全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（２）：１９１ １９５
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０２０１９１０５
白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞 Ｓｆ９中的表达
亓 倩，于淑惠，孙 涛，王雪庆，刘博文，杨 璞，陈晓鸣
（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 ６５０２２４）
收稿日期：２０１５１１１５
基金项目：林业公益性行业科研专项２０１５０４３０２、２０１３０４８０８，云南省应用基础研究重点项目２０１３ＦＡ０５２，国家自然科学基金３１５７２３３７，
国家８６３计划２０１４ＡＡ０２１８０１。
作者简介：亓 倩（１９９１—），女，硕士研究生，主要从事昆虫分子生物学研究．
通讯作者．
摘要：［目的］本研究欲利用ＢａｃｔｏＢａｃ表达系统，在Ｓｆ９细胞中表达ＷＳ。［方法］将ＷＳ编码序列克隆到质粒ｐＦａｓｔ
ＢａｃＴＭＨＴＢ后，转化大肠杆菌ＤＨ１０ＢａｃＴＭ，经抗性和蓝白斑筛选，获得重组杆粒 ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ。将 ｒＢａｃｍｉｄ／Ｅｐｅｌ
ＷＳ转染Ｓｆ９细胞。［结果］免疫荧光标记检测表明：ＷＳ在受感染细胞的细胞质中表达。［结论］本研究成功表达了
白蜡虫ＷＳ，为白蜡虫ＷＳ的生化特性研究奠定了基础。
关键词：白蜡虫；蜡酯合酶；载体构建；ＢａｃｔｏＢａｃ表达系统；Ｓｆ９细胞系
中图分类号：Ｓ８９９１ 文献标识码：Ａ
ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａＷａｘＥｓｔｅｒＳｙｎｔｈａｓｅｉｎＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａＳｆ９ＣｅｌＬｉｎｅ
ＱＩＱｉａｎ，ＹＵＳｈｕｈｕｉ，ＳＵＮＴａｏ，ＷＡＮＧＸｕｅｑｉｎｇ，ＬＩＵＢｏｗｅｎ，ＹＡＮＧＰｕ，ＣＨＥＮＸｉａｏｍｉｎｇ
（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｅｃｔｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＫｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｕｌｔｉｖａｔｉｎｇａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｅｃｔｓｏｆ
ＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＵｓｅＢａｃｔｏＢａｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｔｏｅｘｐｒｅｓｓＷＳｉｎＳｆ９ｃｅｌｌｉｎｅ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＴｈｅＷＳｃｏｄｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐｌａｓｍｉｄｐＦａｓｔＢａｃＴＭＨＴＢ，ａｎｄｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ１０ＢａｃＴＭ．Ａｆｔｅｒｒｅ
ｓｉｓｔａｎｔａｎｄｂｌｕｅｗｈｉｔｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｍｉｄｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＴｈｅｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ
ｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＳｆ９ｃｅｌｓ．［Ｒｅｓｕｌｔ］ＴｈｅＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘ
ｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｏｆｔｈｅｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｓ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＴｈｅＷＳｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ，ｉｔｌａｙｓｔｈｅｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＷＳｏｆｔｈｅＥｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａ；ｗａｘｅｓｔｅｒｓｙｎｔｈａｓｅ；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；ｂａｃｔｏｂａｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｙｓ
ｔｅｍ；Ｓｆ９ｃｅｌｓｌｉｎｅｓ．
白蜡虫（ＥｒｉｃｅｒｕｓｐｅｌａＣｈａｖａｎｎｅｓ．）是一种具有
重要经济价值的资源昆虫，其 ２龄雄幼虫在女贞
（ＬｉｇｕｓｔｒｕｍｌｕｃｉｄｕｍＡｉｔ．）和白蜡树（Ｆｒａｘｉｎｕｓｃｈｉｎｅｎ
ｓｉｓＲｏｘｂ．）等寄主植物上分泌的白蜡，广泛地应用于
化工、食品、医药、化妆品等行业［１－２］。白蜡的主要
成分是二十六酸二十六酯，是由蜡酯合酶（ｗａｘｓｙｎ
ｔｈａｓｅ，ＷＳ）催化二十六酸和二十六醇形成的酯［３］。
前期工作鉴定到了白蜡虫 ＷＳ的候选基因，该基因
在白蜡虫泌蜡高峰期（二龄雄幼虫）和雌成虫中表
达量显著高于其它虫态［４－６］。系统发育分析表明，
该基因与其酰基转移酶家族的成员单酰基甘油酰基
转移酶（ｍｏｎｏａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭＧＡＴ，生成
甘油二酯）中 ＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２、ＭＧＡＴ３，二酰基甘
油酰基转移酶（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＤＧＡＴ，
生成甘油三酯）中 ＤＧＡＴ２和酰基辅酶 Ａ蜡醇酰基
转移酶（ａｃｙｌＣｏＡｗａｘａｌｃｏｈｏｌａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＷＡＴ，
生成蜡酯）中 ＡＷＡＴ１、ＡＷＡＴ２聚为一支［４］，推测白
蜡虫ＷＳ为双功能酶，但对白蜡虫 ＷＳ的生化特性
林 业 科 学 研 究 第２９卷
缺少进一步的研究［７－９］。体外获得大量白蜡虫 ＷＳ
是开展进一步功能研究的基础。
目前国内外对 ＷＳ的研究采用了多种表达系
统，Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ在贝氏不动杆菌 ＡＤＰ１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｂａｙｌｙｉｓｔｒａｉｎＡＤＰ１）中ＷＳ的研究采用毕赤酵母表达
系统［１０］，小鼠ＷＳ的研究采用哺乳动物细胞表达系
统［７］。鲜见用昆虫－杆状病毒表达系统表达ＷＳ的
文献报道。昆虫－杆状病毒表达系统具有完善的翻
译后加工修饰系统、高效表达外源基因的能力、较易
从无血清培养上清中纯化蛋白、无内毒素污染等优
点，现已成功表达近千种高价值蛋白［１１］。这些蛋白
可以来源于几乎任何组织或细胞（从细菌到高等动
物的组织细胞），也可以来自于细胞的任何位置（细
胞核、细胞外或细胞质）［１２］。本研究依据实验室前
期获得的ｗｓ全长序列，利用昆虫 －杆状病毒表达系
统对白蜡虫 ＷＳ进行表达，为进一步开展 ＷＳ酶学
特性研究奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 供试昆虫
本试验所用白蜡虫采自昆明，饲养于中国林业
科学研究院资源昆虫研究所。
１．２ 试剂
限制性内切酶 ＨｉｎｄⅢ、ＮｃｏⅠ购自 ＮＥＢ公司。Ｔ４
ＤＮＡ连接酶购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。青霉素、链霉素、庆
大霉素、购自阿拉丁公司。Ｇｒａｃｅ培养基购自 ＧＩＢＣＯ
公司、反转录试剂盒、Ｃｅｌｆｅｃｔｉｎ ＲｅａｇｅｎｔⅡ购自Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ公司。质粒小量提取试剂盒（ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ
５０ｐｒｅｐ）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（ＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ５０ｐｒｅｐ）购自 ＡＸＹＧＥＮ公司。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株
购自大连宝生物工程有限公司。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０ＴＭ菌株
和ｐＦａｓｔｂａｃＨＴＢ质粒由浙江大学祝增荣教授赠送。
类胎牛血清购自兰洲民海生物有限公司。Ｓｆ９（Ｓｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫细胞，由中国林业科学研究院
资源昆虫研究所丁伟峰老师赠送。
１．３ 试验方法
１．３．１ 白蜡虫 ｗｓ编码区克隆 取白蜡虫虫体磨
样，提取总 ＲＮＡ，反转录为 ｃＤＮＡ，根据前期获得的
白蜡虫ｗｓ全长序列，在编码框的两端设计特异引物
ＷＳＦ： ５’ＧＴＡＡＴＡＡＧＣＡＣＴＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＴＣ３’，
ＷＳＲ：５’ＡＴＣＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＧＣＣＡＡＣＣＡＴＡＣ３’。以
ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，设定程序为：９４℃预变
性４ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃９０ｓ，３２个循环；
７２℃延伸１０ｍｉｎ。１％的琼脂糖凝胶电泳检测，并切
胶回收，将纯化后的 ｗｓ编码区 ＰＣＲ产物连接到
ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体上，转化 ＤＨ５α感受态细胞，用
Ｍ１３引物进行菌液检测，选取阳性克隆送交南京金
斯瑞公司测序验证。将获得的含有白蜡虫 ｗｓ编码
区序列的重组质粒命名为ｐＧＥＭ／ＥｐｅｌＷＳ。
１．３．２ 载体构建 设计带 ＨｉｎｄⅢ和 ＮｃｏⅠ酶切位
点的引物 ＮＷＳＦ：５’ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＡＡＴＡＡＧ
ＣＡＣＴＡＧＧＡＴＴＧ３’，ＨＷＳＲ：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴ
ＣＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＧＣＣＡＡＣＣＡＴ３’，抽取含有 ｗｓ编码
序列目基因的重组质粒，以抽取的质粒为模板进行
ＰＣＲ扩增，电泳检测后用胶回收试剂盒回收纯化，测
序后，用ＨｉｎｄⅢ和ＮｃｏⅠ对ＰＣＲ产物进行双酶切，凝
胶电泳后回收酶切产物。
将ｐＦａｓｔｂａｃＴＭＨＴＢ菌株接种于 ＬＢ培养基，
３７℃、１６０转·ｍｉｎ－１震荡培养１２ｈ，用质粒小提试剂
盒抽取ｐＦａｓｔｂａｃＴＭＨＴＢ质粒，用 ＨｉｎｄⅢ和 ＮｃｏⅠ对
ｐＦａｓｔｂａｃＴＭＨＴＢ质粒进行双酶切，用琼脂糖凝胶电
泳后回收酶切产物。
将上述经双酶切的回收纯化产物与双酶切的质
粒载体于４℃连接过夜。连接产物转化 ＪＭ１０９感受
态细胞，涂布于含有１００μｇ·ｍＬ－１Ａｍｐ的 ＬＢ固体
培养基上，３７℃培养过夜，挑取合适的菌斑，用含酶
切位点的ｗｓ引物进行菌液检测。含有白蜡虫 ｗｓ的
编码序列的杆状病毒转移载体命名为ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂ／
ＥｐｅｌＷＳ。选取正确的菌液分装到数个１ｍＬ加 Ａｍｐ
的ＬＢ液体培养基中，３７℃摇床培养过夜。
１．３．３ 重组病毒杆粒的获得及鉴定 用质粒小量
提取试剂盒提取ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂ／ＥｐｅｌＷＳ质粒，获得的
质粒转化大肠杆菌 ＤＨ１０ＢａｃＴＭ感受态细胞，涂布于
含５０μｇ·ｍＬ－１卡那霉素、７μｇ·ｍＬ－１庆大霉素、１０
μｇ·ｍＬ－１四环素、１００μｇ·ｍＬ－１Ｘｇａｌ、４０μｇ·
ｍＬ－１ＩＰＴＧ的ＬＢ固体培养基上，３７℃培养过夜，使
重组质粒发生转座。挑取白色阳性菌斑过夜培养，
菌液分别用 ｗｓ特异引物和 Ｍ１３引物组合（Ｍ１３４７
Ｆ／ＷＳＲ，Ｍ１３４８Ｒ／ＷＳＦ，Ｍ１３４７Ｆ／Ｍ１３４８Ｒ）进
行检测。经鉴定为正确的杆粒命名为 ｒＢａｃｍｉｄ／
ＥｐｅｌＷＳ，用质粒小提试剂盒提取ｂａｃｍｉｄ备用。
１．３．４ 重组ｂａｃｍｉｄ转染昆虫细胞 Ｓｆ９ 病毒扩增：
接种９×１０５个细胞到２ｍＬ六孔板中。在２７℃培养
１ｈ，使细胞贴壁。制备含 ｗｓ编码区片段的 Ｂａｃｍｉｄ
与ＣｅｌｆｅｃｔｉｎＲｅａｇｅｎｔＩ复合物，逐滴滴到细胞上，在
２７℃培养箱中孵育５ｈ。去掉复合物混合液，在每个
２９１
第２期 亓 倩，等：白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞Ｓｆ９中的表达
孔中加２ｍＬ完全培养基，在２７℃培养箱中培养７２
ｈ。当细胞出现感染迹象时，收集含病毒的上清液，
即为Ｐ１病毒液。取６孔板，接种２×１０６细胞每孔，
在每个孔中加入适量 Ｐ１病毒，２７℃培养４８ｈ后收
集病毒上清，即得到Ｐ２病毒，按上述方法进行Ｐ３病
毒的扩增。
蛋白表达：接种６×１０６个细胞到２ｍＬ六孔板
中，待细胞贴壁后加入１００μＬＰ３病毒，２７℃培养箱
孵育，７２ｈ后收获细胞。
１．３．５ 免疫荧光标记 Ｓｆ９细胞接种于十二孔板
中，用重组病毒ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳＰ３感染４８ｈ后，设
为实验组，对照组为未感染 ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ的 Ｓｆ９
细胞，二者分别用ＰＢＳ洗细胞３遍，用含３％ ＢＳＡ的
ＰＢＳ４℃封闭过夜。次日用 ＰＢＳ清洗细胞一遍后每
孔加 １００μＬ用 ＰＢＳ１∶３００稀释的一抗（ＨｉｓＴａｇ
ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＡＢＣｌｏｎｅ），４℃过夜，用４℃预冷
的ＰＢＳ于摇床上清洗细胞３遍，每遍５ｍｉｎ，每孔加
１００μＬ用 ＰＢＳ以 １∶５０稀释的荧光标记的二抗
（ＧｏａｔＡｎｔｉＭｏｕｓｅｌｇＧ／ＲＢＩＴＣ，ＡＢＣｌｏｎｅ），４℃过夜。
用４℃预冷的 ＰＢＳ清洗细胞３次，每次５ｍｉｎ，用双
蒸水洗３次，每次５ｍｉｎ，每孔加５０μＬＤＡＰＩ染核。
漂洗后于荧光显微镜下观察拍照。
２ 结果与分析
２．１ 白蜡虫 ｗｓ基因编码区的扩增及 ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ
ｂ质粒提取
将ＰＣＲ扩增后的ｗｓ编码区进行电泳检测，电
泳图片（图１，Ａ）中泳道１为 ＤＮＡ标记，ＤＬ２０００，泳
道２片段的大小约为１４００ｂｐ左右，测序结果表明
该片段即为目的片段，ｗｓ编码区基因已经被成功扩
增。提取的质粒用电泳检测，电泳图片（图１，Ｂ）中
泳道２片段的大小约为５０００ｂｐ，表明质粒已成功
抽取。
Ａ：ｗｓｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增；Ｂ：ｐＦａｓｔｂａｃ质粒
图１ ｗｓ编码区ｃＤＮＡ的ＰＣＲ的扩增及载体抽取的鉴定结果
２．２ 重组载体的鉴定
ｗｓ编码区片段及质粒分别用 ＨｉｎｄⅢ和 ＮｃｏⅠ
双酶切后跑电泳回收，回收产物电泳检测图像如图
２（Ａ）、（Ｂ），依据片段大小可判断酶切后的质粒和
ｗｓ编码区片段已被成功回收。用 Ｔ４连接酶将酶切
质粒和酶切 ｗｓ编码区片段过夜连接后转化到
ＪＭ１０９感受态细胞，用带酶切位点的引物进行检测，
检测结果如图 ２（Ｃ），泳道 １片段大小约为 １５００
ｂｐ，证明重组载体已成功构建。
Ａ：酶切ｐＦａｓｔｂａｃ质粒 Ｂ：酶切ｗｓ编码区片段 Ｃ：含ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｂ／ＥｐｅｌＷＳ的大肠杆菌菌液检测结果
图２ ｗｓ编码区重组载体的ＰＣＲ电泳结果
２．３ 重组病毒Ｂａｃｍｉｄ的鉴定
抽取上述菌液中的重组质粒，转化大肠杆菌
ＤＨ１０ＢａｃＴＭ，对转座后的菌落用Ｍ１３引物和 ｗｓ引物
进行ＰＣＲ，电泳结果如图３。依据条带大小判断，重
组Ｂａｃｍｉｄ：ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ构建成功。用质粒小提
试剂盒提取 ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ质粒，并进行电泳检
测，在６５００左右有条带，如图３（Ｂ），证明 ｒＢａｃｍｉｄ／
ＥｐｅｌＷＳ提取成功。
３９１
林 业 科 学 研 究 第２９卷
Ａ：用三对引物对含ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ的大肠杆菌菌液检测结果（三
对引物所对应的泳道分别是：泳道１：Ｍ１３４７Ｆ／ＷＳＲ，泳道２：Ｍ１３
４８Ｒ／ＷＳＦ，泳道３：Ｍ１３４７Ｆ／Ｍ１３４８Ｒ）Ｂ：对ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ抽
提结果的检测
图３ ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ的鉴定
２．４ 显微镜观察细胞感染情况
用Ｐ３病毒感染Ｓｆ９细胞后７２ｈ后，在光学显微
镜下观察，显示受感染的细胞（图４Ａ，试验组，加重
组病毒）明显比对照细胞（图４Ｂ，对照组，加１ｍＬ
Ｇｒａｃｅ培养基）细胞表面变得粗糙，细胞核变大，肿
胀，畸形，体积变大，内容物增多，悬浮（如图１Ａ中
红圈内细胞尤为明显），初步判断，Ｓｆ９细胞已经被病
毒感染。
Ａ：ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ感染７２ｈ后的Ｓｆ９细胞；Ｂ：对照组细胞
图４ 光学显微镜下两组细胞生长情况
２．５ 免疫荧光分析
被ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ感染４８ｈ后的 Ｓｆ９细胞和
未受感染的对照组细胞经免疫荧光标记后，分别在
普通白光，激发波长为３５８ｎｍ的蓝光和激发波长为
５４０ｎｍ的红光下观察。结果如图５：Ａ、Ｅ为白光下
拍摄的细胞；Ｂ、Ｆ显示，在３５８ｎｍ的激发波长下两
组细胞的细胞核均发出蓝色的光；Ｃ、Ｄ显示，在５４０
ｎｍ的激发波长下，ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ感染的细胞在
细胞质中有红光发出；Ｇ、Ｈ显示，未经 ｒＢａｃｍｉｄ／
ＥｐｅｌＷＳ感染的对照组细胞没有红光发出，证明在受
感染细胞的细胞质中有 ＷＳ表达，ＷＳ在 Ｓｆ９细胞中
表达成功。
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ感染４８ｈ后的 Ｓｆ９细胞；Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ：对
照组细胞。其中Ａ、Ｅ在自然光下拍摄，Ｂ、Ｆ在３５８ｎｍ的激发波长
下拍摄，Ｃ、Ｇ在５４０ｎｍ的波长下拍摄，Ｄ、Ｈ为３５８ｎｍ和５４０ｎｍ
两种波长的组合图片
图５ ｒＢａｃｍｉｄ／ＥｐｅｌＷＳ感染４８ｈ后的Ｓｆ９免疫荧光检测图像
３ 讨论与结论
目前，已有１２个物种的 ＷＳ被分离鉴定，并进
行了功能验证。有些通过转入异源细胞中进行表
达，利用产生的 ＷＳ体外加底物合成蜡酯的方式进
行功能验证，如 Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ等人在香茅醇假单胞菌
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｏｎｅｌｏｌｉｓ）、酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈ１２４６和大肠杆菌中表达了贝氏不动杆菌
ＷＳ［１３－１５］；小鼠 ＷＳ在酿酒酵母、Ｓｆ９昆虫细胞、人
肾脏ＨＥＫ２９３细胞中的表达等［７，１６］；有些通过转基
因的方式进行功能探究，如 Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ将希蒙得木
（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｉｎｋ）Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ｗｓ转基因到
拟南芥中，表达成功并得到含蜡酯的种子［１７－２１］。在
昆虫中还没鉴定到ｗｓ基因，对白蜡虫这种产蜡重要
经济昆虫的蜡酯合成分子机制也研究甚少，未有研
究成果发表，仅有我们实验室前期对白蜡虫蜡酯合
成关键酶之一ｆａｒ基因的部分研究。
本试验将白蜡虫ｗｓ编码区表达载体在Ｓｆ９中表
达，因其同为昆虫细胞，在蛋白质翻译后修饰过程中
有相似性，这是原核细胞及其他种类真核细胞所不
能替代的。所用试剂Ｃｅｌｆｅｃｔｉｎ ＲｅａｇｅｎｔＩ是一种
阳离子脂质体试剂，设计用于实现昆虫细胞的最佳
转染，可稳定高效地转染Ｓｆ９、Ｓｆ２１细胞，将收集的病
毒感染处于对数期健康生长点ｓｆ９细胞即可实现ＷＳ
的表达。
试验中出现的问题有：通过免疫荧光的照片可
见只有部分细胞表达出了ＷＳ蛋白，表达量很少，这
也是真核表达中常见的现象。下一步酶活测定的试
验中可以加大细胞和病毒量以获得更多的 ＷＳ。有
研究表明，血清的存在能降低细胞膜的流动性，从而
４９１
第２期 亓 倩，等：白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞Ｓｆ９中的表达
抑制病毒吸附细胞，影响蛋白的表达［２１］。初步表达
时获得蛋白量较低的另一个原因可能是杆状病毒感
染昆虫细胞后，细胞本身产生应激反应而表达产生
蛋白酶，并随细胞裂解而释放出来，同时由于没有血
清蛋白质如血清蛋白和巨球蛋白的保护，蛋白质水
解的问题显得更为严重［２２］。可以在后续试验中加
入蛋白酶抑制剂和蛋白稳定剂来尝试解决这个
问题。
白蜡虫提供了研究蜡酯合成的重要材料，本研
究成功构建了 ｗｓ编码区表达载体，并初步表达了
ＷＳ，为后续酶活试验奠定了基础，为了解白蜡虫ＷＳ
的生化特性以及白蜡虫泌蜡规律的研究提供分子生
物学依据。
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ｌｉｍｉｔｅｄｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓａｎｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｆｏｌｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆｓｃｒｉｔｉｃａｌｆｏｒｗａｘｅｓｔｅｒｓｙｎｔｈａｓｅ／ａｃｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡ：ｄｉａ
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（责任编辑：张 玲）
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