全 文 ：林业科学研究　2009, 22 (5) : 728～731
Forest R esearch
　　文章编号 : 100121498 (2009) 0520728204
美国白蛾核型多角体病毒多角体蛋白的 SDS2PAGE分析
薛建杰 1, 2 , 曲良建 2 , 王玉珠 2 , 张永安 23 , 唐 　明 13 , 杨唯一 1, 2
(1. 西北农林科技大学林学院 ,陕西 杨凌　712100; 2. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 ,
国家林业局森林保护学重点实验室 ,北京　100091)
关键词 : HcNPV;核型多角体病毒 ;多角体蛋白 ; SDS2PAGE; 32KD蛋白
中图分类号 : S476 + . 13; S763. 42 文献标识码 : A
收稿日期 : 2008209209
基金项目 : 国家自然科学基金 (30671688)资助 ;国家“十一五”科技支撑计划 (2006BAD08A1202)
作者简介 : 薛建杰 (1983—) ,男 ,山东青岛人 ,硕士. E2mail: jianjiexue@163. com3 通讯作者 :张永安 ,男 ,研究员. E2mail: zhangyab@caf. ac. cn; 唐　明 ,女 ,教授. E2mail: tangm@ nwsuaf. edu. cn
SD S2PAGE Ana lysis on Prote in of
H yphan tria cunea Nuclear Polyhedrosis V irus
XUE J ian2jie1, 2 , QU L iang2jian2 , WANG Yu2zhu2 , ZHANG Yong2an2 , TANG M ing1 , YANG W ei2yi1, 2
(1. College of Forestry, Northwest Sci2Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling　712100, Shaanxi, China;
2. Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, CAF, Key Laboratory of Forest Protection,
State Forestry Adm inistration, Beijing　100091, China)
Abstract: Hyphantria cuea nucleopolyhedrovirus ( HcNPV ) and several other nucleopolyhedrosis was extracted by
differential centrifugation, and purified with sucrose gradient centrifugation method. Polyhedrin was gotten and
analysed by SDS - PAGE. It indicated thatmost of those p roteins had 32 KD p rotein band, and with 64 KD p rotein,
and m ight be the main p rotein dimer with the structure and found Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus
p rotein in 18 KD department had a specific band.
Key words: nuclear polyhedrosis; polyhedrin; SDS2PAGE; 32 KD p rotein
美国白蛾 Hyphantria cunea (D rury) 1979年传入
我国辽宁丹东 [ 1 ]后 ,迅速扩散蔓延成灾。现多数分
布在天津市、河北、辽宁、山东、陕西等省。在我国的
寄主植物多达 49科 108属 175种 [ 2 ] ,给林业生产造
成重大损失。1984、1996年两次列入全国森林植物
检疫对象名单。
美国白蛾核型多角体病毒 (Hyphantria cuea nu2
cleopolyhedrovirus, HcNPV)属杆状病毒科 (Baculovi2
ridae) ,核型多角体病毒属 (B orrelinavirus)。
HcNPV对美国白蛾的作用非常明显 ,但目前国
内外对 HcNPV的研究多数在制剂的应用上 [ 3 ] ,对该
病毒的检测还没有形成一套完善的体系。吴敏等 [ 4 ]
对蓖麻蚕核型多角体 ( Philomm la cyn th ta ricina nu2 cleopolyhedrovirus, PcrNPV )包涵体蛋白进行了 SDS2PAGE分析。孙国勋等 [ 5 ]证明棉铃虫枝型多角体病毒 ( Helioth is arm igera nucleopolyhedrovirus, HaNPV )的多角体蛋白以聚集体形式存在。D. C. Kelly等 [ 6 ]对棉铃虫 Helioth is arm igera (Hubner)的结构多肽及多肽的分子量进行了研究。但国内外对美国白蛾该方面的研究却鲜有报道。为了研究美国白蛾核型多角体病毒的结构及其所包含的蛋白条带 ,本文进行了美国白蛾核型多角体病毒在 15%的分离胶浓度下有 16条带 ,其中有主带 32 KD蛋白和次带 64 KD蛋白毒的形态学观察以及多角体蛋白的 SDS2PAGE的探索 ,发现美国白蛾核型多角体病毒蛋白 ,与其他4种比较在 18 KD处有一条特异性条带 ,为今后检
第 5期 薛建杰等 :美国白蛾核型多角体病毒多角体蛋白的 SDS2PAGE分析
测该病毒提供了重要依据。
1　材料与方法
1. 1　病毒
本实验进行比较的昆虫核型多角体病毒有美国
白蛾核型多角体病毒 (HcNPV )、茶尺蠖核型多角体
病毒 ( EoNPV )、棉铃虫核型多角体病毒 ( HaNPV )、
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcNPV )、舞毒蛾核
型多角体病毒 (LdNPV ) 5种。其中 HcNPV是在连
云港野外采集的自发病毒 ,其余 4种是野外采集后
由本实验室人工饲料饲养的传代虫体病毒。
1. 2　核型多角体病毒的提纯 [ 3 ]和内外部形态学
观察
1. 2. 1　核型多角体病毒的提纯
(1)病毒提取 :将 5种感染 NPV的虫尸于研钵
中 ,加入适量磷酸缓冲液 (即 PBS, pH值 7. 4)充分
研磨虫尸 ,使核型多角体释放出来 ,然后两层纱布中
间加一层脱脂棉过滤 ,滤液与死虫的体积比约为
5∶1。将滤液先用 500 r·m in - 1离心 10 m in,取上清
8 000 r·m in - 1离心 30 m in,弃去上清液 , PBS悬浮
沉淀 3 000 r·m in - 1离心 20 m in,重复 3次 ;悬浮沉
淀 800 r·m in - 1离心 5 m in弃沉淀 ,取上清液 800 r
·m in - 1离心 5 m in弃沉淀 , 8 000 r·m in - 1离心 30
m in,收集沉淀 ,把所得到的沉淀用少量的 PBS (沉淀
∶PBS约为 1∶2)悬浮静置 ,所得悬液即为粗提病毒 ,
4 ℃保存备用。
(2)病毒纯化 :采用蔗糖密度梯度离心法将病
毒粗提液进行纯化。首先制备 30% (m /v)、45%
(m /v)、60% (m /v)的蔗糖溶液 ,在离心前预先将配
制的蔗糖溶液按照管底浓而管顶稀的密度梯度盛于
离心管内 ,将待分离样品铺在梯度液顶上。离心后 ,
不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度
层 ,即达到等密度的位置而获得分离。收集分离的
多角病毒多角体溶于适量的双蒸水中 ,于 - 20 ℃冰
箱中保存备用。
1. 2. 2　HcNPV扫描电镜样品的制备 　取纯化的美
国白蛾核型多角体少许 ,用适量无菌水制成悬液 ,涂
于干净的盖玻片上 ,自然干燥或者用红外灯烘干 ,红
外灯与玻片的距离约为 15～20 cm,烘 20～30 m in
后 ,喷金 , DMS26360型扫描电镜观察其外部形态 ,放
大倍数 8 000 ×。
1. 2. 3　HcNPV透射电镜样品的制备
(1)将 HcNPV样品置于 1. 0 mL的离心管底部 ,
用 2. 5%戊二醛预固定 2 h,然后用 pH值 6. 8磷酸
缓冲液漂洗 4次 ,每次 10 m in,置于 4 ℃冰箱过夜。
(2)用 2%的锇酸固定 2 h, pH值 6. 8的磷酸缓
冲液漂洗 ,重复 3次 ,每次 10 m in,置 4 ℃冰箱过夜。
(3)在 4 ℃冰箱中用体积分数分别为 70%、
80%、95%的酒精逐次脱水各 15 m in后 ,再用无水乙
醇脱水 2次 ,每次 10 m in,最后用丙酮脱水 10 m in。
(4)用环氧树脂 Epon812浸透包埋 ,于 35、45、
60 ℃条件下分别聚合 12、24、48 h。
(5 ) LE ICAUC6 I切片机切片 ,醋酸双氧铀 30
m in, 柠檬酸铅双染色 10 m in。JEM 21230透射电镜
下观察多角体面内包埋病毒粒子特征。
1. 3　多角体病毒蛋白的提取 [ 7 ]
(1)将纯化的核型多角体冻干后配成 10 mg·
mL - 1悬液 , 70 ℃保温 2 h以上 ,以灭活碱性蛋白酶。
(2)用终浓度 0. 05 mol·L - 1 Na2 CO3、0. 05 mol·
L - 1 NaC1、0. 004 mol·L - 1 EDTA (pH值 10. 6)碱解液
(约 5 g多角体病毒溶于 1 mL碱解液中 )室温振荡碱解
10 m in, 1 mol·L - 1 HC1调 pH值至 8. 5终止碱解。
(3) 4 ℃, 20 000 r·m in - 1离心 60 m in,去上清
液 ,用 1 mol·L - 1 HCl调 pH值至 5. 0～6. 0,至有絮
状沉淀生成 ,放 4 ℃冰箱静置 2 h。
(4) 1 000 r·m in - 1离心 3 m in,沉淀的蛋白溶于
适量 0. 05 mol·L - 1 Tris2HCl缓冲液 (含 0. 002 mol
·L - 1 EDTA, pH值 8. 8)中。
1. 4　SD S - PAGE电泳
(1)将上述蛋白悬液用 2 ×上样缓冲液溶解 ,漩
涡混匀器混匀后 ,沸水浴 10 m in,以充分溶解。
(2) SDS2PAGE电泳是采用 Leamm li非连续系
统 [ 8 ] ,浓缩胶 5% , pH值 6. 8,分离胶 15% , pH值 8. 8
的电泳系统中分离 ,浓缩胶恒压 12 A,分离胶恒压
24 A,大约 4 h可以完成。蛋白 Marker购于 Fermen2
tas公司。
(3)电泳完毕后将胶剥离 ,用 0. 1%考马斯亮蓝
R250 (水 mL∶甲醇 mL∶乙酸 mL = 4∶5∶1)进行染色
1 h,然后用乙酸 2甲醇 (水 mL∶甲醇 mL∶乙酸 mL =
810∶120∶70)脱色法进行脱色 2～3次 ,每次 1 h,置
清水中过夜。
(4)用 UMAX 2100XL2USB型扫描仪进行胶片
扫描。
2　结果与分析
2. 1　核型多角体病毒的形态学
HcNPV经蔗糖密度梯度离心后 ,大部分核型多
927
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
角体病毒都集中在 45%一层 ,该层溶液为灰白色 ,
颜色均一 ,无其他杂质。吸取该层溶液 ,多次洗涤离
心后获得沉淀物 ,再经冷冻干燥机冻干后所制得的
固体粉末 ,该粉末呈灰白色。
图 1　纯化的 HcNPV的电镜扫描照片 (8 000 ×)
图 2　纯化的 HcNPV的电镜透射照片 (80 000 ×)
图 1为 HcNPV 电镜扫描图片 ,从图可以看出
HcNPV为不规则的多面体 ,其颗粒大小不一 ,直径
约 0. 5～2μm,有三角体、四角体、五角体、六角体
等 ,并且其表面多有突起和凹陷。
图 2为 HcNPV电镜透射照片。HcNPV大多为
多粒包埋型 ,极少数为单粒包埋 [ 9 ]。
2. 2　5种多角体病毒蛋白物理性质的比较
经等电点沉淀法获得 5种核型多角体病毒蛋
白 ,这几种核型多角体蛋白的等电点都在 pH值 5. 6
左右。美国白蛾核型多角体病毒蛋白为淡蓝色 ,其
余 4种核型多角体病毒的蛋白均为白色。说明美国
白蛾核型多角体蛋白的折光性与其他 4种蛋白存在
差异 ,这也可以作为初步鉴定美国白蛾核型多角体
的依据 ,但说明美国白蛾核型多角体病毒蛋白是否
具有某种特性有待于进一步研究。
2. 3　5种昆虫核型多角体病毒蛋白的 SD S2PAGE
电泳比较
将 5种昆虫病毒的蛋白进行 SDS2PAGE电泳 ,
结果如图 3所示。
从左至右依次为 Marker、HcNPV、EoNPV、HaNPV、
LdNPV、AcNPV,Marker的分子量为 10, 15, 20, 25, 30, 40,
50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200
图 3　5种昆虫核型多角体病毒蛋白的 SDS2PAGE电泳图
所有 NPV外面都有一层厚厚的包涵体蛋白 ,其
含量约占病毒组成的 80%以上 [ 11 ]。以上经 SDS2
PAGE可以看出 ,这 5种昆虫核型多角体病毒蛋白
的条带都是多条的 ,其中 HcNPV 有 16条蛋白带 ,
EoNPV有 6条蛋白带、HaNPV有 8条蛋白带、LdN2
PV有 2条蛋白带、AcNPV有 5条蛋白带 ,并且 5种
蛋白带在 32KD左右的蛋白含量明显高于别处。
经 SDS2PAGE电泳分析 , HcNPV有 16条带 ,在
32 KD处有 1条主带 [ 12 ] ,蛋白在主带处的含量较高 ,
在其上方 64 KD左右有 3条次带 ,次带蛋白的含量
略低于主带蛋白 ,在主带蛋白下方还有多条次带 ,其
中 18 KD和 24 KD处的蛋白比较明显。其他 4种
NPV在 32 KD 左右都有一条主带 ,其中 EoNPV、
HaNPV、AcNPV在对应的 64KD处左右存在次带。
这 5种 NPV均在 32 KD到 64 KD没有任何蛋
白条带 ,这在几种 NPV之间是一致的 ,另外这几种
NPV只有在 32 KD处以下才出现了不同分子量的
蛋白条带 ,并且这些小于 32 KD的蛋白条带在几种
NPV之间没有明显的分布规律 ,与自身的其他蛋白
条带也没有明显的数量关系。
037
第 5期 薛建杰等 :美国白蛾核型多角体病毒多角体蛋白的 SDS2PAGE分析
3　讨论
由图 2可以看出 ,病毒粒子束所包含的病毒粒
子数目并不固定 ,推测其包含时选择病毒粒子可能
是随机的 ,因此其大小可能与多角体中包含的病毒
粒子的数量 [ 10 ]有关。吕鸿声 [ 9 ]认为多角体的大小
和形态 ,取决于多角体蛋白的一级结构 ,多角体蛋白
构像调节病毒粒子的包埋过程。
关于核型多角体蛋白的组成一直存在着争
论 [ 3 ] , D. C. Kelly与同事们分析美国棉铃虫与中国
棉铃虫的结构多肽 , 均为多条电泳带 , 分子量在
9 000～106 000 D之间 [ 13 ]。本实验所做的 5种昆虫
病毒蛋白是由多种蛋白构成的 ,这也进一步证实了
核型多角体蛋白是由多种蛋白构成的 ,与刘子夜等
在粘虫核型多角体病毒 (L eucan ia separa te nucle2
opolyhedrovirus, L sNPV )包涵体蛋白的性质研究得出
的结论 [ 11 ]一致。也有研究称核型多角体普遍存在
碱性蛋白酶 ,可以将核型多角体蛋白降解成不同的
片段。本实验对其做了 70 ℃灭活处理 ,但仍有许多
小分子量的片段。产生多条小分子量的原因可能是
该碱性蛋白酶经高温灭活后仍然具备将多角体蛋白
碱解成小片段的活性。从另一个方面来说 ,这种活
性机制对病毒粒子有很大的意义 ,可以使其在高温
的逆境中保存下来并且仍然具备活性 ,在适当的条
件下释放病毒粒子 ,进行病毒的复制 ,传代。
通过 5种核型多角体蛋白的对比 ,有 4种 NPV
在 32 KD处有蛋白条带 ,这说明在 32 KD处的蛋白
是比较保守的 ,在相应的 64 KD处也有蛋白条带 ,可
能是该主带蛋白存在二聚体结构 [ 3 ] ,另外在 32 KD
到 64 KD处也没有其他蛋白 ,这就更加证实了二聚
体结构的存在。有可能存在某种装配机制 ,在包涵
病毒粒子的过程中主带蛋白形成二聚体 ,然后进一
步装配将病毒粒子包含其中 ,对于装配机制还有待
于进一步研究。这两处的条带可能是多角体蛋白的
主要构成部分 ,而其他的小分子量条带则是由于碱
性蛋白酶作用的结果。美国白蛾核型多角体蛋白在
主带蛋白下方还存在 1条次带 ,吴敏 [ 3 ]等人在蓖麻
蚕核型多角体病毒蛋白中也发现有 1条类似的条
带 ,并猜想其为多角体膜蛋白。
通过对比 ,发现 HcNPV蛋白在 18 KD左右相对
其他 4种多角体蛋白有一条特异性条带 ,虽然不能
排除是否由于碱性蛋白酶作用产生的 ,但是多次电
泳结果表明 ,这些小分子量的蛋白性质比较稳定 ,所
得的电泳结果基本一致。该 18 KD条带所在的位置
比较特殊 ,其他 4种昆虫病毒蛋白在该处均无条带 ,
并且该条带的蛋白含量相对较多 ,这在以后的纯化
分析中有较高的利用价值 ,可以以此作为抗原来制
得相应的抗体 ,这仅在分子量上就有很大的差异 ,这
在该病毒的检测中具有非常重要的意义。
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