全 文 ：收稿日期：2007-12-30
基金项目：国家 863 项目（2006AA100109）；国家科技支撑计划项目（2006BAD01A1803）；北京市花卉重点项目（ylhh2006001）
作者简介：罗凤霞（1958-），女，金陵科技学院教授，硕士，从事花卉育种和植物组织培养研究。 * 通讯作者 Corresponding author：沈向群（1955-），
男，沈阳农业大学教授，博士，从事蔬菜花卉遗传育种研究。
应用分子标记探讨一种野生百合的分类地位
罗凤霞 1，李 雨 2，沈向群 2*，明 军 3，关婧竹 2
（1.金陵科技学院 园艺学院，南京 210038； 2.沈阳农业大学 园艺学院，沈阳 110161；
3.中国农业科学院 蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘要：为了探讨采自辽宁省丹东市一种百合（Lilium）种质（简称丹东百合）的分类地位，应用 RAPD（随机扩增多态性）分子标记方
法对包括丹东百合在内的 13 种百合种质资源进行了亲缘关系分析。 结果表明：丹东百合属于野百合种，与白天堂遗传距离最近，
遗传距离为 0.2667，与西伯利亚遗传距离最远，遗传距离为 0.4286。
关键词：野百合；RAPD 分子标记；聚类分析；分类地位
中图分类号：S682.2 文献标识码： A 文章编号： 1000-1700（2008）06-0669-04
Taxonomic Status of a Wild Species of Lily Based on Molecular Marker
LUO Feng-xia1， LI Yu2， SHEN Xiang-qun2*， MING Jun3， GUAN Jing-zhu2
(1.College of Horticulture, Jinling Institute of Technology, Nanjing 210038, China; 2.College of Horticulture, Shenyang Agricultural University,
Shenyang 110161, China; 3.Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract： In order to get he taxonomic status of a wild species of lily from Dandon, Liaoning Province, China, we uesed the
method of RAPD to analyze the relationship of thirteen lilies. The results suggested that the lily in Dandong, Liaoning Province
belonged to the species of Lilium brownii. The genetic distance between the lily in Dandong and White Heaven was closest, only
0.2667. The genetic distance between the lily in Dandong and Siberia was farest (0.4268).
Key words： Lilium brownii; RAPD; clustering analysis; taxonomic status
在辽宁省丹东市存在一种百合种质（以下简称丹东百合），早期仅是庭院栽培，近十年广泛用于当地切花生
产，可直接用于生产或作为优良育种亲本。丹东百合形态特征与文献记载的野百合相似，但也有明显差异，辽宁
省并无野百合分布的记录[1]，经调查此百合在当地并无野生植株，也非市面流通品种，是 20世纪 40年代从外地
引进的野生种，但引进地点不详。国内外已经有很多成功应用 RAPD（随机扩增多态性）技术探讨百合野生种和品
种的分类与亲缘关系的研究报道[2-11]，且 RAPD技术相当成熟。本试验采用 RAPD技术对丹东百合与 12个百合野
生种和品种进行了亲缘关系分析，对丹东百合的分类地位进行了探讨，为其分类鉴定提供了基因水平证据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2006年 10月至 2007年 8月在北京市农林科学院蔬菜研究中心进行。 供试 13个百合野生种和栽
培品种如表 1。
1.2 方法
1.2.1 百合叶片 DNA 的提取试验 参考 CTAB 小量提取法 [12]，取 0.1g 百合幼嫩叶片，加 500μLCTAB（内含
0.4%巯基乙醇和 1%PVP 粉），用组织粉碎机处理 60s；65℃保温 45min；加 500μL 的 Tris 饱和酚/氯仿/异戊醇（v/
v/v25∶24∶1），颠倒 10min，静置 5min；10000r·min-1离心 15min；取上清 400μL，加 400μL 的 Tris 饱和酚/氯仿/异
戊醇（25∶24∶1）中，颠倒 5min，10000r·min-1离心 10min；取上清 240μL，加 480μL 的无水乙醇（-20℃），-20℃静置
60min；4℃，10000r·min-1离心 10min；弃上清，加 350μL ddH2O，沉淀溶解后，10000r·min-1离心 10min；取上清
300μL，加 30μL的 3mol·L-1NaAc（pH=5.2），再加 660μL的无水乙醇（-20℃），-20℃静置 30min；4℃，10000r·min-1
沈阳农业大学学报，2008－12，39(6)：669-672
Journal of Shenyang Agricultural University，2008－12，39(6)：669-672
第 39卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
表 1 供试百合材料
Table 1 The materials of Lilium ssp.
编号 No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
种类 Species
丹东百合 Dandong Lily
江西九江野百合 Lilium brownii（jiangxi）
蓝田野百合 Lilium brownii（lantian）
宜昌百合 Lilium leucanthum
王百合 Lilium regale
素雅（铁炮百合） White Elegant(L)
晶体（铁炮百合）Gelris(L)
雪皇后（铁炮百合）Snow Queen(L)
白天堂（铁炮百合）White Heaven(L)
精粹（亚洲百合）Elite(A)
多安娜（亚洲百合）Pollyanna(A)
索邦（东方百合）Sorbonne(O)
西伯利亚（东方百合）Siberia(O)
来源 Source
丹东 Dandong, Liaoning Province, China
江西九江 Jiujiang, Jiangxi Province, China
陕西蓝田 Lantian, Shanxi Province, China
南京农业大学 Nanjing Agricultural University
沈阳农业大学 Shenyang Agricultural University
荷兰 Netherlands
荷兰 Netherlands
荷兰 Netherlands
荷兰 Netherlands
荷兰 Netherlands
荷兰 Netherlands
荷兰 Netherlands
荷兰 Netherlands
表 2 引物 Z1、Z2、Z5、Z9、Z16、Z17、Z18和 Z19的扩增结果
Table 2 The resault amplified using primers Z1, Z2, Z5,
Z9, Z16, Z17, Z18 and Z19
引物
Primer
Z1
Z2
Z5
Z9
Z16
Z17
Z18
Z19
引物碱基序列 5-3
Sequence (5-3)
GTGATCGCAG
CAATCGCCGT
CCACAGCAGT
GAACGGACTC
GATGACCGCC
AAAGCTGCGG
CCGCGTCTTG
GGACCTGCTG
扩增条带数
Amplified fragments
19
20
22
24
21
18
23
20
167
多态性条带数
Polymorphic fragments
19
19
22
24
20
17
23
20
164总计 Total
离心 10min；弃上清，加 500μL 70%乙醇洗涤 DNA；4℃，10000r·min-1离心 10min；弃上清，瞬时离心到 5000r·
min-1，弃上清，超净工作台风干 20min，加入 100μL ddH2O，4℃备用。 取 2μL DNA 提取液，加 5μL上样缓冲液，
用 0.8%琼脂糖凝胶，80V电压下电泳，考察 DNA 提取效果。
1.2.2 PCR扩增体系及程序 共选用 20个随机引物（Z1～Z20）。 PCR反应体系为：总体积 20μL，2.0μL随机引
物（10μmol·L-1），3.2μL dNTP（1mmol·L-1），2.0μL10×Buffer（不含 Mg2+），2.0μL Mg2+（25mmol·L-1），0.3μL Taq 酶
（5U·μL-1），2.0μL DNA 模板，不足部分用 ddH2O 补足。 反应程序为：94℃ 4min；94℃ 30s，38℃ 40s，72℃ 60s，
45个循环；72℃10min。 扩增产物采用 1.5%琼脂糖凝胶，80V电压下电泳，Kodak琼脂糖凝胶数码照相系统照相。
1.2.3 聚类分析 综合多个引物的扩增图谱，将 RAPD 图谱有带的记为“1”，无带记为“0”。 把 RAPD 图谱记录
数据录入 DPS v7.55，采用 Nei&Li聚类距离，类平均法（UPGMA）将 13个百合种质进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 百合叶片 DNA的提取结果
由图 1可知，采用百合叶片提取出的 DNA 主带明显，均无拖影，带型基本整齐一致，除 4，6，7，12号带较弱
外，其余条带都较亮。 可见，提取所得的 DNA 浓度较高，没有降解现象，可以满足 RAPD-PCR 扩增的要求。
2.2 百合叶片 DNA的 PCR扩增结果
供试的 20个引物中，有 8个引物扩增的带型较理想，多态性较好（表 2 和图 2），这 8 个引物 3 次重复扩增
的结果一致。8个引物共扩增出 167条带，其中多态性带有 164条，占总带数的 98.2%。平均每个引物扩增出 21
条带，其中引物 Z9扩增出的带最多（24条），Z17扩增出的带最少（17条）。
图 1 DNA模板质量
Figure 1 The quality of DNA plate
670· ·
第 6期
图 2 引物 Z1、Z2、Z5、Z9、Z16、Z17、Z18和 Z19扩增的 RAPD
图谱（M为 DNA分子量标准）
Figure 2 RAPD pattern amplified using primers Z1,Z2,Z5,
Z9,Z16,Z17,Z18 and Z19（M - standard DNA marker）
2.3 聚类分析结果
根据 8个引物的扩增条带的统计结果进行聚类分析，得到 13 个百合种质的遗传距离（表 3）和遗传聚类树
状图（图 3）。 13个百合种质在阈值为 0.38 处分为两大类，第 1 类群为东方百合杂种系（12，13）；第 2 类群为铁
炮系（6，7，8，9）、亚洲系（10，11）、丹东百合（1）和喇叭形野生百合（2，3，4，5），这一类群在阈值为 0.33 处分为两
类，一类为丹东百合和喇叭形野生百合，另一类为铁炮系和亚洲系。 丹东百合与喇叭形野生百合在阈值为 0.32
处分成两类，丹东百合和两种野百合为一类，宜昌百合和王百合为另一类。 在阈值为 0.26处铁炮系与亚洲系分
为两类。 丹东百合与 12个百合种质的遗传距离由大到小为 13＞12＞6＞11＞5＞3＞7＞4＞8＞10＞9＞2，与西伯利亚（13）
的遗传距离最大（0.4286），与江西九江野百合（2）的遗传距离最小（0.1852）。
表 3 13个百合种质间的遗传距离
Table 3 Genetic distance among 13 lilies
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
-
0.1852
0.3333
0.3103
0.3600
0.3846
0.3103
0.2903
0.2667
0.2727
0.3750
0.4074
0.4286
2
-
0.1200
0.3333
0.2308
0.4074
0.2667
0.3125
0.2258
0.2941
0.2727
0.2857
0.3103
3
-
0.4074
0.3043
0.5000
0.4074
0.4483
0.3571
0.4194
0.4000
0.4400
0.3846
4
-
0.2143
0.4483
0.3125
0.2941
0.2727
0.2778
0.3143
0.4667
0.4194
5
-
0.5200
0.2857
0.3333
0.3103
0.3125
0.2903
0.4615
0.4815
6
-
0.1724
0.2258
0.1333
0.3333
0.3750
0.4074
0.4286
7
-
0.1176
0.0909
0.2222
0.3143
0.4000
0.3548
8
-
0.0857
0.1579
0.2973
0.3125
0.2727
9
-
0.1892
0.2222
0.3548
0.3125
10
-
0.1282
0.3529
0.3714
11
-
0.3939
0.4118
12
-
0.2414
13
-
图 3 13个百合种质的聚类分析图
Figure 3 Dendrogram of cluster analysis for 13
lilies
3 结论与讨论
本研究通过 RAPD 分子标记技术，并结合形态特征分析认定来自辽宁省丹东市的野生百合种属于野百合
种， 同时也分析发现其与白天堂遗传距离最近， 遗传距离为 0.2667， 与西伯利亚遗传距离最远， 遗传距离为
0.4286。
由于百合鳞片中的多糖含量很高，多糖、多酚往往与 DNA缠在一起共沉淀，形成粘稠的褐色混合物而难以
罗凤霞等:应用分子标记探讨一种野生百合的分类地位 671· ·
第 39卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
得到适用于 RAPD的高质量的 DNA。因此本试验以嫩叶片做材料，采用改良 CTAB法提取基因组 DNA。本试验
研究表明：在阈值为 0.32处丹东百合与江西九江野百合、陕西蓝田野百合聚为一类，并且丹东百合与江西九江
野百合的遗传距离最小，结合形态特征初步认定其属于野百合（Lilium brownii）种，同时因野百合广泛分布于广
东、广西、湖南、湖北、江西、安徽、福建、浙江、四川、云南、贵州、陕西、甘肃和河南等省 [13]，故推测丹东百合很可
能是由其他省传入辽宁省丹东市的，然后经过多年栽培形成新的栽培变形；在阈值为 0.33 处丹东百合和两种
野百合与宜昌百合、王百合分为一类，张克中[7]采用 RAPD 标记分析了 25 个野生百合的亲缘关系，结果也认为
喇叭形的宜昌百合、淡黄花百合、王百合、百合（变种）亲缘关系很近，与本试验结论一致；丹东百合与铁炮百合
杂种系亲缘关系最近，其次是亚洲百合杂种系，亲缘关系最远是东方百合杂种系，这与孙晓梅[9]的研究结论稍有
差异，其通过 RAPD 技术分析了百合野生种及其栽培品种共 46 份材料的亲缘关系，发现野百合与亚洲百合杂
种系的亲缘关系最近，其次才是铁炮百合杂种系，与东方百合杂种系亲缘关系最远，造成这一差异的原因可能
是本试验样本群体较小，故后续试验应扩大群体数量。
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[责任编辑 马迎杰]
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