全 文 ：书甘肃省小麦条锈病主要流行小种的犚犃犘犇分析及
犛狌１１４小种犛犆犃犚标记建立
孟亚雄，仲军，马小乐，李葆春，赖勇，司二静，尚勋武，王化俊
（甘肃省干旱生境作物学重点实验室 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室 甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：本研究应用ＲＡＰＤ标记技术对甘肃省小麦条锈菌主要流行的８个生理小种进行多态性标记分析，旨在寻找
小麦条锈菌不同生理小种的特异性标记，共选用２２０条１０碱基随机引物进行筛选，其中有１４７条可得到稳定清晰
的扩增条带。研究结果显示，通过使用１４７条引物对甘肃省流行的８个条锈菌的生理小种进行ＲＡＰＤ分析，发现
各致病小种间遗传变异丰富，其中引物Ｓ３０１在条中３３号中扩增得到约５０７ｂｐ的特异条带；引物Ｓ３９在条中３２扩
增得到长度约１８３ｂｐ的特异条带；引物Ｓ３６在 Ｈｙｂｒｉｄ４６８扩增得到约５１０ｂｐ的特异条带；引物Ｓ２１４０在Ｓｕ１１４
扩增得到约３１７ｂｐ的特异条带。另外，本研究还对扩增得到的特异片段进行回收并进行测序分析，其中依据小麦
条锈菌生理小种Ｓｕ１１４特异条带的测序结果设计特异引物，成功将其转化为对Ｓｕ１１４小种特异的ＳＣＡＲ标记，
这对不同条锈菌生理小种的快速准确检测具有重要意义。
关键词：小麦；条锈病；ＲＡＰＤ；ＳＣＡＲ标记
中图分类号：Ｓ５１２．１０８；Ｓ４３５．１２１．４＋２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１０）０６０１８００７
小麦条锈病（犘狌犮犮犻狀犻犪狊狋狉犻犻犳狅狉犿犻狊犳．ｓｐ狋狉犻狋犻犮犻）是我国小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）的最重要的病害，也是甘肃
省小麦生产的主要病害之一。目前对小麦条锈病防治主要通过培育抗病品种和化学防治［１］。然而，在小麦抗病
品种生产中，抗病品种抗性很容易丧失，据研究这主要是由于条锈菌毒性新小种的产生和发展引起的［２］。化学防
治存在费工、费时，并且易造成环境污染等问题，因而在生产上广泛应用抗性品种并对条锈菌的流行进行预测分
析，对环境保护和小麦生产具有重要的意义。
小麦条锈菌是专性寄生菌，目前仍无法人工培养，且尚未发现其有性世代。它主要通过双核的夏孢子传播来
完成周年循环，其群体表现出很强的抗锈基因突变能力，引起条锈病的周期性爆发流行，给农业生产造成了严重
损失［３］。所以进行小麦条锈菌不同流行小种的鉴定分析对小麦条锈菌的防治具有重要的意义，而用常规的小种
鉴定及监测均是基于鉴别寄主进行的，操作方法繁杂、费工费时，限制了田间小麦条锈菌标样的大规模鉴定。随
着分子生物学技术的发展，尤其是分子标记技术的完善和应用，多种分子标记技术已广泛用于病原菌分类及毒性
变异、致病性分化及演变、群体遗传学及遗传育种研究中，并且为深入认识寄主和病原物相互作用的本质提供了
新的途径［４］。分子标记技术在小麦条锈病的分析鉴定中亦被广泛应用，其中单卫星等［５］分析了中国小麦条锈菌
１３个分离系的ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）谱型，认为小种间及小种内存在遗传变异。李振歧
和商鸿生［６］，康振生等［７］，曹丽华等［８］，Ｊｉａ等［９］对目前中国小麦条锈菌的主要优势菌系进行ＲＡＰＤ片段的规模筛
选，找到了条中３１号、条中２９号、条中２３号和水源类型４个流行生理小种的特异性ＲＡＰＤ标记，通过寻找小麦
条锈菌生理小种的特异性ＲＡＰＤ片段，初步建立起了中国小麦条锈菌生理小种的分子检测体系。另外，曹丽华
等［１０，１１］通过分子标记手段获得了条中２９、条中３１等小麦条锈菌生理小种的特异条带，并建立了它们的ＳＣＡＲ
（ｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｅｇｉｏｎ）标记。
本研究以甘肃省小麦主要流行的条锈菌８个生理小种的单孢菌系为研究对象，利用大量随机引物进行筛选，
１８０－１８６
２０１０年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１９卷 第６期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１００７１２；改回日期：２０１００９１５
基金项目：科技部支撑计划子项目（２ＧＳ０６４Ａ４１００１０６），甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（ＧＮＳＷ２００７０１）和甘肃省重大专项
（０８０１ＮＫＤＡ０１３）资助。
作者简介：孟亚雄（１９７７），男，甘肃会宁人，助理研究员，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｙｘｍｅｎｇ１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗｈｕａｊｕｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ
通过ＲＡＰＤ标记技术揭示小麦条锈菌不同生理小种间的差异，寻找各生理小种特异性标记，并且对ＲＡＰＤ标记
的特异ＤＮＡ片段进行回收、克隆和测序分析，并根据测序结果设计特异引物，将ＲＡＰＤ标记转化为更稳定的
ＳＣＡＲ检测标记，并用该特异引物对各生理小种进行了检测，建立具有实用价值的分子检测技术。
１ 材料与方法
１．１ 材料
供试菌种：条中３３（ＣＹ３３）、条中３２１（ＣＹ３２１）、条中３２２（ＣＹ３２２）、Ｈｙｂｒｉｄ４６８、水源１１３（Ｓｕ１１３）、水源
１１４（Ｓｕ１１４）、水源１１５（Ｓｕ１１５）、水源１１７（Ｓｕ１１７）、水源１１１３（Ｓｕ１１１３）的单孢菌系，菌种均由甘肃省农业科
学院植保所提供。单孢菌系的分离及各生理小种采用常规方法在鉴别寄主上进行鉴定［６］，并在感病品种铭贤
１６９上大量繁殖，收集的新鲜夏孢子真空封存后，保存于－７０℃，以备基因组ＤＮＡ提取。试剂：所用２２０条１０碱
基随机引物购自上海生工生物工程公司；ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、１０×ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ均购自天根生化科技有限公司；特
异ＤＮＡ片段的序列测定工作由华大生物工程公司完成。
１．２ 小麦条锈菌基因组ＤＮＡ的提取
小麦条锈菌ＤＮＡ的提取参考韩冰［１２］的方法。取５０ｍｇ夏孢子，加入少量灭菌石英砂、液氮，反复研磨至粉
状，转入离心管中，加入８００μＬ预热的ＤＮＡ提取液［１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ａｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔ
ｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，乙二胺四乙酸），１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），２％ ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，
十六烷基三甲基溴化铵）］充分混匀，置６５℃水浴１．５ｈ；加入等体积氯仿／异戊醇（２４∶１）抽提纯化；加入５００μＬ
预冷的异丙醇，－２０℃，静置１～２ｈ；４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，然后加入４００μＬ的１×ＴＥ缓冲液溶解，再加
入适量ＲＮＡ酶在３７℃水浴３０ｍｉｎ，加入２倍体积预冷的无水乙醇于－２０℃静置沉淀ＤＮＡ，然后用７０％乙醇洗
涤沉淀２次，最后用５０μＬ的１×ＴＥ缓冲液溶解。
１．３ 小麦条锈菌的ＲＡＰＤ分析及序列测定
ＲＡＰＤ标记的反应体系为２５μＬ：１０×ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ［２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）；１００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ；
１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４；１５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２］２．５μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，模板ＤＮＡ（６０ｎｇ／μＬ）１μＬ，引
物（１０ｎｇ／μＬ）１μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶（２．５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１８μＬ。每次反应均设立ｄｄＨ２Ｏ为阴性对照，
扩增在ＰＣＲ仪上进行，反应程序为：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，３７℃４５ｓ，７２℃９０ｓ，４０个循环；７２℃７ｍｉｎ。扩增产
物用质量分数１．５％琼脂糖凝胶、１×ＴＡＥ电泳缓冲液电泳分离，用凝胶成像系统记录ＲＡＰＤ谱型，对出现的特
异条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，并送测序公司进行测序分析。
１．４ 特异片段的回收、克隆、测序
在紫外灯箱上从凝胶中切取ＲＡＰＤ标记的特异ＤＮＡ条带，用天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试
剂盒纯化、回收，然后将回收的特异片段连接到克隆载体ｐＧＭＴ上，导入大肠杆菌ＤＨ５α中，根据蓝、白斑筛选
出阳性克隆，然后通过酶切与ＰＣＲ鉴定后进行测序分析。
１．５ ＳＣＡＲ标记的转化、鉴定
根据条锈菌Ｓｕ１１４特异条带的测序结果，从序列两端设计Ｓｕ１１４特异条带的ＰＣＲ特异引物（Ｓｕ１１４１：５′
ＴＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＧＧＧＴＡＧＡＣ３′；Ｓｕ１１４２：５′ＡＴＴＧＧＣＴＣＡＣＴＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧ３′）交华大生物工
程公司合成。优化ＰＣＲ反应条件，检测相应生理小种的不同单孢系，以其他生理小种及无菌去离子水为对照，获
得Ｓｕ１１４转化的ＳＣＡＲ标记。
上述引物组合的ＰＣＲ体系为２５μＬ：１０×ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ；ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ；模板ＤＮＡ（６０
ｎｇ／μＬ）１μＬ；上游引物（１０ｎｇ／μＬ）１μＬ；下游引物（１０ｎｇ／μＬ）１μＬ；ＴａｑＤＮＡ聚合酶（２．５Ｕ／μＬ）０．５μＬ；
ｄｄＨ２Ｏ１７μＬ。扩增在ＰＴＣ１００热循环仪上进行，ＰＣＲ反应程序为：１）９４℃５ｍｉｎ；２）９４℃４５ｓ；３）６０．５℃４５ｓ；
４）７２℃１ｍｉｎ，从第２步到第４步循环运行３０次，５）７２℃１０ｍｉｎ，６）４℃保存。
２ 结果与分析
本试验选用２２０条１０ｂｐ随机引物对国内主要流行的８个小麦条锈菌生理小种进行了ＲＡＰＤ分析，结果有
１４７条随机引物得到稳定清晰的扩增图谱，适用于小麦条锈菌的多态性分析。利用筛选出来的１４７条随机引物
１８１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
对国内主要流行的８个小麦条锈菌进行进一步ＲＡＰＤ分析，结果显示，小麦条锈菌具有丰富的多态性，且有丰富
的遗传变异，多条随机引物的扩增带型在小种间不存在差异，而有部分引物的扩增带在各小种间存在差异。其中
用筛选到的引物Ｓ３０１（ＣＴＧＧＧＣＡＣＧＡ）对国内主要流行的不同小麦条锈菌生理小种进行标记分析，结果在条锈
菌生理小种条中３３中扩增出１条约５０７ｂｐ的特异条带（图１），对该条带进行了回收，并将回收产物连接在克隆
载体上进行测序分析。测序结果如下：
１ ＣＴＧＧＧＣＡＣＧＡ ＧＡＧＧＣＴＧＧＧＴ ＡＧＧＧＧＧＴＧＣＡ ＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡ ＡＧＧＴＧＧＧＣＴＣ ＡＡＧＣＧＡＴＴＣＧ
６１ ＡＴＡＴＡＣＴＧＧＡ ＧＧＡＴＣＡＴＧＡＧ ＡＣＣＡＧＡＡＴＣＡ ＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡ ＴＣＣＧＴＣＣＴＴＣ ＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧ
１２１ ＡＡＣＡＧＡＴＴＣＴ ＧＴＧＡＧＡＣＴＣＧ ＡＡＴＣＧＴＧＧＣＡ ＡＣＣＡＣＡＴＣＡＧ ＡＡＧＣＴＧＣＡＴＣ ＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡ
１８１ ＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡ ＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣ ＣＧＴＴＧＴＣＴＧＡ ＧＧＴＴＧＴＴＡＣＧ ＣＧＡＧＴＣＡＡＣＴ ＡＧＡＡＧＧＧＴＧＧ
２４１ ＡＡＧＧＡＧＴＧＧＴ ＡＧＧＧＴＴＡＡＣＧ ＡＴＧＡＡＧＧＡＣＡ ＴＡＣＡＴＣＣＴＡＧ ＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴ ＧＴＣＡＧＡＧＧＴＣ
３０１ ＴＧＧＣＣＣＡＡＴＣ ＡＣＴＣＧＴＣＣＧＡ ＧＴＧＴＣＴＡＣＣＴ ＴＡＧＧＡＡＧＧＴＡ ＡＡＣＴＴＣＣＡＡＧ ＴＡＡＴＣＡＧＣＧＡ
３６１ ＣＧＡＴＴＴＧＣＴＧ ＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧ ＡＧＧＣＧＡＧＡＧＴ ＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣ ＡＣＡＡＴＣＧＧＧＣ ＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧ
４２１ ＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧ ＣＣＧＧＣＴＧＡＧＣ ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＣ ＴＧＴＴＡＡＧＧＡＡ ＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧ ＣＣＴＡＧＴＴＴＡＴ
４８１ ＧＡＴＣＧＣＧＡＡＧ ＣＡＧＴＴＴＧＴＣＧ ＴＧＣＣＣＡＧ
该序列全长５０７ｂｐ，序列经ＮＣＢＩ（美国国立生物技术信息中心，ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）检索未见同源序列。
图１ 条中３３号犛３０１的犚犃犘犇谱型
犉犻犵．１ 犚犃犘犇狆犪狋狋犲狉狀狊狅犳犆犢３３狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉犛３０１
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：条中３３号ＣＹ３３；２：水源１１７Ｓｕ１１７；３：条中３２１号ＣＹ３２１；４：Ｈｙｂｒｉｄ４６８；５：水源１１３Ｓｕ１１３；
６：水源１１４Ｓｕ１１４；７：水源１１５Ｓｕ１１５；８：水源１１１３Ｓｕ１１１３；９：条中３２２号ＣＹ３２２；下同 Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
用筛选到的引物Ｓ３９（ＣＡＡＡＣＧＴＣＧＧ）对国内主要流行的不同小麦条锈菌生理小种进行标记分析，在条锈
菌生理小种条中３２１号中扩增出１条约１８３ｂｐ的特异条带（图２），对该条带进行了回收，将回收产物连接在克
隆载体上进行测序分析，测序结果如下：
１ ＣＡＡＡＣＧＴＣＧＧ ＴＡＧＧＴＴＧＴＡＣ ＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣ ＧＴＧＣＡＣＴＡＡＴ ＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴ ＡＡＡＣＴＧＴＴＡＡ
６１ ＴＧＡＴＴＡＣＡＡＴ ＴＣＧＡＡＣＧＡＡＡ ＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡ ＡＧＴＧＴＧＴＡＡＡ ＴＡＴＣＴＡＡＧＡＡ ＣＴＡＣＣＡＴＧＴＣ
１２１ ＴＡＴＴＧＧＴＣＡＧ ＡＴＴＡＴＡＣＡＡＴ ＧＴＣＣＧＴＧＧＡＣ ＡＴＴＧＴＴＴＣＣＧ ＧＡＡＣＡＣＡＡＴＴ ＣＧＴＣＣＧＡＣＧＴ
１８１ ＴＴＧ
该序列全长１８３ｂｐ，序列经ＮＣＢＩ检索未见较长同源序列。
用筛选到的引物Ｓ３６（ＡＧＣＣＡＧＣＧＡＡ）对国内主要流行的不同小麦条锈菌生理小种进行标记分析，在条锈
菌生理小种条中Ｈｙｂｒｉｄ４６８中扩增出１条约５１０ｂｐ的特异条带（图３），对该条带进行了回收，将回收产物连接
在克隆载体上进行测序分析，测序结果如下：
１ ＡＧＣＣＡＧＣＧＡＡ ＴＣＡＴＧＡＡＡＣＣ ＣＧＣＡＡＧＴＴＧＡ ＴＣＡＣＣＡＡＡＡＣ ＡＴＡＣＡＴＣＡＡＧ ＴＡＣＴＣＡＣＡＴＧ
６１ ＡＡＴＡＴＣＣＣＡＴ ＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡ ＧＡＴＡＧＡＣＡＣＧ ＴＧＣＡＡＧＡＣＡＴ ＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧ ＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡ
２８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
１２１ ＣＴＣＡＡＴＣＣＧＡ ＴＡＡＧＡＴＡＡＣＴ ＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡ ＡＡＣＴＣＡＡＴＴＣ ＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡ ＧＧＧＡＧＡＣＧＧＧ
１８１ ＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣ ＡＧＡＡＧＡＴＣＣＡ ＡＣＴＡＴＡＧＴＡＧ ＣＡＡＡＧＣＣＣＧＣ ＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡ ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＡ
２４１ ＴＣＴＡＡＡＧＡＡＣ ＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡ ＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣ ＡＡＡＣＡＣＡＴＡＧ ＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣ ＡＴＡＣＣＣＴＣＡＧ
３０１ ＣＣＣＣＧＡＧＧＧＴ ＧＧＡＣＴＡＣＴＣＣ ＣＴＣＣＴＣＧＴＣＡ ＴＧＧＡＧＡＴＣＧＣ ＣＧＧＧＡＴＧＡＴＧ ＡＡＧＡＴＧＧＴＣＡ
３６１ ＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧ ＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣ ＣＧＧＣＡＧＧＧＴＧ ＣＣＧＧＡＡＣＧＧＧ ＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧ ＧＴＴＴＴＴＧＧＴＧ
４２１ ＧＣＴＡＣＡＧＡＧＧ ＣＴＴＧＣＧＧＣＧＧ ＴＧＧＡＡＣＴＣＣＣ ＧＡＴＣＴＡＧＧＴＴ ＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧ ＧＧＴＴＴＣＴＧＴＡ
４８１ ＴＴＴＡＴＡＧＧＡＡ ＴＴＴＴＡＣＧＴＣＧ ＧＴＴＧＧＧＣＣＣＡ
该序列全长５１０ｂｐ，序列经ＮＣＢＩ检索未见较长同源序列。
图２ 条中３２１号犛３９的犚犃犘犇谱型
犉犻犵．２ 犚犃犘犇狆犪狋狋犲狉狀狊狅犳犆犢３２１狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉犛３９
图３ 犎狔犫狉犻犱４６８号犛３６的犚犃犘犇谱型
犉犻犵．３ 犚犃犘犇狆犪狋狋犲狉狀狊狅犳犎狔犫狉犻犱４６８狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉犛３６
以随机引物Ｓ２１４０（ＴＧＧＴＡＣＣＴＧＧ）对国内主要流行的不同小麦条锈菌生理小种进行标记分析，在Ｓｕ１１４
中扩增出约３１７ｂｐ的特异条带（图４），对特异条带进行回收，并克隆于载体ｐＧＭＴ上，用 Ｍ１３引物进行双向测
序，其结果为：
１ ＴＧＧＴＡＣＣＴＧＧ ＡＣＡＴＴＧＧＧＧＴ ＡＧＡＣＧＣＴＡＡＡ ＡＧＧＡＴＴＧＧＴＣ ＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴ ＧＡＡＴＣＴＧＡＧＣ
６１ ＡＡＴＡＡＴＴＣＣＴ ＴＴＡＴＡＴＧＣＡＣ ＣＣＴＣＧＧＣＧＡＴ ＴＴＣＧＴＡＧＣＧＧ ＣＧＣＴＧＴＡＧＴＴ ＣＴＧＡＴＡＧＣＴＧ
１２１ ＡＧＴＴＴＧＡＴＴＧ ＧＣＧＧＴＡＡＴＴＧ ＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧ ＧＧＣＧＣＴＧＡＧＴ ＴＴＧＴＣＧＡＴＴＴ ＧＡＡＣＴＴＧＡＡＴ
１８１ ＴＴＧＧＣＴＴＧＣＣ ＴＧＣＴＧＧＴＡＴＡ ＧＴＣＣＴＴＴＡＧＣ ＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴ ＧＴＣＣＴＡＧＴＴＡ ＧＣＴＣＧＧＣＡＡＴ
２４１ ＣＡＴＴＴＣＴＡＧＧ ＣＧＧＣＴＡＴＣＴＧ ＴＡＴＣＧＣＣＡＴＴ ＧＣＣＧＣＣＣＡＡＡ ＧＴＴＧＴＡＴＣＴＡ ＴＴＧＧＣＴＣＡＣＴ
３０１ ＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡ ＧＧＴＡＣＣＡ
该序列全长３１７ｂｐ，序列经ＮＣＢＩ检索未见较长同源序列。
利用上述试验体系进行Ｓｕ１１４单孢系的ＳＣＡＲ标记验证，结果表明该引物组合可以在供试Ｓｕ１１４各单孢
菌系基因组ＤＮＡ中扩增到目标片段（图５），如图中的２，３泳道中扩增出约３１７ｂｐ的特异条带，该ＳＣＡＲ检测标
３８１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
记的长度为３００ｂｐ，而在去离子水（ＣＫ）及其他生理小种中没有该扩增条带，说明该ＳＣＡＲ检测标记是能够用于
Ｓｕ１１４的检测。
图４ 水源犛狌犾４犛２１４０的犚犃犘犇谱型
犉犻犵．４ 犚犃犘犇狆犪狋狋犲狉狀狊狅犳犛狌１１４狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉犛２１４０
图５ 犛狌１１４的犛犆犃犚图谱
犉犻犵．５ 犜犺犲犛犆犃犚犳犻犵狌狉犲狅犳犛狌１１４
Ｍ：ＤＬ２０００；２．超纯水（对照）Ｕｌｔｒａｐｕｒｅｗａｔｅｒ（ＣＫ）；２，３：水源１１４Ｓｕ１１４；４：条中３３号ＣＹ３３；５：水源１１７Ｓｕ１１７；
６：条中３２１号ＣＹ３２１；７：Ｈｙｂｒｉｄ４６８；８：水源１１３Ｓｕ１１３；９：水源１１５Ｓｕ１１５；１０：水源１１１３Ｓｕ１１１３
３ 讨论
分子生物学的发展为人们从分子水平分析生物的遗传多样性，揭示物种的变异提供了新的途径，而植物病原
微生物的分子诊断技术和遗传标记技术的发展使得人们可直接从复杂的生物混合物中鉴定和识别特定的病原
物。由于ＲＡＰＤ技术多态性丰富，已在生物的多样性分析和生物的遗传标记及分子诊断等方面被广泛应
用［１０，１３１５］，在小麦条锈菌的检测分析中亦被广泛应用，并取得了一些可喜的成果。但由于ＲＡＰＤ对反应条件十
分敏感，试剂浓度的轻微改变或者扩增程序的稍微变动以及不同试验环境都可能改变扩增结果，因此利用ＲＡＰＤ
技术进行生物多样性分析时，在ＰＣＲ反应和对ＰＣＲ产物的电泳分析过程中，要保证上样量、凝胶浓度及电泳条
件一致，以获得正确的试验结果。另外由于ＲＡＰＤ技术极不稳定，因此在寻找小麦条锈菌不同生理的特异性标
记时，将不稳定的ＲＡＰＤ标记转化为更加稳定的ＳＣＡＲ标记是十分有必要的。
目前，对小麦条锈菌的防治主要通过使用抗病品种，并辅以化学药剂处理。然而，小麦条锈菌种类繁多，变异
频繁，常多个生理小种并存，在自然界混合发生，另外小麦条锈菌自然群体中生理小种组成及数量的变化还可以
影响锈菌群体的毒性结构，进而改变一个地区的品种抗性情况和病害流行程度，这对条锈病的防治工作带来很大
的困难。抗病小麦品种在生产应用中的一个突出问题就是其抗条锈性容易丧失，大量研究表明这一现象主要是
由于条锈菌毒性新小种的产生和发展引起的。此外，由于小麦不同抗性品种、环境等因素的选择作用，使得小麦
条锈菌新的小种不时出现，发生频率也不断改变，因而对不同条锈菌生理小种的流行趋势做提前检测预报对条锈
４８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
病的防治显得非常重要。长期以来众多研究工作者采用不同的方法进行了小麦条锈菌的检测与预报，一直把小
麦条锈菌生理小种监测工作作为小麦安全生产及抗病育种的重要环节［２］。但由于小麦条锈菌是严格专性寄生
菌，只能在活体上进行寄生和繁殖，不能人工进行离体培养，且尚未发现其有性世代，人工培养繁殖的方法繁杂、
费工费时，准确性存在人为因素的影响，使得小麦条锈菌的遗传结构及特点的研究十分困难。近年来，科研工作
者把小麦条锈病的常规监测方法和现代分子标记技术有机的结合起来，改变了以往常规小麦条锈菌生理小种鉴
定程序繁琐、周期长及易受环境条件影响的状况，缩短了鉴定锈菌的时间，并能全面了解病菌群体的遗传结构与
动态变化［１６，１７］。
本研究参考康振生等［７］、郝保军等［１８］、曹丽华等［１０，１１］对不同小麦条锈菌生理小种的筛选方法，用随机引物对
国内小麦条锈菌８个主要致病小种进行了ＲＡＰＤ标记分析，结果表明，小麦条锈菌的不同生理小种间存在丰富
的遗传多样性，通过大规模筛选随机引物，可以找到国内小麦条锈菌相应生理小种的特异性ＲＡＰＤ标记，通过对
大量引物的筛选结果筛选到条中３３、条中３２、Ｈｙｂｒｉｄ４６８、Ｓｕ１１４等生理小种的 ＲＡＰＤ特异性标记，但由于
ＲＡＰＤ标记不稳定，所以本试验选用相对更加稳定的ＳＣＡＲ标记，目前初步建立了Ｓｕ１１４小种的ＳＣＡＲ标记，
为及时、准确检测条锈菌群体的组成、小麦抗病品种的选育及条锈病的控制提供试验依据。小麦条锈菌的分子检
测的最终目的是服务于农业生产，因而，小麦条锈菌的田间检测显得尤为重要，这也是本研究后续工作的重要内
容，以便更好地为小麦条锈病的早期诊断和检测提供理论依据。
参考文献：
［１］ 李振岐，曾士迈．中国小麦锈病［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００２．
［２］ 李振歧．我国小麦品种抗条锈性丧失原因及其解决途径［Ｊ］．中国农业科学，１９８０，１３（３）：７２７６．
［３］ ＳｍｉｔｈＪＭ，ＮｅｗｔｏｎＡＣ，ＢｕｃｋＫ Ｗ．ＤＮＡｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓａｓｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓｉｎｃｅｒｅａｌｒｕｓｔｆｕｎｇｉ［Ｊ］．ＶｏｒｔｒａｅｇｅＦｕｅｒ
Ｐｆｌａｎｚｅｎｚｕｅｃｈｔｕｎｇ，１９９２，８：２２２４．
［４］ 王和勇，陈敏，廖文华，等．ＲＦＬＰ，ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰ分子标记及其在植物生物技术中的应用［Ｊ］．生物学杂志，１９９９，１６（４）：
２４２５．
［５］ 单卫星，陈受宜，吴立人，等．中国小麦条锈菌流行小种的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．中国农业科学，１９９５，２８（５）：１７．
［６］ 李振歧，商鸿生．小麦锈病及其防治［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９８９．
［７］ 康振生，曹丽华，郑文明，等．小麦条锈菌条中２９号生理小种ＳＣＡＲ检测标记的建立［Ｊ］．西北农林科技大学学报（自然科学
版），２００５，３３（５）：５３５６．
［８］ 曹丽华，康振生，郑文明，等．小麦条锈菌条中３１号生理小种ＳＣＡＲ检测标记的建立［Ｊ］．菌物学报，２００５，２４（１）：９８１０３．
［９］ ＪｉａＱＺ，ＪｉｎＳＬ，ＣａｏＳＱ，犲狋犪犾．ＴｒｅｎｄｉｎｇｔｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＹ３２ａｎｄＳｈｕｉｙｕａｎ１４ｐａｔｈｏｔｙｐｅｓｉｎＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ［Ｊ］．
ＡｃｔａＰｈｙｔｏｐｈｙｌａｃｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００７，３４（３）：２６３２６７．
［１０］ 曹丽华．中国小麦条锈菌４个流行小种的ＲＡＰＤ标记［Ｊ］．西北农林科技大学学报（自然科学版），２００４，３２（７）：３７４０．
［１１］ 曹丽华，康振生，郑文明，等．小麦条锈菌条中３１号生理小种ＳＣＡＲ检测标记的建立［Ｊ］．菌物学报，２００５，２４（１）：９８
１０３．
［１２］ 韩冰．小麦条锈菌提取方法的比较［Ｊ］．中国农学通报，２００５，２２（４）：８１８３．
［１３］ 鄢家俊，白史且，张新全，等．青藏高原老芒麦种质基于ＳＲＡＰ标记的遗传多样性研究［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（１）：１７３
１８３．
［１４］ 梁慧敏．不同居群狗牙根ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（１）：２５８２６２．
［１５］ 唐祈林，王培，卢艳丽，等．玉蜀黍属物种间遗传关系的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（４）：１５４１６０．
［１６］ 单卫星，李振岐．ＰＣＲ技术在植物病原物和植物抗病研究中的应用［Ｊ］．植物生理通讯，１９９５，３１：１３７１４３．
［１７］ ＳｔｅｅｌｅＫＡ，ＨｕｍｐｈｒｅｙｓＥ，ＷｅｌｉｎｇｓＣＲ，犲狋犪犾．ＳｕｐｐｏｒｔｆｏｒｓｔｅｐｗｉｓｅｍｕｔａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｆｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎ
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［１８］ 郝保军，王保通，李强，等．小麦条锈菌水源１１类群的ＲＡＰＤ分析及ＳＣＡＲ标记的建立［Ｊ］．植物病理学报，２０１０，４０（１）：
１６．
５８１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
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６８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６