全长１５１８ｂｐ，含有５’端
非编码区９４ｂｐ和３’端非编码区６８ｂｐ，ＯＲＦ长度为
１３５６ｂｐ，编码４５２个氨基酸，预测的蛋白质分子量
为５１．８ｋＤａ，等电点为６．３５，具有亲水性。ＳｉｇｎａｌＰ
分析白蜡虫ＷＳ在Ｎ端具有１个分泌型信号肽；ＴＭ
ＨＭＭ推测蛋白中存在一个跨膜区域。
白蜡虫 ＷＳ与其他物种 ＷＳ构建的进化树见
图２。
各物种ＷＳ氨基酸序列在ＮＣＢＩ的登录号如下：拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）ＨｅｙｎｈＷＳ：ＮＰ２００３４５．１；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉ
ａｎａ（Ｌ．）ＨｅｙｎｈＷＳＤ：ＮＰ５６８５４７．１）；西门得木（ＳｉｍｍｏｎｄｓｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬｉｎｋＷＳ：ＡＦ１４９９１９）；细小裸藻（Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ
ＷＳ：ＡＤＩ６００５８．１）；灰鹅（ＡｎｓｅｒａｎｓｅｒｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓＬ．ＷＳ４：ＪＱ０３１６４３；ＡｎｓｅｒａｎｓｅｒｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓＬ．ＷＳ５：ＪＱ０３１６４７）；家鸡（Ｇａｌｕｓ
ｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓＬ．ＷＳ４：ＸＰ４１９２０７．１；ＧａｌｕｓｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓＬ．ＷＳ１：ＸＰ４２４０８２．２）；仓（ＴｙｔｏａｌｂａＳｃｏｐｏｌｉＷＳ４：
ＪＱ０３１６４５）；人类（ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＬ．ＡＷＡＴ１：ＮＰ００１０１３５９７．１；ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＬ．ＡＷＡＴ２：ＮＰ００１００２２５４．１；ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＬ．
ＷＳ：ＡＹ６０５０５３）；小鼠（ＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓＬ．ＷＳ：ＡＹ６１１０３１．１）；四膜虫（ＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａＷＳ：ＸＰ００１０２７９１０）；不动杆
菌（ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋＷＳ：ＹＰ０４５５５５．１）；碧冬茄（Ｐｅｔｕｎｉａ×ｈｙｂｒｉｄａｈｏｒｔ．ｅｘＶｉｌｍ．ＷＳ：ＡＡＺ０８０５１．１）。
图２ 白蜡虫ＷＳ与不同物种ＷＳ氨基酸序列构建的系统进化树
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第４期 刘博文，等：白蜡虫蜡酯合酶基因ｃＤＮＡ全长克隆及原核表达
２．３ ｐＥＴ２２ｂ／ＥｐＷＳ载体构建
电泳检测 ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ双酶切产物结果显
示：空质粒在５０００ｂｐ左右，针对编码区部分序列设
计含有限制酶引物扩增出的目的基因为８１３ｂｐ左
右，检测结果与预期相符（图３Ａ）。以 Ｔ７／Ｔ７Ｔｅｒ为
两端引物的菌液ＰＣＲ电泳检测见图３Ｂ。挑选阳性
克隆，抽提重组质粒电泳检测（图３Ｃ）。
Ａ：泳道１为双酶切后的目的基因；泳道２为双酶切后的ｐＥＴ２２ｂ空载体；Ｂ：泳道１为菌液ＰＣＲ扩增的目的条带；Ｃ：泳道１为成功构建的重
组质粒ｐＥＴ２２ｂ／ＥｐｅｌＷＳ；Ｍ１：ＤＬ１００００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ
图３ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ双酶切ｐＥＴ２２ｂ质粒及目的基因、菌液ＰＣＲ及ｐＥＴ２２ｂ／ＥｐｅｌＷＳ重组表达载体电泳检测
２．４ 原核表达及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测
ＳＤＳＰＡＧＥ电泳检测结果见图 ４Ａ。Ｗｅｓｔｅｒｎ
Ｂｌｏｔ检测表明：在３５ｋＤａ与５５ｋＤＡ有目的蛋白表
达。ＩＰＴＧ诱导的大肠杆菌 ＢＬ２１中 ＷＳ有显著的特
异性表达（图４Ｂ）。
Ａ：泳道１为未经ＩＰＴＧ诱导的空白对照；泳道２为经ＩＰＴＧ诱导的处理对照；Ｍ１：ＰｒｏｔｅｉｎＲｕｌｅｒＩ；Ｂ：泳道１为未经ＩＰＴＧ诱导的空白对照；泳道
２为经ＩＰＴＧ诱导的处理对照；Ｍ２：ＰａｇｅＲｕｌｅｒｐｌｕｓＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ
图４ 不同ＩＰＴＧ终浓度诱导大肠杆菌ＢＬ２１表达目的蛋白的ＳＤＳＰＡＧＥ电泳图片及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测结果
３ 讨论
现有研究表明，根据已有的序列信息，ＷＳ分为
动物、植物和微生物３个不同的类群，三者 ｗｓ基因
序列相似性不高［１１－２１］。本研究进行的系统进化分
析也表明，白蜡虫 ＷＳ与其他物种的 ＷＳ没有聚在
一起。有研究认为，人和家鸡 ＷＳ中存在 ＨＰＨＧ保
守位点，其他家禽 ＷＳ存在（Ｙ／Ｆ）ＹＨＧ的保守位
点［４，１２，１９］，植物和不动杆菌中发现潜在的保守位点：
ＨＨＸＸＸＤＧ［４，１６，１８，２０］。本研究在白蜡虫中并未发现
ＷＳ的保守位点，说明不同物种 ｗｓ基因序列存在较
大差异，白蜡虫ＷＳ需要更系统的研究。
ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结果显示：ＷＳ在２８℃条件下诱
导成功。对于不动杆菌 ＷＳ的原核表达也发现，较
高温度下过夜诱导并未导致菌死亡［２２］。在不动杆
菌中，ＷＳ催化蜡酯合成，蜡酯是细菌能量的储存物
质，因此，ＷＳ的表达对于细菌的毒性可能不大。从
ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ可以看出，在 ＩＰＴＧ诱导下，白蜡虫 ＷＳ
３１６
林 业 科 学 研 究 第２９卷
的表达明显。已有研究表明，ＷＳ属于可溶性蛋白，
可大量存在于培养基中［２２］。本试验仅检测了菌体
中ＷＳ的表达情况，并未检测经过浓缩纯化的菌液
上清中的ＷＳ，可在后续实验中进一步探讨。
目前，昆虫 ＷＳ的研究还没有报道，白蜡虫 ｗｓ
全长基因的克隆对其它昆虫的蜡酯合成研究具有参
考价值，同时也为白蜡虫泌蜡机理研究奠定了基础。
本研究中大量表达 ＷＳ可用于抗体制备，分析组织
特异性表达及亚细胞定位。
４ 结论
本试验获得了白蜡虫ｗｓ基因 ｃＤＮＡ全长１５１８
ｂｐ，ｗｓ基因开放阅读框 １３５６ｂｐ，编码 ４５２个氨基
酸。构建了原核表达载体 ｐＥＴ２２ｂ／ＥｐｅｌＷＳ，转化大
肠杆菌 ＢＬ２１，并通过 ＩＰＴＧ诱导表达，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ
检测结果证实ＷＳ成功表达。
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（责任编辑：张 玲）
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