全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林业科学研究　2006, 19 (4) : 423～430
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2006) 0420423208
紫胶虫主要生产种的 RAPD分子标记分析
陈　航 1, 2 , 陈晓鸣 1, 23 , 冯　颖 1, 2 , 叶寿德 1, 2
(11中国林业科学研究院资源昆虫研究所 ,云南 昆明　650224; 21国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室 ,云南 昆明　650224)
摘要 :用 RAPD技术研究了紫胶虫 7种主要生产种 12个群体之间的亲缘关系 ,研究中每个群体使用了 24个标本 ,
共有 288个个体用于研究。在试用的 45种随机引物中 ,筛选出 9种引物用于随机引物扩增 ,共得到 121个清晰稳
定的位点 ,其中 118个为多态性位点 ,多态百分率为 97152% ,每条引物检测到的位点数为 11～16个 ,长度为 150～3
000 bp。根据扩增结果 ,用 UPGMA法对 Nei’s遗传距离进行聚类分析 ,构建分子系统树。7种紫胶虫聚类结果显
示 :紫胶虫各群体间的遗传距离为 01044 3～01791 7,其中 ,种间的遗传平均距离为 01443 0,种内的遗传平均距离为
01170 7。根据聚类分析 ,讨论了紫胶虫主要生产种的亲缘关系。
关键词 : 紫胶虫 ; RAPD分子标记 ; UPGMA聚类分析 ;遗传距离 ;亲缘关系
中图分类号 : S89912 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006203210
基金项目 : 国家自然科学基金“紫胶虫种质资源库建立及紫胶虫遗传规律研究 ”( 30371165)、科技部基础专项“资源昆虫种质资源收
集、整理、保存”(2000DEB100035)和国家攻关“特种林产资源高效生产与精深加工技术研究”(2004BA502B04)项目研究内容
作者简介 : 陈　航 (1977—) ,男 ,四川万源人 ,博士生.3 通讯作者
Ana lysis of Rela tion sh ips am ong the M a in Comm erc ia l Spec ies of Lac
In sects Using Random Am plif ied Polym orph ic D NA ( RAPD )
CHEN Hang 1, 2 , CHEN X iao2m ing1, 2 , FENG Ying1, 2 , YE Shou2de1, 2
(11Research Institute of Resource Insects, CAF, Kunm ing　650224, Yunnan, China;
21The Key Laboratory of Cultivating and U tilization of Resource Insects of State Forestry Adm inistration, Kunm ing　650224, Yunnan, China)
Abstract: The technique of random amp lified polymorphic DNA (RAPD) was used to study the relationship s of 12 popula2
tions from 7 species in the genus Kerria. A total of 288 samp les were used in this study and 24 samp les for each population.
In 45 p rimers under p redeterm ined op timal reaction conditions, 9 p rimers were informative and yielded a total of 121 clear
and rep roducible loci. The percentage of polymorphic loci( PPB) was 97152%. The amp lified DNA loci of individual p rim2
er were 11～16, and their molecular size was 150～3 000 bp. The dendrogram were constructed based on Nei’s genetic
distance by UPGMA method. The cluster results showed the genetic distance between inter2population were 01044 3 ～
01791 7, in which the average genetic distance among species was 0. 443 0 while under species was 01170 7. By analysis
of molecular dendrogram, the genetic relationship s among p roduction species were discussed.
Key words:Lac insect; RAPD; UPGMA cluster; genetic distance; genetic relationship
紫胶虫是一类具有重要经济价值的资源昆虫 ,
属同翅目 (Homop tera)胶蚧科 ( Tachardiidae)胶蚧属
( Kerria) ,全世界记载并定名的有 19种 [ 1 ]。在长期
与寄主植物的协同进化过程中 ,紫胶虫经过长期积
累 ,形成了丰富的种类和遗传变异 ,在紫胶虫种内形
成明显分化特征而遗传下来 ,形成了多个变异的品
系、种源和遗传多态现象 (多色型现象 )。这也使得
以形态学为依据的传统分类方法遇到了困难 ,需要
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
用分子生物学方法对紫胶虫的分类地位进行补充和
证实 ,对其亲缘关系进行深入研究分析。
对于蚧胶属各种间分类研究 ,前人作了大量的
工作 , Varshney[ 2 ]对胶蚧科分类进行了系统的研究。
欧炳荣等 [ 3, 4 ]分别对紫胶蚧 ( Kerria lacca Kerr1)与国
内生产种进行光学显微和电镜扫描的观察对比 ,发
现国内生产种与紫胶蚧在膊器、膊筛、肛上板等形态
特征上存在显著区别 ,并将国内紫胶虫鉴定为一个
新种 ,定名为云南紫胶虫 ( Kerria yunnanensis Ou et
Hong)。陈晓鸣等 [ 5, 6 ]对紫胶蚧、云南紫胶虫、榕树
紫胶虫 ( Kerria fici Green ) 和信德紫胶虫 ( Kerria
sind ica Mahdihassan)进行了初步杂交试验 ,研究发
现紫胶蚧、榕树紫胶虫和信德紫胶虫同属热带虫种 ,
亲缘关系较近 ;而我国生产用紫胶虫 (以前一直认为
是 K. lacca)与紫胶蚧 ( K. lacca )杂交后并不能产生
子代 ,证明了我国生产所用紫胶虫应为云南紫胶虫。
周朝鸿等 [ 7 ]对紫胶蚧、云南紫胶虫、榕树紫胶虫、信
德紫胶虫和田紫胶虫 ( Kerria ru ra lis W ang) 5种紫
胶虫雌虫的染色体做了初步研究 ,通过比较核型特
征 ,推断出紫胶蚧、榕树紫胶虫和信德紫胶虫 3种
紫胶虫亲缘关系较近 ,而云南紫胶虫和田紫胶虫与
上述 3种亲缘关系较远 ;进一步从细胞遗传学角度
验证了我国主要生产种不是紫胶蚧 ,而应为云南紫
胶虫。陈晓鸣 [ 1 ]运用同功酶电泳技术对紫胶蚧 ,
云南紫胶虫 ,榕树紫胶虫和信德紫胶虫的酯酶和过
氧化物酶进行分析 ,发现 4种紫胶虫在酯酶和过氧
化物酶同功酶酶谱上均存在差异 ,而且两种酶谱具
有种的特征 ,因此同功酶可作为种间鉴别的一个指
标 ,首次从分子水平上研究了紫胶虫的种间遗传
差异。
RAPD ( Random Amp lified Polymorphic DNA )技
术是 W illiam s和 W elsh等人于 1990年首次提出的
一项 DNA 多态性检测技术。由于 RAPD技术能够
简单、快速地检测生物间的遗传差异 ,其所需的
DNA材料极少 ,对于研究微小昆虫十分有利 [ 8～10 ]。
自 1992年以来 , RAPD技术被应用于微小昆虫的种
类鉴定、生物型识别和遗传变异研究 [ 11～13 ] ,但在紫
胶虫的研究方面 ,目前尚未有相关的报道。本文运
用 RAPD技术对 7种生产用紫胶虫 12个群体的基
因组 DNA多态性进行了分析 ,对它们的亲缘关系和
系统进化进行探讨 ,以期为紫胶虫的种质资源研究
提供相关的遗传背景资料和理论依据 ,并为使用分
子标记辅助育种打下基础。
1　材料与方法
1. 1 实验材料
供试的紫胶虫标本均采自实验站和野外田间 ,
采集后浸泡在无水乙醇中 ,放置在 - 20 ℃冰箱中长
期保存 ,并依据其形态特征用传统分类学方法进行
分类鉴定。标本的种类、数量、寄主及采集时间与地
点见表 1。
表 1 7种紫胶虫 (12个群体 )供试样本基本情况
名 称 寄 主 树 样本数 采集地点
采集时间
(年 2月 ) 代码
云南紫胶虫 秧青 D alberg ia assam ica Benth 24♀ 中国林科院资源昆虫所景东实验站 2004207 Cy
云南紫胶虫 牛肋巴 D albergia obtusifolia Prain 24♀ 中国林科院资源昆虫所景东实验站 2004207 Cnm
紫胶蚧 (兰吉尼 ) 滇刺枣 Z izyphus m auritiana Lam. 24♀ 中国林科院资源昆虫所元江实验站 2005206 RAN
紫胶蚧 (库斯米 ) 久树 Schleichera oleosa Lour. 24♀ 中国林科院资源昆虫所元江实验站 2005206 Lf
中华紫胶虫 K. chinensis Mahdihassan 荔枝 L itchi ch inensis Sonn. 24♀ 泰国青莱 2004211 Tl
中华紫胶虫 雨树 Sam anea sam an (Jacq. )Merr. 24♀ 泰国青莱 2004211 Ty
尼泊尔紫胶虫 K. nepalensis Varshney 大叶千斤拔 F lem ingia m acrophylla W il. 24♀ 缅甸 (低海拔地区 ) 2003212 M l
普萨紫胶虫 K. pusana M isra 苏门答腊金合欢 A cacia m ontana Benth 24♀ 缅甸 (东枝、腊叙等高海拔地区 ) 2005206 Mh
田紫胶虫 (黄色型 ) 铁藤 Pueraria tonkinensis Gagn. 24♀ 云南西双版纳自治州普文 2003208 Ry
田紫胶虫 (红色型 ) 铁藤 24♀ 云南西双版纳自治州普文 2003208 R r
信德紫胶虫 聚果榕 Ficus racem ose L inn. 24♀ 中国林科院资源昆虫所元江实验站 2005206 Sj
信德紫胶虫 万年青 Ficus glabella B l. 24♀ 中国林科院资源昆虫所元江实验站 2005206 Swf
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第 4期 陈 　航等 :紫胶虫主要生产种的 RAPD分子标记分析
112 实验方法
11211 基因组 DNA提取 在冻存的酒精标本中 ,
随机选择形体完整的虫体 ,待其表面酒精挥发后 ,
对整虫体进行总 DNA提取 ,具体步骤参见田英芳
等 [ 14, 15 ]的提取方法并作适当的改进 ,通过 1%琼脂
糖凝胶电泳检测 DNA纯度与浓度 ,提出的总 DNA
用去离子水溶解 ,保存在 4 ℃冰箱中备用。
11212 引物筛选 随机引物由上海 Sangon公司设
计合成 ,共 45条 ,每条引物长 10 bp,经预备实验选
出能产生丰富多态位点 ,谱带清晰且重复性强的 9
条引物 ,分别对 7种紫胶虫 12个群体各 24个体
DNA进行扩增。
11213　RAPD2PCR扩增 采用 20μL反应体系 :其
中模板 DNA 50 ng,引物 (上海 Sangon合成 ) 66 ng,
MgCl2浓度 215 mmol·L - 1 ( Taq酶配套 ) , 10 ×Buffer
(Taq酶配套 ) 2μL, dNTP浓度 015 mmol·L - 1 , Taq
酶浓度为 2 U。用去离子水代替模板 DNA设置对照。
扩增程序为 : 95 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性 1
m in, 36 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 2 m in,共 40个循环。
最后 , 72 ℃延伸 10 m in。PCR扩增仪使用美国 MJ公
司 PTC2200型 ,标准分子量使用 100 bp DNA Ladder。
扩增产物用 115%琼脂糖凝胶电泳 ,电泳缓冲液为 1
×TBE,溴化乙锭 (015μg·mL - 1 )染色 30 m in,置于
UVP28000凝胶成像系统下检测 RAPD谱带。
11214　数据处理与分析 根据凝胶成像系统记录
的照片统计清晰稳定的扩增片段 ,借助 Marker计算
不同片段的分子量大小 ,并同时用数字“0”和“1”分
别表示扩增片段在某一特定位点的无或有 ,从而将
RAPD谱带转换为矩阵数据 ,使用 POPGENE32软件
计算遗传一致度 ( I)和遗传距离 (D )。运用 MEGA3
软件对遗传距离进行不加权算术平均组对法 (UPG2
MA )聚类分析 ,构建分子系统树。
2 结果与分析
211　PCR扩增结果
用筛选出的 9条随机引物对来自胶蚧属主要生
产种 12个群体 288个个体的紫胶虫基因组 DNA进
行扩增 ,每条引物检测到的位点数为 11～16,共检
测到 121个清晰稳定的位点 ,其中有 118个多态性
位点 ,多态百分率为 97152% ,平均每条引物扩增的
位点数为 1314个 ,长度为 150～3 000 bp。随机引物
的碱基序列及扩增条带数见表 2。
表 2 随机引物的碱基序列及扩增条带
引物
引物序列
(5′- 3′)
扩增位
点数
引物
引物序列
(5′- 3′)
扩增位
点数
S6 TGCTCTGCCC 11 S7 GGTGACGCAG 14
S8 GTCCACACGG 11 S43 GTCGCCGTCA 16
S71 AAAGCTGCGG 14 S88 TCACGTCCAC 12
S103 AGACGTCCAC 15 S319 TGGCAAGGCA 15
S62 GTGAGGCGTC 13 Total 121
　　从表 2可知 ,扩增位点数最多的为 S43,为 16
个 ;扩增位点数最少的为 S6和 S8,均为 11个。同一
群体 24个个体在同一引物下扩增的条带基本一致
(图 1) ,而不同种在同一引物扩增下显示出多态性
差异 (图 1、2) ,用不同引物扩增同一群体 ,产物也有
显著差异 (图 2、4 )。部分 RAPD 扩增结果见图
1～4。　
212　遗传距离、遗传一致度和聚类分析
采用 Nei’s无偏遗传距离的算法 ,对 7个种和 12
个不同群体间的遗传距离和遗传一致性进行测度计
算 ,得到各分类群的距离系数和一致性系数矩阵 (表
3～4) ,根据遗传距离用 UPGMA聚类法构建分子系
统树 (图 5)。
图 1　引物 S7对紫胶蚧库斯米品系 24个体的 RAPD扩增结果 (M表示分子量标准 Marker的位置 ,下同 )
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图 2　引物 S7对云南紫胶虫 24个体的 RAPD扩增结果
图 3　引物 S103对田紫胶虫 (黄色型 ) 24个体的 RAPD扩增结果
图 4　引物 S43对云南紫胶虫 24个体的 RAPD扩增结果
表 3　紫胶虫 12个不同群体的遗传距离 ( D ) (下三角 )和遗传一致性 ( I) (上三角 )
名称
云南
紫胶虫
(牛肋巴 )
云南
紫胶虫
(秧青 )
紫胶蚧
库斯米
品系
紫胶蚧
兰吉尼
品系
普萨
紫胶虫
尼泊尔
紫胶虫
田紫胶虫
(红色型 )
田紫胶虫
(黄色型 )
信德
紫胶虫
(金合欢 )
信德
紫胶虫
(万年青 )
中华
紫胶虫
(雨树 )
中华
紫胶虫
(荔枝 )
云南紫胶虫 (牛肋巴 )
云南紫胶虫 (秧青 )
紫胶蚧库斯米品系
紫胶蚧兰吉尼品系
普萨紫胶虫
尼泊尔紫胶虫
田紫胶虫 (红色型 )
田紫胶虫 (黄色型 )
信德紫胶虫 (金合欢 )
信德紫胶虫 (万年青 )
中华紫胶虫 (雨树 )
中华紫胶虫 (荔枝 )
01088 8
01708 4
01628 9
01255 7
01251 7
01227 5
01201 4
01471 0
01429 1
01578 3
01504 1 01915 101677 301631 101301 601338 501272 601282 101488 301419 701543 901475 3 01492 401508 001243 801632 801514 301596 401568 601342 501310 201639 301763 4 01533 201532 001783 701558 401469 701559 901534 901407 401412 401531 401549 7 01774 401739 701531 101572 101252 601185 001201 001507 101538 301656 401498 7 01777 501712 901597 901625 201776 801256 801219 801419 901494 401461 801440 0 01796 501761 401550 801571 301831 101773 501044 301470 801456 701510 601492 9 01817 601754 201566 301585 701817 901802 701956 701423 601418 701514 801503 3 01624 401613 701710 001665 401602 301657 101624 501654 701135 201636 301653 4 01651 101657 201733 301662 101583 701609 901633 401657 901873 501742 901791 7 01560 901580 501527 701587 801518 701630 201600 101597 601529 301475 701341 5 01604 101621 701466 101577 101607 301644 001610 801604 501520 301453 101710 7
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第 4期 陈 　航等 :紫胶虫主要生产种的 RAPD分子标记分析
表 4　7种紫胶虫的遗传距离 ( D ) (下三角 )和遗传一致性 ( I) (上三角 )
名 称 云南紫胶虫 紫胶蚧 普萨紫胶虫 尼泊尔紫胶虫 田紫胶虫 信德紫胶虫 中华紫胶虫
云南紫胶虫
紫胶蚧
普萨紫胶虫
尼泊尔紫胶虫
田紫胶虫
信德紫胶虫
中华紫胶虫
01629 7
01256 3
01252 3
01228 2
01471 6
01578 9 01532 801558 901470 201560 401407 901531 9 01773 901571 801252 901185 401503 701656 7 01777 001624 901776 601257 201420 101462 1 01796 001571 001830 801773 201471 101511 0 01624 001665 101602 101657 001624 301636 5 01560 501587 501518 601630 001599 901529 2
图 5　紫胶虫 12个群体的 UPGMA聚类树状图
遗传距离是衡量群体间或物种间遗传差异或遗
传分化的重要参数 ,是以两个群体或两个物种间同
一座位上相同等位基因频率差异的函数来测量。在
本研究所得距离系数矩阵中 (表 3、4) ,紫胶虫各群
体间的遗传距离为 01044 3～01791 7,其中 ,种间的
遗传平均距离为 01443 0,种内的遗传平均距离为
01170 7,各种间的遗传差异明显大于种内各群体间
的差异。
从种内的遗传距离来看 (表 3) ,亲缘关系最近
的两个群体是田紫胶虫红、黄两种色型 ,其距离系数
仅为 01044 3,遗传相似程度最高 ,这可能与两种色
型生活在同一寄主树、生态环境近似有关 ;而在田紫
胶虫黄色型分离试验中发现 :黄色雌成虫所产生的
子代幼虫均保持了纯黄色 ,这表明黄色性状是遗传
的 ,体色的差异可能是遗传物质在起作用 [ 16 ]。关于
多色型的起源 ,目前存在两种不同的观点 :一种认为
生物的体色差异是由环境造成 ,是适应环境的一种
表象 ;另一种观点则认为不同的体色完全是由生物
的遗传突变决定的 ,与所在的环境无关。尽管从
RAPD扩增图谱上也很难分出红、黄两型的区别 ,该
实验也不支持环境造成体色差异这样的结论 ,因为
这可能与选择的随机引物有关 ,当引物序列与突变
基因不能相互匹配与识别时 ,那么 RAPD也就无法
检测出相对应的遗传差异。还需要进一步选用其它
引物作 RAPD扩增或测序后进行核甘酸序列比对 ,
才能明确形成不同体色的真实原因。
紫胶蚧两个品系生活周期各不相同 ,形成两种
寄主专化型。库斯米品系只能生长在久树上 ,而兰
吉尼品系生长在一种榕树 ( F icus sp. )和宝树 (B u tea
m onosperm a Lain. )上 ,不生长在久树上 [ 1 ] ,它们之间
的遗传距离为 01243 8;来自不同寄主树的两类云南
紫胶虫和信德紫胶虫 ,由于它们尚未形成寄主专化
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型 ,所以同种内两个群体间遗传相似性更高 ,其遗传
距离分别为 01088 8和 01135 2,比紫胶蚧两个品系
间的距离更近 ;两类中华紫胶虫不但在寄主树上存
在差异 ,而且分别采自泰国不同的地区 ,因而遗传相
似程度最低 ,其距离系数为 01341 5,亲缘关系最远。
从育种的角度分析 ,双亲的遗传距离越远 ,遗传差异
越丰富 ,子代出现优良性状的机率就越高 ,而且同种
内不存在生殖隔离 ,因此在良种选育过程中 ,选择这
两类中华紫胶虫作为亲本是值得考虑的方案。
从种间的遗传距离来看 (表 4) ,普萨紫胶虫与
田紫胶虫距离为 01185 4,二者遗传距离最小 ,其遗
传一致度最大 ,亲缘关系密切 ,在外部形态上两者也
较相似 :除在体形大小较为接近以外 ,还具有膊臂紧
贴体壁 ,抬起不明显 ,前气门紧靠膊臂 ,前气门角质
化痕迹退化等共同特征。由于两者的遗传距离与种
内的平均距离值 (01170 7)接近 ,且原产地缅甸北部
与中国云南普文毗邻 ,有类似的气候环境 ,所以有可
能是同一种下的不同亚种 ,但目前在普萨紫胶虫中
没发现有红、黄两型分化 ,还要做更深入的研究才能
得出定论。中华紫胶虫与普萨紫胶虫的距离为
01656 7,在种间遗传距离最大 ,其遗传一致度最小。
两者在体形上也相差很大 ,前者是后者的 5～7倍 ;
中华紫胶虫的角质化痕迹长约 0154～2121 mm,在
所收集到的虫种中为最长 ;而普萨紫胶虫角质化痕
迹几乎完全退化 ;另外 ,中华紫胶虫膊臂明显抬起 ,
凹陷的面积狭小 ,这都与普萨紫胶虫形成了鲜明的
对比。
根据杂交试验 [ 5, 6 ]的结果 ,信德紫胶虫与紫胶
蚧 (距离系数 01407 9)杂交后能正常孕卵并产生子
代 ;而云南紫胶虫与紫胶蚧 (距离系数 01629 7) ,云
南紫胶虫与信德紫胶虫 (距离系数 01471 6)杂交后 ,
均不能孕卵和产生子代 ,说明杂交的成功与亲本间
的亲和性有着密切的关系 ,这种亲和性若以遗传距
离为参考标准 , 那么选择遗传距离低于平均值
01443 0的双亲组合 ,则更有可能获得成功。
从系统树的拓扑结构 (图 5)可以看出 ,同种内
的不同群体 (包括田紫胶虫红黄两型 ,紫胶蚧两个品
系 ,云南紫胶虫、中华紫胶虫和信德紫胶虫的两种不
同寄主型 )聚在一起 ,形成 5个姐妹群 ,分别与 5个
不同独立的虫种对应契合 (图 5) ;这 5个种再与普
萨、尼泊尔两种紫胶虫进行聚类 ,结果 7种虫种最终
归属为 Ⅰ、Ⅱ两大分支 (图 5) :在第 Ⅰ分支中 ,田紫
胶虫与尼泊尔紫胶虫、普萨紫胶虫亲缘关系紧密 ,先
聚在一起 ,再与云南紫胶虫合为一族 ,最后与中华紫
胶虫聚类 ,形成一大支系 ,其中田紫胶虫与中华紫胶
虫的亲缘关系较远 ,分别位于分支内的两端。在第
Ⅱ分支中 ,信德紫胶虫与紫胶蚧构成一个自然进化
枝 ,与其它 5种紫胶虫亲缘关系较远 ,从群体中分支
出来 ,形成单独的支系。
3 讨论
311 7种紫胶虫间的亲缘关系
从聚类结果 (图 5)来看 ,在分支 Ⅰ中 ,田紫胶虫
与普萨紫胶虫的亲缘关系最近 ,尼泊尔紫胶虫的肛
突发育良好 ,分为两节 ,与前两种相区别 ,在系统树
上也位于较远的分支 ;云南紫胶虫的肛上板筒状 ,宽
大长 ,这与前面 3种明显不同 ,亲缘关系较远 ;中华
紫胶虫是分支 Ⅰ中虫体最长的一个种 ,而且前气门
远离膊臂 ,在前气门下方的角质化痕迹明显长于其
它 4种 ,与它们的亲缘关系最远 ,位于系统树分支 Ⅰ
的基部。
在分支 Ⅱ中 ,信德紫胶虫与紫胶蚧亲缘关系较
近 ,聚为单独的一支 ,与分支 Ⅰ中 5个虫种间的遗传
关系较为疏远。这可能与这两种虫种的独特的生态
环境有关 ,它们的原产地气候均属热带半干旱气候
类型 ,年均气温在 22 ℃以上 ,降水量为 400～1 200
mm。中华紫胶虫和田紫胶虫虽然也同属热带虫种 ,
但主要分布在热带湿润地区 ,年降水量在 1 300 mm
以上 ;云南紫胶虫生活在亚热带地区 ,年均气温为
14～20 ℃。在长期的进化过程中 ,不同的紫胶虫种
类对生态环境产生了不同的适应机制 ,并逐渐形成
遗传上的一些差异 ,积累下来形成了目前的系统发
育关系。
紫胶虫主要分布于亚洲的热带、亚热带地区和
澳大利亚地区 ,大致分布在 77°～120°E、8°～26°N
范围内 [ 1 ] ,从昆虫地理区系划分 ,则从属古北区、东
洋区和澳洲区 [ 17 ]。虽然本研究所选用的标本均来
自东洋区 ,但从板块构造上 ,信德紫胶虫与紫胶蚧原
产地为孟加拉国、印度 ,属于印度板块 ;其它 5种紫
胶虫来自中国云南省、泰国和缅甸北部 ,属欧亚大陆
板块。根据地质研究 ,在三叠纪末期 (约 119亿年
前 ) ,印度板块与古南大陆分开 ,开始长距离北移 ,与
古北大陆的欧亚板块碰撞并插入 ,造成青藏高原隆
起与古地中海西退 [ 18 ]。据已有的化石记录 ,最古老
的昆虫化石发现于古生代泥盆纪层积岩中 ,距今约
315～4亿年以前 ;而蚧虫化石最早可见于古生代石
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第 4期 陈 　航等 :紫胶虫主要生产种的 RAPD分子标记分析
炭纪晚期 ,约 2亿年前 [ 19 ]。也就是说 ,在印度板块
与欧亚大陆合并之前 ,蚧虫类已在两块大陆上长期
隔离生存了 ,虽然它们起源于联合大陆的共同祖先 ,
但各自独立的环境 ,使得在长期的进化过程中保持
了各异的遗传特征 ,形成了不同的支系 ,这也许就是
信德紫胶虫与紫胶蚧与其它 5种紫胶虫遗传距离较
大、亲缘关系较远的原因所在。
聚类结果除与陈晓鸣等 [ 5, 6 ]进行的初步杂交试
验结论相一致以外 ,同时也与周朝鸿 [ 7 ]等所做染色
体初步研究结论相符合 ,通过比较各种的核型特征 ,
发现云南紫胶虫和田紫胶虫明显不同于信德紫胶虫
与紫胶蚧 ,它们的第 1、2号染色体的臂比值明显高
于另外两种 ,染色体类型为近端部着丝点染色体 ,另
外两种为中部或近中部着丝点染色体 ,推断出信德
紫胶虫与紫胶蚧亲缘关系较近 ,而云南紫胶虫和田
紫胶虫与上述两种亲缘关系较远。RAPD分析与这
些结论的吻合 ,说明实验中建立 RAPD体系较为稳
定可靠 , RAPD技术在胶蚧属亲缘关系的研究中具
有良好的适用性。当然 , RAPD 技术并不能解决所
有系统发育上的问题 , RAPD分析结果有时与传统
形态分类存在一些分歧 ,如普萨紫胶虫、云南紫胶虫
和信德紫胶虫的肛突宽大长 ,在形态分类上被明确
的归为一类 ,而 RAPD聚类的结果则将三者分在不
同的两大支系中 (图 5)。因此 ,在紫胶虫系统发育
的研究中 ,只有将分子、形态以及细胞学等方面的数
据结合起来分析 ,才能得出较为客观的结论。
312　RAPD技术的稳定性探讨
RAPD技术由于引物碱基数很少 (10 bp ) ,所以
灵敏度很高 ,很容易受到反应条件的影响而使产物
发生改变 ,导致扩增结果的不稳定性 ,它的重复性一
直是许多学者关注的重点。RAPD扩增片段的多少
及重复性除了与基因组特性有关之外 ,也受到扩增
体系 (如模板 DNA的纯度、Mg2 +浓度、dNTP浓度、
Taq酶的用量 )及外部因素 (反应程序 ,凝胶电泳的
类别和胶的质量等 )的影响 [ 20, 21 ]。
在参考前人工作的基础上 ,重点关注反应体系
中 Mg2 +与 dNTP不同浓度搭配 ,主要方法是在保持
其它因素不变的情况下 ,只对其中一项进行梯度实
验 ,从而得出一个优化的反应体系。在 20μL的反
应体系中 ,分别采用如下的梯度实验 :模板 ( 25、50
ng)、Tag酶 ( 1、115、2 U )、dNTP ( 0125、0150、0196、
1142、2100、2150 mmol·L - 1 ) , Mg2 + ( 1120、1150、
1175、2100、2125、2150、2175 mmol·L - 1 ) ,通过多次
预实验 ,最终筛选出最佳的反应体系。
另外 ,模板 DNA的纯度对 RAPD扩增条带的重
复性有很大影响。在研究中采用酚、氯仿多次抽提 ,
较为彻底的清除蛋白质的干扰 ,加入少量异戊醇以
消除混匀时所产生的泡沫 ,使用氯仿去除色素、RNA
酶 ,从而使提出的 DNA的相对纯度较高 ,杂质较少 ,
扩增出的条带数较稳定。从实验中作者发现 ,尽管
RAPD反应存在较多的影响因素和潜在的不稳定
性 ,但可以通过一些有效的措施来实现 RAPD结果
重复性和可靠性。
与其它分子标记技术相比 , RAPD 标记具有下
列优点 : RAPD技术可以在对受试物种缺乏任何分
子生物学研究的背景下 ,直接对基因组进行多态性
分析 ; RAPD标记位点多 ,利用一系列引物可以使检
测区域覆盖整个基因组 ; RAPD所需模板量极小 ,可
从毛发、脱落组织或排泄物中提取微量 DNA直接进
行扩增 ,这对于研究珍稀物种的基因组分析十分有
效 [ 22, 23 ] ;同时 RAPD 技术还具有操作步骤少 ,周期
短 ,费用低等优点。紫胶虫体型微小 ,从单头虫提取
出的 DNA量极少 ,同时缺乏相关的分子生物学研
究 ,因此对于研究紫胶虫的系统发育与遗传背景来
说 , RAPD是一种有效的分子标记方法。
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