全 文 ：书组合微生物利用发酵秸秆产乳酸效果的研究
徐娟娟１，２，葛春梅２，孙芹英２，张洁２，樊美珍１，潘仁瑞２
（１．安徽农业大学微生物防治省重点实验室，安徽 合肥２３００３６；２．合肥学院生物与环境工程系，安徽 合肥２３００２２）
摘要：为了更好的利用玉米芯、玉米秸秆等农业废弃物，提高其综合利用率，减少传统化学方法及秸秆焚烧过程造
成的环境污染，试验采用里氏木霉与鸡腿菇混合发酵产粗酶液降解秸秆等废弃物，再利用米根霉将废弃物转化为
乳酸。此试验中以商品纤维素酶处理的玉米芯及秸秆为对照进行乳酸发酵试验。鸡腿菇与里氏木霉按５∶２的接
种比例，接种时间间隔为１２ｈ，在２６℃，１５０ｒ／ｍｉｎ培养３ｄ，此时漆酶酶活比鸡腿菇单独发酵酶活提高１０６％。用以
上两菌混合发酵３ｄ的粗酶液在５０℃，ｐＨ５．０，１２０ｒ／ｍｉｎ下酶解原材料８４ｈ，酶解得率为５５．２％，米根霉再转化酶
水解液产乳酸量为３．６９ｇ／Ｌ，糖酸转化率为６７．４０％。
关键词：秸秆；Ｌ乳酸；里氏木霉；鸡腿菇；米根霉；共发酵
中图分类号：Ｓ８１６．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１０）０６０１２００６
我国每年农作物秸秆产量达７亿ｔ之多［１］，其中玉米秸秆２．２亿ｔ，估算每年有近９０％的纤维素资源不能被
利用，多数被白白地烧掉，不仅浪费资源，而且还严重的污染环境。因此，合理开发和科学利用这一丰厚天然资
源是各国政府及科学家一直致力于、且投入大量人力及资金进行研究和开发的重点领域［２］。近几年国内外科研
人员利用物理、化学的方法处理农业废弃物秸秆，但其利用不充分、成本高是障碍。采用微生物降解法利用秸秆，
具有降解率高、安全环保和成本低等优点。自然界中存在许多微生物可以腐蚀和分解秸秆、树叶及树木等高纤维
物质，这些微生物包括细菌、霉菌、酵母菌及食用菌等［３］。
乳酸广泛存在于人体、动植物和微生物中。早在１８４１年，Ｂｏｕｔｒｏｎ和Ｆｒｅｍｙ就采用自然发酵生产乳酸［４，５］。
乳酸及其盐类和衍生物可用于食品、酿造、医药、皮革、卷烟、化工和印染等工业［６］，Ｌ乳酸聚合而成的聚乳酸具有
生物降解性和生物相容性被广泛用于生产可生物降解塑料。目前，Ｌ乳酸的生产主要采用葡萄糖、淀粉为原料，
成本较高，限制了Ｌ乳酸的应用。
随着人口迅猛增长，能源与环境压力日益增大。世界各国均不遗余力地调整农业结构，降低环境与市场风
险，满足人民对食物数量和质量的需求［７］。我国是一个农业大国，具有丰富的纤维素资源，是一个有待进一步开
发的巨大宝库，以麦秆为例，其中纤维素和半纤维素的含量在６０％以上，其基本单元组成为葡萄糖、木糖等糖
类。目前，农作物秸秆绝大部分被自然腐败或燃弃，不仅浪费了宝贵的资源，而且造成了环境的污染。围绕降低
Ｌ乳酸的生产成本，选择廉价、广泛的纤维素为原料生产Ｌ乳酸成为研究热点之一［８，９］。
本研究以里氏木霉（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪狉犲犲狊犲犻）、鸡腿菇（犆狅狆狉犻狀狌狊犮狅犿犪狋狌狊）混合发酵产粗酶液降解秸秆等农业废
弃物，并利用米根霉（犚犺犻狕狅狆狌狊狅狉狔狕犪犲）进一步将其转化为乳酸，确定了混合发酵产粗酶液处理玉米秸秆等农业
废弃物的工艺条件。同时采用商购纤维素酶与混合发酵所产粗酶液处理玉米秸秆等农业废弃物进行乳酸发酵的
结果进行了对比。试验结果表明，以玉米秸秆、玉米芯等农业废弃物为原料，采用微生物混合发酵产乳酸是可行
的，为处理农业废弃物提供一个可供参考的生物学方法。
１ 材料与方法
１．１ 材料
玉米芯，秸秆，麸皮，购自肥西县郊区。鸡腿菇和米根霉为合肥学院微生物和环境工程实验室保存菌种，里氏
１２０－１２５
２０１０年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１９卷 第６期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
收稿日期：２００９１１０９；改回日期：２０１００１０８
基金项目：安徽省自然科学基金项目 （０７０４１３２６６Ｘ），安徽省教育厅优秀人才基金（２００９ＳＱＲ２１６２），合肥学院博士基金项目（ＲＣ００１６）和合肥
学院自然科学基金项目（０９ＫＹ１１ＺＲ）资助。
作者简介：徐娟娟（１９８４），女，安徽淮南人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｘｕｊｕａｎｊｕａｎ１０１４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｍｚｆａｎ＠ａｈａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
木霉购自中国菌物保藏中心。
１．２ 试验方法
１．２．１ 试验设计 组合微生物的筛选：试验对多种降解秸秆的白腐真菌及里氏木霉与黑曲霉等进行平板相容性
及产酶试验分析，得鸡腿菇和里氏木霉共培养组合良好，在两菌生长交界处，滴加愈创木酚，显示交界区漆酶分泌
超过单独鸡腿菇分泌［１０］。
里氏木霉与鸡腿菇混合培养条件的优化：以液体发酵产酶培养基（４０目玉米芯４ｇ，４０目玉米秸秆２ｇ，４０目
麸皮１ｇ，改良的ｍａｎｄｅｌｓ盐［１１］５７．７５％，装液量１２０ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶）为基础培养基。设计不同的接种比例，
接种顺序，接种时间等，对里氏木霉与鸡腿菇混合发酵产酶条件进行优化。最优培养条件为：２６℃，１５０ｒ／ｍｉｎ，
ｐＨ５．０，发酵３ｄ。
粗酶液酶解原材料试验：里氏木霉与鸡腿菇在最优条件下发酵３ｄ的粗酶液，在不同条件下酶解玉米芯及玉
米秸秆，采用生物传感器法（ＳＢＡ４０Ｃ葡萄糖－乳酸生物传感器分析仪）测定水解糖含量，选择最优水解条件。
最后确定酶解最适条件为：５０℃，１２０ｒ／ｍｉｎ，ｐＨ４．８，酶解８４ｈ。
发酵产酸试验：向酶解基质中补加供米根霉生长的无机盐，灭菌，取长满孢子的米根霉斜面，用无菌水洗下孢
子，最后接种米根霉孢子悬浮液（１．２×１０７ 个孢子／ｍＬ）１ｍＬ于发酵产酸培养基［５０ｍＬ酶水解液装入２５０ｍＬ
三角瓶，（ＮＨ４）２ＳＯ４０．３％，ＺｎＳＯ４０．０２％，ＫＨ２ＰＯ４０．０３％，ＭｇＳＯ４０．０７５％，足量ＣａＣＯ３（单独灭菌）］中。培养
条件：３６℃，２００ｒ／ｍｉｎ，４８ｈ。
以上试验在２００８年２月－２００９年８月进行，均设至少３个重复。
１．２．２ 酶活力的测定方法 纤维素酶酶活的测定［１２１４］：取适当稀释的粗酶液０．５ｍＬ，加入１ｍＬ１％的羧甲基
纤维素钠（ｓｏｄｉｕｍｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｕｌｏｓｅ，ＣＭＣＮａ）溶液（溶于ｐＨ为４．８，浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ的 ＨＡｃＮａＡｃ缓
冲液中），５０℃保温３０ｍｉｎ，加入３ｍＬ３，５二硝基水杨酸（３，５ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ，ＤＮＳ）溶液，沸水浴５ｍｉｎ，冷
却后加水稀释至２５ｍＬ，分光光度计调至５２０ｎｍ处测定吸光度，并计算生成葡萄糖的质量。
木聚糖酶酶活的测定［１３，１５，１６］：取０．１ｍＬ适当稀释的粗酶液，加入０．１ｍＬ２％桦木木聚糖溶液（用０．２
ｍｏｌ／Ｌ的ＨＡｃＮａＡｃ缓冲液配制，ｐＨ４．６），在５０℃保温１５ｍｉｎ后，加入０．６ｍＬＤＮＳ溶液，煮沸１０ｍｉｎ灭活显
色，定容到５ｍＬ，５５０ｎｍ波长下测定还原糖量（以木糖计），以灭活的酶液作为对照。
漆酶酶活的测定：采用ＡＢＴＳ法［１７］，酶活单位定义为每ｍｉｎ氧化１μｍｏｌ２，２′连氮二（３乙基苯并噻唑６磺
酸［２，２′ａｚｉｎｏｂｉｓ（３ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ６ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，ＡＢＴＳ］所需的酶量为一个酶活单位。
１．２．３ 酶水解方法 取１０ｇ粉粹的玉米芯和秸秆（两者比例为１∶１），置于２５０ｍＬ三角瓶中，加入１２０ｍＬ的
缓冲液和２ｍＬ浓度为７５０Ｕ／ｇ的纤维素酶液，在５０℃，１００ｒ／ｍｉｎ恒温水浴锅中反应２４ｈ。酶水解产物经离心
得到的上清液即为酶水解糖液。
将１０ｇ粉碎的玉米芯和秸秆（两者比例为１∶１）加入鸡腿菇和里氏木霉混合发酵３ｄ后过滤得到的粗酶液
中，设定不同酶解条件，水解，离心后得酶水解糖液。
１．２．４ 总糖、葡萄糖和乳酸的分析方法 使用ＳＢＡ４０Ｃ葡萄糖－乳酸生物传感器分析仪，测定葡萄糖和乳酸
含量。
总糖的测定：８％的硫酸和秸秆酶解液以１∶１混合后在１２１℃下保温１ｈ，取适当稀释的液体０．５ｍＬ，用
ＤＮＳ法测ＯＤ５２０，计算总糖的含量。
１．２．５ 计算公式
酶解得率［９］（％）＝［酶解液中糖量（ｇ）／试样秸秆质量（ｇ）］×１００
糖转化率（％）＝［（初始糖量－终止糖量）／初始糖量］×１００
糖酸转化率（％）＝［乳酸含量（ｇ／Ｌ）／总糖量（ｇ／Ｌ）］×１００
２ 结果与分析
２．１ 最优条件下鸡腿菇和里氏木霉混合发酵随时间变化产酶情况
按５∶２的接种比例同时接种鸡腿菇和里氏木霉，在２６℃，１５０ｒ／ｍｉｎ条件下发酵产酶，其酶活力随时间变化
１２１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
结果如图１，漆酶活力在发酵第３天达峰值，其活力为
图１ 优化条件下混合发酵产酶过程
犉犻犵．１ 犗狆狋犻犿犪犾犮狅狀犱犻狋犻狅狀狅犳犾犻狇狌犻犱狊狋犪狋犲犿犻狓犲犱
犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狆狉狅犱狌犮犲犱犲狀狕狔犿犪狋犻犮狆犲狉犻狅犱
３２７６．２Ｕ／ｍＬ，随后逐渐下降，随着漆酶活性的下降，
纤维素酶和木聚糖酶酶活力逐渐升高，第８天达峰值，
分别为１０１．７和１６７．９ＩＵ／ｍＬ。漆酶活力峰值出现
较早，用于降解木质素结构，破坏秸秆的木质纤维素结
构，暴露出纤维素和半纤维素，发酵后期纤维素酶和半
纤维素酶达到峰值，更有利于对秸秆的降解。混合发
酵中产生的漆酶活力比单独发酵（１５９３．５Ｕ／ｍＬ）提
高了１０６％，而产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活力比
里氏木霉单独发酵产酶有所下降，比鸡腿菇单独发酵
产纤维素酶有所提高（图１，２）。从产酶的时间来看，
混合发酵产生的漆酶酶活峰值比单独发酵提前３ｄ，后
２种酶酶活峰值则有延迟现象。
图２ 鸡腿菇单独（犪）和里氏木霉单独（犫）发酵产酶情况
犉犻犵．２ 犘狉狅犱狌犮狋犻狅狀狅犳犲狀狕狔犿犲狊犳狉狅犿犆．犮狅犿犪狋狌狊（犪）狅狉犜．狉犲犲狊犲犻（犫）狊犻狀犵犾犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀
２．２ 混合发酵粗酶液对秸秆等的降解条件的研究
２．２．１ 摇床转数对粗酶液水解原材料程度的影响
里氏木霉与鸡腿菇混合发酵３ｄ后得到的粗酶液在不
同的摇床转数（８０，１００，１２０，１４０ｒ／ｍｉｎ）条件下进行酶
解原材料７８ｈ，水解得葡萄糖的含量结果见表１，当摇
床转数为１２０ｒ／ｍｉｎ时，得到酶解液中葡萄糖含量较
高，为３．３４ｇ／Ｌ，说明粗酶液酶解底物的过程中酶与底
表１ 转数对酶解反应的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狅犳狉犲狏狅犾狌狋犻狅狀狅狀犲狀狕狔犿犪狋犻犮狉犲犪犮狋犻狅狀
项目
Ｉｔｅｍ
转数Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｒ／ｍｉｎ）
８０ １００ １２０ １４０
葡萄糖含量Ｇｌｕｃｏｎｔｅｎｔ（ｇ／Ｌ） ２．６８ ２．７８ ３．３４ ２．８１
物的接触程度及作用时间对底物的水解有一定的影响，１２０ｒ／ｍｉｎ条件下底物与酶能够充分接触，对底物水解效
果较好。
２．２．２ 粗酶液水解原材料的最佳温度 混合发酵３ｄ的粗酶液在不同的温度（４０，４５，５０，５５℃）下酶解。在５０℃
下酶解得到葡萄糖含量较高，酶解７８ｈ时葡萄糖含量为２．６２ｇ／Ｌ（图３）。酶解过程中，葡萄糖含量均呈先上升
后下降的趋势，下降的原因可能是酶解过程中微生物利用了水解糖作为直接碳源而被消耗。
２．２．３ 不同ｐＨ对粗酶液酶解原材料的影响［１８，１９］ 用混合发酵３ｄ的粗酶液在不同ｐＨ（４．６，４．８，５．０，５．２）下
酶解原材料７８ｈ，葡萄糖含量随时间变化的结果见图４，粗酶液酶解秸秆的最适宜ｐＨ值为４．８。
２２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
图３ 温度对酶解反应的影响
犉犻犵．３ 犈犳犳犲犮狋狅犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀犲狀狕狔犿犪狋犻犮狉犲犪犮狋犻狅狀
图４ 狆犎值对酶解反应的影响
犉犻犵．４ 犈犳犳犲犮狋狅犳狆犎狅狀犲狀狕狔犿犪狋犻犮狉犲犪犮狋犻狅狀
２．３ 米根霉利用秸秆水解液发酵产Ｌ乳酸
２．３．１ 纤维素酶水解物发酵产Ｌ乳酸 商购纤维素酶液，在５０℃，１２０ｒ／ｍｉｎ下酶解８４ｈ，测葡萄糖含量，补加
营养盐接种米根霉在３６．５℃，２００ｒ／ｍｉｎ发酵４８ｈ，测乳酸含量。商购纤维素酶酶解玉米芯秸秆得还原糖（以葡
萄糖计）平均为１．８６ｇ／Ｌ，糖酸转化率平均为３８．６％，发酵产Ｌ乳酸的量平均为０．３６ｇ／Ｌ（表２）。
２．３．２ 混合发酵粗酶液水解物发酵产乳酸 混合发酵产混合粗酶液酶解玉米芯秸秆得总糖和还原糖（以葡萄糖
计）含量平均分别为５．５２和３．３６ｇ／Ｌ，糖酸转化率平均为６７．４０％，发酵产Ｌ乳酸平均为３．６９ｇ／Ｌ（表２），得到
乳酸含量比所测葡糖糖完全转化成乳酸值高，说明该米根霉菌株可以转化木糖为乳酸［１９］。
表２ 不同酶液酶解原材料产糖产酸结果
犜犪犫犾犲２ 犚犲狊狌犾狋狅犳犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犪狀犱犵犾狌犮狅狊犲狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀犳狉狅犿犱犻犳犳犲狉犲狀狋犲狀狕狔犿犲犾犻狇狌犻犱
重复
Ｒｅｐｅｔａｔｉｏｎ
酶解总糖含量
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ｓｕｇａｒｃｏｎｔｅｎｔ（ｇ／Ｌ）
酶解Ｇｌｕ含量
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
Ｇｌｕｃｏｎｔｅｎｔ（ｇ／Ｌ）
酶解得率
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ｓｕｇａｒｙｅｉｌｄ（％）
Ｌ乳酸含量
Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔ
（ｇ／Ｌ）
糖酸转化率
Ｓｕｇａｒｃｏｎｖｅｒｔｉｏｎ
（％）
商购酶液Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｃｅｌｕｌａｓｅ １．８６±０．０３ ／ １８．６０±０．２５ ０．３６±０．０２ ３８．６０±１．１２
粗酶液Ｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅｌｉｑｕｉｄ ５．５２±０．１４ ３．３６±０．０２ ５５．５７±１．４５ ３．６９±０．０３ ６７．４０±１．７０
商品化纤维素酶组分单一，仅能作用于纤维素成分，糖水解得率较低；鸡腿菇和里氏木霉混合发酵粗酶液虽
然酶浓度低，但酶组分较多，可以作用于秸秆中的多种组分，如漆酶，可以作用于木质素，破坏木质素结构，暴露出
更多的纤维素和半纤维素结构，能使酶与底物的接触更加充分，秸秆水解率提高。
３ 讨论
为了加快秸秆等物质的快速转化，充分利用环境中的农业可再生资源，微生物之间的相互作用成为目前研究
的热点。混合菌培养周期短，某些微生物组合性能稳定，可获得某些新型的或优质的发酵产品，产率高，且在防治
杂菌污染方面很占优势［２０］。
目前，已有利用秸秆纤维素类物质生产Ｌ乳酸的报道［２１２３］，但是发酵之前都对天然纤维素进行了不同程度
的化学预处理，对环境又造成了二次污染，且最终转化率较低。本试验前后一共经过２次液体发酵（７２ｈ液态产
酶发酵＋酶解８４ｈ＋液体发酵产酸４８ｈ），步骤简单，周期短，对环境无任何污染，较好的解决了秸秆纤维素生物
质资源的利用问题［６］。
里氏木霉和鸡腿菇混合发酵产生纤维素酶和木聚糖酶活性和里氏木霉单独发酵相比变化不大，漆酶的活性
比鸡腿菇单独发酵提高１０６％，且产酶时间提前至３ｄ。混合酶液能很好的降解秸秆中的木质素，使秸秆紧密的
结构变得疏松，利于纤维素半纤维素的降解。里氏木霉和鸡腿菇混合发酵３ｄ的粗酶液在５０℃，ｐＨ４．８，１２０
３２１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
ｒ／ｍｉｎ水解玉米芯、玉米秸秆８４ｈ，酶解总糖得率为５５．２％，再利用米根霉转化水解物生成Ｌ乳酸，Ｌ乳酸产量为
３．６９ｇ／Ｌ，糖酸转化率达６７．４０％。
本试验时间进程跨度较大，外界因素，例如原材料成分中杂质，培养温度等对产酶有一定的影响，直接关系到
酶解得率，进一步影响米根霉利用水解糖产酸的量，再者由于米根霉产酸速率对温度的变化非常敏感，存在一个
最适的培养温度，超过或低于最适温度都会使产酸速率迅速下降［２４］。
本试验所用米根霉菌株是经诱变所得，具有转化六碳糖生成乳酸的稳定性质，但转化五碳糖（主要是木糖）的
性质不稳定，其产酸量与古绍彬等［２５］利用经离子注入诱变的米根霉菌种Ｒ３３０３直接利用葡萄糖发酵产Ｌ乳酸
的量及王冬梅等［６］利用玉米芯发酵产乳酸的量（７ｇ／Ｌ）有一定差距，需要进一步驯化，得到性质稳定的高效利用
秸秆的菌株。
本试验以农业废弃物为原料，通过微生物混合发酵制取Ｌ乳酸，提取乳酸后的残余物含有较高的菌体蛋白，
多种氨基酸、有机酸作为饲料［２６，２７］，可以提高适口性。这种模式可以较好的利用农业废弃物质，减少环境污染，
但是乳酸产量低，生产过程较为复杂，仍控制着这种生产方法的实际可行性，仍有很多工作需要继续研究。
试验结果说明，以玉米秸秆、玉米芯等农业废弃物为原料，采用微生物混合发酵产乳酸是可行的，为处理农业
废弃物提供一个可供参考的生物学方法，为提高农业废弃物综合利用提供又一可行性思路。
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４２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
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（１．ＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｓｔＣｏｎｔｒｏｌ，ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ
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５２１第１９卷第６期 草业学报２０１０年