全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０４１０ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
赵萌，魏小红．吸胀冷害下外源ＮＯ对紫花苜蓿种子萌发及抗氧化性的影响．草业学报，２０１５，２４（４）：８７９４．
ＺｈａｏＭ，ＷｅｉＸＨ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｉｍｂｉｂｉｔｉｏｎａｌｃｈｉｌｉｎｇ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（４）：
８７９４．
吸胀冷害下外源犖犗对紫花苜蓿
种子萌发及抗氧化性的影响
赵萌，魏小红
（甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：用浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ外源ＮＯ供体硝普钠（ｓｏｄｉｕｍｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ，ＳＮＰ）处理４℃吸胀冷害下紫花苜蓿种子，
来探讨吸胀冷害下ＮＯ对紫花苜蓿种子萌发及氧化损伤的影响。试验设计４个处理，分别为 Ａ：对照组（ＣＫ）为蒸
馏水；Ｂ：４℃吸胀冷害组（Ｃｈｉｌｉｎｇ）；Ｃ：ＳＮＰ；Ｄ：Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ，每个处理重复３次。结果表明：１）紫花苜蓿种子经
ＳＮＰ处理１２ｈ转入２５℃继续培养８４ｈ后，Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组比Ｃｈｉｌｉｎｇ组发芽率、活力指数、发芽指数提高了
１４．３７％，３４．１７％，１．２９％。２）４℃吸胀冷害１２ｈ后，Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组同Ｃｈｉｌｉｎｇ组相比超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过
氧化氢酶（ＣＡＴ）活性分别提高了１４９．２６％，６０．３５％，过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）含量及超氧阴离子（·Ｏ２－）产生速率则降
低了１０．１１％，２７．６１％。３）ＳＮＰ对４℃吸胀冷害１２，２４和４８ｈ的种子体内羟自由基（·ＯＨ）的清除均呈下降趋势，
Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组的清除率均高出ＳＮＰ组，Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组在冷害１２ｈ时清除率达最大值９７．５％。综上所述，施
加外源ＮＯ能促进种子的萌发，提高抗氧化酶活性，降低了活性氧对种子造成的伤害。
关键词：一氧化氮；紫花苜蓿；吸胀冷害；抗氧化性　　
犈犳犳犲犮狋狊狅犳狀犻狋狉犻犮狅狓犻犱犲狅狀 犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪狊犲犲犱犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉犻犿犫犻犫犻狋犻狅狀犪犾
犮犺犻犾犻狀犵
ＺＨＡＯＭｅｎｇ，ＷＥＩＸｉａｏＨｏｎｇ
犛犮犺狅狅犾狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲牔犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｓｅｅｄｓｏｆ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆ０．１ｍｍｏｌ／Ｌｓｏｄｉｕｍｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ（ＳＮＰ），
ａｓａｓｏｕｒｃｅｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ｏｎｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙｕｎｄｅｒｉｍｂｉｂｉｔｉｏｎａｌｃｈｉｌｉｎｇａｔ４℃．Ｆｏｕｒ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ，ｃｈｉｌｉｎｇ，ＳＮＰａｎｄｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰｗｅｒｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｄｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ
ａｆｔｅｒｉｍｂｉｂｉｔｉｏｎａｌｃｈｉｌｉｎｇｆｏｒ１２ｈａｎｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｔ２５℃ｆｏｒ８４ｈ，ｔｈｅｖｉｇｏｒａｎｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ犕．狊犪狋犻狏犪
ｓｅｅｄｓｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙＳＮＰｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ
（ＳＯＤ）ａｎｄｃａｔａｌａｓｅ（ＣＡＴ）ｉｎｃｒｅａｓｅｄ１４９．３％ｔｏ６０．４％ｂｙＳＮＰｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒａｄｉｃａｌｃｌｅａｒａｎｃｅｒａｔｅｔｅｎｄｅｄ
ｔｏｄｅｃｌｉｎｅｗｉｔｈＳＮＰｔｒｅａｔｍｅｎｔｓａｎｄｃｈｉｌｉｎｇｆｏｒ１２，２４ａｎｄ４８ｈ．Ａｔ１２ｈｃｈｉｌｉｎｇｔｈｅｒａｄｉｃａｌｃｌｅａｒａｎｃｅｒａｔｅ
ｒｅａｃｈｅｄａｍａｘｉｍｕｍｏｆ９７．５％．Ｉｍｐｏｓｉｎｇｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｃａｎｐｒｏｍｏｔｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｅｎｈａｎｃｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ
ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｄａｍａｇｅｉｎ犕．狊犪狋犻狏犪ｓｅｅｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ；犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｓｅｅｄ；ｃｈｉｌｉｎｇｉｍｂｉｂｉｔｉｏｎ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ
第２４卷　第４期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年４月
Ａｐｒｉｌ，２０１５
收稿日期：２０１４０３２１；改回日期：２０１４０４２２
基金项目：甘肃省自然基金（１４５ＲＪＺＡ１９６）资助。
作者简介：赵萌（１９８７），女，陕西黄陵人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：７４１８２８０３８＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｗｅｉｘｈ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是一种多年生优质豆科草本植物，被誉为“牧草之王”，是世界上分布最广的豆
科牧草，也是我国北方等地种植面积最大的人工牧草，其营养价值高、适口性好是牛羊等牲畜的重要饲料［１］。种
子萌发过程是从吸胀开始的，当种子在吸胀过程中受到低温或是冷害胁迫时就会产生吸胀冷害现象［２］，这种现象
一般发生在高寒地带和低温冷湿地区早播时，但在干旱地区进行早春灌溉播种时也会发生。轻者影响种苗活力，
导致出苗迟缓不齐，降低成苗率，减弱幼苗长势；重者种子失去发芽能力，造成大面积缺苗乃至重播［３］。在我国北
方由于高纬度，高海拔，对大多数植物的种植来说抗冷性普遍不强，尤其是在种子的萌发过程中，这一问题已逐渐
成为制约我国北方牧草种子萌发、产量增加及草地可持续利用的关键。因此提高紫花苜蓿抗冷性对草地的利用
率和苜蓿的扩再大生产都有重要意义［４］。
一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ＮＯ）是一种稳定的气体信号分子，在植物生长发育及其对逆境的响应等方面起着重
要的调节作用［５］，能够使非生物胁迫条件下的植物生长发育免受活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）的伤害，
且其效应与植物细胞的生理条件及ＮＯ处理浓度有关［６］。较低浓度的ＮＯ对植物细胞具有保护作用，而较高浓
度却表现为毒害效应［７８］。ＮＯ还可通过控制植物ＣＯ２ 固定、水分散失、气孔开张、根系形态重建等一系列生理
活性来适应环境［９］。ＳＮＰ（硝普钠）是一种常用的外源 ＮＯ供体，通常０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＳＮＰ大约可产生０．２
μｍｏｌ／Ｌ的ＮＯ
［１０］。有研究表明，外源ＮＯ既能缓解盐胁迫的氧化损伤［１１］，又能缓解盐胁迫对玉米（犣犲犪犿犪狔狊）生
长的抑制作用［１２］，还能显著降低渗透胁迫下小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）种子的萌发［１３］，对干旱胁迫下的苜蓿幼苗
抗氧化酶活性也有一定的影响［１４］，近年来国内关于 ＮＯ 提高植物的抗吸胀冷害研究见于玉米［１５］，棉花（犌狅狊
狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿）［１６］，番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）［１７］，马向丽等［１８］研究发现，外源一氧化氮可以缓解低温下
黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）幼苗质膜相对透性的增加，提高了保护酶活性，而利用外源ＮＯ缓解苜蓿抗吸胀冷害的
研究鲜有报道。本研究通过外源ＮＯ处理吸胀冷害下的紫花苜蓿种子，从种子的萌发、根系活力、抗氧化酶活性
和对活性氧的清除４个方面进行研究，探讨了吸胀冷害下外源ＮＯ对紫花苜蓿种子萌发和抗氧化性的影响，为苜
蓿的种植及抗寒性研究提供了一定的理论基础和调控措施。
１　材料与方法
１．１　材料、试剂
供试材料为紫花苜蓿，品种为“阿尔冈金”，购买于甘肃农业科学院种子公司。本实验于２０１３年３－５月在甘
肃农业大学生命科学技术学院植物生理实验室进行。ＮＯ供体ＳＮＰ浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ［１５，１７，１９］。
１．２　材料培养与处理
种子４℃吸胀冷害处理：挑选大小一致、饱满的紫花苜蓿种子用０．１％ ＨｇＣｌ２ 溶液消毒３ｍｉｎ之后立即用清
水冲洗干净，再用去离子水冲洗３～５遍。将种子置于９ｃｍ垫有２层滤纸的培养皿中，每皿放置５０粒，３个重
复。吸胀冷害处理分别加４ｍＬ蒸馏水和４ｍＬ０．１ｍｍｏｌ／ＬＳＮＰ，４℃冰箱中暗培养１２ｈ；未冷害处理于２５℃温
箱暗培养。
试验设计４个处理：Ａ：对照组为蒸馏水（ＣＫ）；Ｂ：４℃吸胀冷害（Ｃｈｉｌｉｎｇ）；Ｃ：ＳＮＰ；Ｄ：Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ，每个处
理设３个重复。
萌发试验材料培养：将Ｂ、Ｄ两种处理的种子于４℃暗培养１２ｈ后转入２５℃恒温箱继续暗培养，Ａ、Ｃ处理的
种子一直于２５℃恒温暗培养。以胚根０．２ｃｍ作为发芽标志，每天统计发芽率，共统计４ｄ。第４天测定发芽率、
活力指数、发芽指数，重复３次。
抗氧化性试验材料培养：将已经处理的紫花苜蓿种子置于垫有２层滤纸的培养皿中，暗培养１２ｈ，然后从以
上４种处理中分别称取０．５ｇ种子用于测定ＳＯＤ、ＣＡＴ的活性和 Ｈ２Ｏ２ 含量与·Ｏ２－产生速率，ＳＮＰ对·ＯＨ
的清除只针对Ｃ、Ｄ两个处理，分别进行１２，２４，４８ｈ暗培养，然后再进行测定。
１．３　试验方法
１．３．１　种子萌发测定　　
发芽率（％）＝（发芽种子数／供试种子数）×１００％
８８ 草　业　学　报 第２４卷
发芽指数犌犻＝∑（犌狋／犇狋）
活力指数犞犻＝犌犻×犛狓
式中，犌犻为发芽指数，犌狋为在时间狋日的发芽数，犇狋为相应发芽日数，犛狓 为第４天的根长。
１．３．２　种子根系活力测定　　ＴＴＣ法测定种子根系活力，参照植物生理学实验指导［２０］，略有改动。试验进行
到第４天，称取根组织０．５ｇ，放入试管中（对照试验先加２ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４ 再加入根，其他操作相同），加入
０．５％ ＴＴＣ溶液５ｍＬ，１／１５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．８的磷酸缓冲液５ｍＬ，３７℃水浴４０ｍｉｎ，此后加入１ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４２
ｍＬ，以终止反应。取出根，吸干水分后加入４ｍＬ乙酸乙酯与少量石英砂一起研磨，以提出ＴＴＦ。把红色提取液
移入试管，用５ｍＬ乙酸乙酯清洗残渣，皆移入试管，最后用乙酸乙酯定容至１０ｍＬ，以对照做空白，在４５８ｎｍ下
测定吸光值。
ＴＣＣ还原量（μｇ）＝ＴＣＣ浓度（查标曲）×提取液总体积
ＴＣＣ还原强度（ｍｇ／ｇ·ｈ）＝ＴＣＣ还原量／（根鲜重×时间）
１．３．３　种子萌发中抗氧化酶活性的测定　　１）粗酶的提取：参照翟飞飞［２１］的方法，并稍作改动。每组称取０．５
ｇ吸胀１２ｈ的种子，用蒸馏水冲洗表面处理液，滤纸擦干，加０．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．８的磷酸缓冲液５ｍＬ进行冰浴
研磨，匀浆离心，于１５０００ｒ／ｍｉｎ冷冻离心１０ｍｉｎ，取上清液保存于４℃备用。
２）过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性：采用紫外吸收法［２０］，略有改动。配制的反应混合液（反应体系含有０．０５ｍｏｌ／Ｌ
的ｐＨ７．８的磷酸缓冲液１．５ｍＬ，１ｍＬ的０．３％ Ｈ２Ｏ２，０．５ｍＬ的酶液和１ｍＬ蒸馏水），在２４０ｎｍ处测定吸光
度以０．０３９ｍｍｏｌ／（Ｌ·ｃｍ）Ｈ２Ｏ２ 的减少量作为１个消光系数。
３）超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性：采用ＮＢＴ光还原法［２０］，并稍作改动。配制３．２ｍＬ的反应混合液（反应体
系含有０．０５ｍｏｌ／Ｌ的ｐＨ７．８的磷酸缓冲液１．５ｍＬ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡＮａ２０．３ｍＬ，０．１３ｍｍｏｌ／Ｌ甲硫氨
酸０．３ｍＬ，０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ的氮蓝四唑０．３ｍＬ，０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ的核黄素０．３ｍＬ和０．５ｍＬ的蒸馏水），加入０．３
ｍＬ酶液后在强光下光照１５ｍｉｎ，之后在５６０ｎｍ处测定吸光值，其中ＳＯＤ活性以抑制氮蓝四唑５０％为１个酶
活性单位。
１．３．４　种子中活性氧指标及测定　　１）过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）含量：Ｈ２Ｏ２ 含量测定采用紫外分光光度法，参照植物
生理学实验指导［２０］。样品种子加预冷的丙酮提取，取１ｍＬ的提取液加５％硫酸钛和浓氨水，之后在３０００ｒ／ｍｉｎ
离心１０ｍｉｎ，沉淀再用丙酮悬浮洗涤５次后，将沉淀溶于５ｍＬ２ｍｏｌ／Ｌ的硫酸中，在４１５ｎｍ下测定吸光值。
２）超氧阴离子（·Ｏ２－）产生速率：·Ｏ２－产生速率测定参照王爱国和罗光华［２２］的方法，有改动。１ｇ种子用
３ｍＬｐＨ７．８磷酸缓冲液进行冰浴研磨，然后再加入２ｍＬ缓冲液倒入离心管中，用４ｍＬ清洗研钵倒入离心管
中，４℃下１００００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液２ｍＬ，加入２ｍＬ磷酸缓冲液，１ｍＬ盐酸羟胺溶液，摇匀，在２５℃
下保温１ｈ，然后依次加入１ｍＬ对氨基苯磺酸溶液和１ｍＬα萘胺，快速混匀再在２５℃下保温２０ｍｉｎ，３０００
ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，以水调０，取粉色水相５３０ｎｍ下测定吸光值。
１．３．５　ＳＮＰ对种子中·ＯＨ的清除能力测定　　对种子中·ＯＨ的清除能力测定参照付莉和彭威威［２３］的方
法，有改动。在１０ｍＬ试管中，依次加入１．５ｍＬ９ｍｍｏｌ／ＬＦｅＳＯ４ 溶液，１．５ｍＬ９ｍｍｏｌ／Ｌ水杨酸－乙醇溶液，
２ｍＬ提取液（ｐＨ７．８的磷酸缓冲液提取），３．５ｍＬｐＨ７．８磷酸缓冲液，最后加入１．５ｍＬ３０％ Ｈ２Ｏ２ 启动反
应，３７℃水浴反应３０ｍｉｎ，在５１０ｎｍ波长下测吸光值。
·ＯＨ自由基清除率（％）＝［１－（犃ｉ－犃ｊ）／犃０］×１００
式中，蒸馏水代替提取液测定值为犃０，为空白对照，蒸馏水代替Ｈ２Ｏ２ 测定值为犃ｊ，犃ｉ为加入提取液反应体系的
吸光值。
１．４　数据处理
所有数据均取３次重复平均值。用Ｅｘｃｅｌ２００７软件处理数据和绘图，ＳＰＳＳ１７．０统计分析软件进行数据分
析及差异显著性检验。
９８第４期 赵萌　等：吸胀冷害下外源ＮＯ对紫花苜蓿种子萌发及抗氧化性的影响
２　结果与分析
２．１　外源ＮＯ对吸胀冷害下紫花苜蓿种子萌发的影响
从表１可知，４℃吸胀冷害下紫花苜蓿种子的发
芽率、发芽指数、活力指数，同 ＣＫ 相比分别下降了
５．５６％，２３．２９％，３６．０８％（犘＜０．０５），经ＳＮＰ处理
后，分别提高了１４．２９％，３１．２９％，１．２９％（犘＜０．０５）；
此外，ＳＮＰ组、Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组与ＣＫ比发芽率也有
所提高，为３．１９％，７．９４％，但差异不显著。说明吸胀
冷害对种子的萌发有抑制作用，通过施加外源ＮＯ不
但能促进吸胀冷害下紫花苜蓿种子的萌发，而且对正
常情况下紫花苜蓿种子的萌发也有一定的促进作用。
２．２　外源ＮＯ对吸胀冷害下紫花苜蓿种子根系活力
的影响
外源ＮＯ对常温及吸胀冷害下紫花苜蓿种子根系
活力的影响见图１。同ＣＫ比，Ｃｈｉｌｉｎｇ组根系活力降
低了３４．９５％（犘＜０．０５），经过ＳＮＰ处理（Ｃｈｉｌｉｎｇ＋
ＳＮＰ）根系活力提高了１５４．３５％（犘＜０．０５）；ＳＮＰ组
与ＣＫ相比根系活力升高了１１４．５％（犘＜０．０５）。可
见外源ＮＯ对常温及吸胀冷害下紫花苜蓿种子根系活
力均有一定的促进作用，以吸胀冷害下尤为突出。
表１　犛犖犘对正常及吸胀冷害下紫花苜蓿种子萌发的影响
犜犪犫犾犲１　犈犳犳犲犮狋狅犳犛犖犘狅狀狊犲犲犱犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
狌狀犱犲狉狀狅狉犿犪犾犪狀犱４℃犻犿犫犻犫犻狋犻狅狀犪犾犮犺犻犾犻狀犵
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
发芽率
Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（％）
发芽指数
Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｉｎｄｅｘ
活力指数
Ｖｉｇｏｒｉｎｄｅｘ
Ａ（ＣＫ） ８４．００±０．０４ａｂ ２４．００±２．１８ａ ７０．５６±２．３７ａ
Ｂ（Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＣＫ） ７９．３３±０．０８ａ １８．４１±２．１５ｂ ４５．１０±０．６４ｂｃ
Ｃ（ＳＮＰ） ８６．６７±０．０４ａｂ ２５．３３±２．０１ａ ４９．９０±２．４１ｂ
Ｄ（Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ）９０．６７±０．０３ｂ ２４．１７±１．３７ａ ４５．６８±２．７２ｃ
　注：同列不同字母表示差异显著（犘＜０．０５）。
　Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ．
图１　犛犖犘对常温及吸胀冷害下紫花苜蓿种子根系活力的影响
犉犻犵．１　犈犳犳犲犮狋狅犳犛犖犘狅狀狉狅狅狋狊犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
狌狀犱犲狉狀狅狉犿犪犾犪狀犱４℃犻犿犫犻犫犻狋犻狅狀犪犾犮犺犻犾犻狀犵
　　　图中不同字母表示差异显著（犘＜０．０５），下同。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．３　外源ＮＯ对吸胀冷害下紫花苜蓿种子抗氧化酶
的影响
从图２，图３可看出，外源ＮＯ对紫花苜蓿种子常
温及吸胀冷害下ＳＯＤ、ＣＡＴ活性的影响变化一致。
常温下经ＳＮＰ处理的种子同ＣＫ比较，ＳＯＤ和ＣＡＴ
酶活性分别提高了５８．６２％，６２．６８％（犘＜０．０５），Ｃｈｉｌｉｎｇ组同ＣＫ相比，ＳＯＤ、ＣＡＴ酶活性分别降低了５７．
６６％，２４．６７％（犘＜０．０５），经ＳＮＰ处理后，两种酶活性均显著提高了１４９．２６％，６０．３５％（犘＜０．０５）。说明外源
ＮＯ能提高紫花苜蓿种子ＳＯＤ、ＣＡＴ酶活性，缓解了吸胀冷害对紫花苜蓿种子的氧化损伤。
图２　犛犖犘对正常及吸胀冷害下苜蓿种子犛犗犇活性的影响
犉犻犵．２　犈犳犳犲犮狋狅犳犛犖犘狅狀犛犗犇犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
狌狀犱犲狉狀狅狉犿犪犾犪狀犱４℃犻犿犫犻犫犻狋犻狅狀犪犾犮犺犻犾犻狀犵　
图３　犛犖犘对正常及吸胀冷害下苜蓿种子犆犃犜活性的影响
犉犻犵．３　犈犳犳犲犮狋狅犳犛犖犘狅狀犆犃犜犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
狌狀犱犲狉狀狅狉犿犪犾犪狀犱４℃犻犿犫犻犫犻狋犻狅狀犪犾犮犺犻犾犻狀犵　
０９ 草　业　学　报 第２４卷
２．４　外源ＮＯ对吸胀冷害下紫花苜蓿种子Ｈ２Ｏ２ 含量及·Ｏ２－产生速率的影响
当紫花苜蓿种子处理１２ｈ后，各处理Ｈ２Ｏ２ 含量与·Ｏ２－产生速率变化趋势有所不同，见图４，图５。同ＣＫ
相比，Ｃｈｉｌｉｎｇ组 Ｈ２Ｏ２ 含量与·Ｏ２－产生速率增大了２３．８８％，４７．７８％（犘＜０．０５），经过ＳＮＰ处理后 Ｈ２Ｏ２ 含
量与·Ｏ２－产生速率分别降低了１０．１１％，２７．６１％（犘＜０．０５）；与ＣＫ相比，ＳＮＰ组 Ｈ２Ｏ２ 含量提高了３．７１％，
·Ｏ２－产生速率降低了５．４９％（犘＜０．０５）。说明，外源 ＮＯ能降低吸胀冷害下紫花苜蓿种子 Ｈ２Ｏ２ 含量与
·Ｏ２－产生速率，具有清除活性氧自由基的能力。
图４　犛犖犘对正常及吸胀冷害下苜蓿种子犎２犗２ 含量的影响
犉犻犵．４　犈犳犳犲犮狋狅犳犛犖犘狅狀狋犺犲犮狅狀狋犲狀狋狅犳犎２犗２狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
狌狀犱犲狉狀狅狉犿犪犾犪狀犱４℃犻犿犫犻犫犻狋犻狅狀犪犾犮犺犻犾犻狀犵　
　图５　犛犖犘对正常及吸胀冷害下苜蓿种子·犗２－产生速率的的影响
犉犻犵．５　犈犳犳犲犮狋狅犳犛犖犘狅狀狋犺犲狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳·犗２－狅犳
犕．狊犪狋犻狏犪狌狀犱犲狉狀狅狉犿犪犾犪狀犱４℃犻犿犫犻犫犻狋犻狅狀犪犾犮犺犻犾犻狀犵　
２．５　外源ＮＯ对吸胀冷害下苜蓿种子·ＯＨ的清除
图６　犛犖犘对紫花苜蓿种子·犗犎的清除作用
犉犻犵．６　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犛犖犘狅狀狋犺犲·犗犎犮犾犲犪狉犪狀犮犲
狉犪狋犲狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
作用
外源ＮＯ对紫花苜蓿种子不同时间处理的·ＯＨ
清除作用见图６，随着处理时间的增加ＳＮＰ对·ＯＨ
的清除依次降低，Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组的清除速率均高
出ＳＮＰ组。在１２ｈ时，ＳＮＰ对·ＯＨ的清除达到最
大９７．５％（犘＜０．０５），Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组比ＳＮＰ组高
出１０７．９％（犘＜０．０５）。在１２ｈ到４８ｈ阶段，吸胀冷
害下 ＳＮＰ 对 ·ＯＨ的清除分别降低了 ２７．４８％，
１１．３１％（犘＜０．０５），而常温下ＳＮＰ对·ＯＨ的清除分
别降低了２７．２９％，３３．４３％（犘＜０．０５）。说明ＳＮＰ对
紫花苜蓿种子正常及吸胀冷害下·ＯＨ都有一定的清
除作用，但是在吸胀冷害下清除作用最强。
３　讨论
研究表明，一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ＮＯ）是一种信号分子，可以减少非生物胁迫下植物体内活性氧（ＲＯＳ）的积
累，促进种子萌发与植物的抗性反应，缓解各种胁迫造成的氧化损伤，从而增强种子的适应能力［１］。本实验就通
过施加外源ＮＯ（ＳＮＰ）来缓解吸胀冷害下紫花苜蓿种子萌发及氧化损伤。
３．１　外源ＮＯ对吸胀冷害下紫花苜蓿种子萌发的影响
在植物生长的整个生育期中，种子萌发期是对外界刺激最敏感的阶段，决定着作物的生长及产量［２４］。当植
物受到低温甚至冷害胁迫时，吸胀冷害就会是一个普遍发生的事件，它会直接导致种子萌发率下降，出苗率低，幼
苗活力差，生长发育不正常，导致最终减产。杨美森等［１６］对棉花种子低温吸胀期间发芽能力的研究发现，低温吸
胀下种子的发芽率会下降，经浓度为０．１ｍｍｏｌ／ＬＳＮＰ处理后种子的发芽率会显著升高；谷文英等［２５］在对菊苣
１９第４期 赵萌　等：吸胀冷害下外源ＮＯ对紫花苜蓿种子萌发及抗氧化性的影响
（犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊）研究中也发现，ＮＯ对种子萌发具有调节作用［２６］，用浓度为０．２ｍｍｏｌ／ＬＳＮＰ处理盐胁迫下
的种子各项萌发指标均显著高出其盐对照组。在本研究中发现，经浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮＯ供体ＳＮＰ处理后
的种子，在４℃吸胀冷害（Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ）１２ｈ后再转到２５℃继续萌发，其发芽率、活力指数和发芽指数同Ｃｈｉｌ
ｉｎｇ组相比较均有所提高了；此外，ＳＮＰ组、Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组与ＣＫ相比，发芽率和发芽指数也有所提高，但是活
力指数却有所下降（表１），从根系活力角度分析（图１），Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ组比Ｃｈｉｌｉｎｇ组，ＳＮＰ组、Ｃｈｉｌｉｎｇ＋ＳＮＰ
组同ＣＫ相比均有所提高。说明，吸胀冷害对紫花苜蓿种子萌发有抑制作用，虽然对根长也有一定的影响，但是
通过施加外源ＮＯ，不仅能提高种子的萌发，而且对于根系活力也有很强的促进作用，所以不能只从活力指数方
面来判断紫花苜蓿种子的生长状况，应该同萌发率和根系活力综合起来衡量外源ＮＯ对正常及吸胀冷害下紫花
苜蓿种子萌发的影响。这与李艳艳和贺军民［１７］对番茄种子的研究结果一致。
３．２　外源ＮＯ对吸胀冷害下紫花苜蓿种子抗氧化性酶及活性氧的影响
通常，细胞内的活性氧水平的升高和累积可对种子造成氧化胁迫，引起一系列对细胞结构的破坏，导致细胞
损伤甚至死亡［２７］。而在逆境胁迫下，植物可以调动起保护系统的酶类来抵御和清除活性氧，阻止膜脂过氧化，维
持膜系统的稳定性。许多研究表明，超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和过氧化氢酶（ＣＡＴ）可在植物体内组建成一个清除
系统，有效地清除植物体内的自由基和过氧化物，是防御膜脂过氧化作用的重要保护酶［２８］，这些抗氧化酶类还能
通过增加其酶量的表达和提高自身活性来避免导致膜脂过氧化 Ｈ２Ｏ２ 和自由基的大量生成，以提高种子的抗
性［２９］，因而对植物的保护起着非常重要的作用。本实验结果表明：经过浓度为０．１ｍｍｏｌ／ＬＳＮＰ处理，提高了种
子ＳＯＤ和ＣＡＴ的活性，这对有效降低吸胀冷害下种子内活性氧水平发挥着积极作用。
正常情况下，植物依靠抗氧化系统能够保持活性氧的产生和清除，当植物遭受环境胁迫时，会打破活性氧代
谢平衡，使活性氧大量产生并积累［３０］，而·Ｏ２－是活性氧中最丰富的一种［５］。屠洁等［３１］在２００３年发现ＳＮＰ对
·Ｏ２－有一定的清除功能。所以在本实验中发现，同ＣＫ相比用０．１ｍｍｏｌ／ＬＳＮＰ处理的紫花苜蓿种子·Ｏ２－
产生速率略微降低，而在吸胀冷害下，ＳＮＰ则明显降低了·Ｏ２－产生速率，同时也诱导ＳＯＤ活力的上升，而且
·Ｏ２－含量的变化与ＳＯＤ活力的变化相对应。
Ｃｌａｒｋ等［３２］推测ＮＯ可通过直接与血红素铁结合形成铁离子－亚硝酰基复合物来可逆抑制烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪
狋犪犫犪犮狌犿）叶片ＣＡＴ的活力，在本实验中也发现在正常生长条件下，ＮＯ供体ＳＮＰ处理后，种子内ＣＡＴ活性有所
提高，同对照组相比高出了６２．６８％；进一步研究表明，在吸胀冷害下ＳＮＰ也能缓解苜蓿种子Ｈ２Ｏ２ 的积累，主要
与其可以提高ＣＡＴ的活力有关。已经知道Ｈ２Ｏ２ 可与ＣＡＴ形成一种复合物，使ＣＡＴ钝化，这些ＣＡＴ的钝化
形式可以抑制ＣＡＴ的活力［３３］，这与阮海华等［１１］对小麦叶片的研究结果是一致的。常温下经ＳＮＰ处理的紫花苜
蓿种子Ｈ２Ｏ２ 同ＣＫ相比提高了，可能是ＮＯ与 Ｈ２Ｏ２ 产生了互调控作用，进行了ＣｒｏｓｓＴａｌｋ［３４］，Ｈ２Ｏ２ 作为了
一种信号物质对植物产生了响应，微量提高是对植物有益的。
·ＯＨ自由基具有高度的活泼性和极强的氧化性，过多积累会对植物组织细胞中生物大分子化学结构造成
破坏，使机体受到损伤，从而引起一系列反应。在本实验中，外源 ＮＯ供体ＳＮＰ就发挥了清除剂的作用，对
·ＯＨ自由基有一定的清除作用。从图６可知，在正常情况下，ＳＮＰ对·ＯＨ自由基也有一部分的清除，但是没
有经过吸胀冷害后的清除效率高，随着处理时间的增大，清除率逐渐降低，说明，当种子处理１２ｈ时受到的冷害
程度最大，同时也说明了种子吸胀是发生在最初的１２ｈ，此时也伴随产生大量的自由基，通过ＳＮＰ处理后，均表
现出对·ＯＨ很好地清除，从而缓解吸胀冷害对苜蓿种子带来的氧化损伤。
综上所述，０．１ｍｍｏｌ／ＬＳＮＰ可以提高吸胀冷害下紫花苜蓿种子的萌发及根系活力，而且还可以保护抗氧化
酶活性，降低活性氧的产生及积累，有效地缓解了吸胀冷害对种子带来的伤害，从而提高了种子的抗性。然而，苜
蓿种子对于这样一个吸胀冷害响应肯定是一个很精细的过程，涉及了许多复杂的信号转导途径，不单单是以上的
这些因子引起的生理生化过程，可能还会受到一些基因的影响，在以后的实验中会做进一步研究。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＺｈｅｎｇＧＨ，ＬｉａｎｇＺ，ＬｉｎＪ．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｉｍｂｉｂｉｔｉｏｎａｌｃｈｉｌｉｎｇｉｎｊｕｒｙｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｏｓｍｏｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ．ＢｕｌｅｔｉｎｏｆＴｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ
２９ 草　业　学　报 第２４卷
ｅｎｃｅｓ，２００１，３：１８２１８７．
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ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（５）：１４５１５３．
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ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００４，３０（４）：４５５４５９．
［１３］　ＺｈａｎｇＨ，ＳｈｅｎＷＢ，ＸｕＬＬ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｗｈｅａｔｓｅｅｄｓａｎｄｉｔｓｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓｕｎｄｅｒｏｓ
ｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００３，４５（８）：９０１９０５．
［１４］　ＪｉａｎｇＹＢ，ＹａｎｇＹＲ，ＺｈｅｎｇＱＨ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎａｎｔｉｏｘｉｄａｓｅａｎｄｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｓｅｅｄｌｉｎｇｏｆａｌｆａｌｆａｕｎｄｅｒ
ｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｈｅＡｒｉｄＡｒｅａｓ，２００８，２６（２）：６５６８．
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ｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｏＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３１（２）：２７０２７７．
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ｂｉｂｉｔｉｏｎ．ＣｏｔｔｏｎＳｃｉｅｎｃｅ，２０１２，２４（３）：２６５２７１．
［１７］　ＬｉＹＹ，ＨｅＪＭ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｏｎｔｏｍａｔｏｓｅｅｄｓｒｅｓｉｓｔｉｎｇａｇａｉｎｓｔｃｈｉｌｉｎｇｉｍｂｉｂｉｔｉｏｎ．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＢｏｒｅａｌｉＯｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａＳｉｎｉｃａ，２００８，
２８（４）：０７０９０７１７．
［１８］　ＭａＸＬ，ＷｅｉＸＨ，ＬｏｎｇＲＪ，犲狋犪犾．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｅｎｈａｎｃｉｎｇｔｈｅｃｈｉｌｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆａｎｎｕａｌｒｙｅｇｒａｓｓｂｙｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ．
ＡｃｔａＥｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００５，２５（６）：１２６９１２７４．
［１９］　ＲｕａｎＨＨ，ＳｈｅｎＷＢ，ＸｕＬＬ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｎｏｄｏｎｏｒｏｎｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍｉｎｗｈｅａｔｓｅｅｄｌｉｎｇｌｅａｆｕｎ
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［２１］　ＺｈａｉＦＦ，ＨａｎＬ，ＬｉｕＪＸ，犲狋犪犾．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｍｕｔａｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎｓｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｕｎｄｅｒａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ．
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［２３］　ＦｕＬ，ＰｅｎｇＷ Ｗ．ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＲｅｄＰｉｇｍｅｎｔｆｒｏｍｐｕｒｐｌｅｅｇｇｐｌａｎｔｐｅｅｌ．ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｅｔｉｎ，
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［２４］　ＬｕＹＭ，ＳｕＣＱ，ＬｉＨＦ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｌｔｓｓｔｒｅｓｓｏｎｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｓｅｅｄｌｉｎｇｇｒｏｗｔｈｏｆ犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅ
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［２７］　ＬｉＣＺ，ＪｉａｏＪ，ＷａｎｇＧＸ．Ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｉｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｅｔｈｙｌｅｎｅａｎｄｐｏｌｙａｍｉｎｅｓｉｎｌｅａｖｅｓｏｆ
ｓｐｒｉｎｇｗｈｅａｔｓｅｅｄｉｎｇｓｕｎｄｅｒｒｏｏｔｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００４，１６６：３０３３１５．
［２８］　ＳｈａｎｇＱＭ，ＣｈｅｎＳＦ，ＺｈａｎｇＺＧ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｌｅｎｉｕｍｏｎａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓａｃｔｉｖｉｔｙｉｎＰｅｐｐｅｒｌｅａｖｅｓｕｎｄｅｒｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ．
ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２００５，３２（１）：３５３８．
［２９］　ＬｉｕＸＪ，ＬｉｕＸＮ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐａｃｌｏｂｕｔｒａｚｏｌａｎｄｕｎｉｃｏｍａｚｏｌｅｏｎｓｏｍｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆ犘狅犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊．ＡｃｔａＰｒａｔ
ａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２００６，１５（２）：４８５３．
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４９ 草　业　学　报 第２４卷