全 文 ：林业科学研究　2005, 18 (5) : 573～577
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2005) 0520573205
银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和序列分析
程水源 1, 2 , 杜何为 3 , 许　锋 1 , 陈昆松 1
( 11浙江大学果树研究所 ,浙江 杭州　310029; 21长江大学园艺园林学院 ,湖北 荆州　434025;
3. 长江大学生命科学学院 ,湖北 荆州　434025)
摘要 : 根据其他植物 PAL基因的 DNA序列的保守区域 ,设计了一对简并引物 ,经 PCR扩增 ,得到一条 862 bp的特
异性扩增带。将 PCR扩增产物构建到 T2载体并测序 ,获得了 862 bp DNA序列。通过分析所得的 862 bp DNA序列
及其编码的氨基酸序列 ,与其他植物 PAL基因的 DNA序列和蛋白质序列分别进行比较 ,证实了所得序列为银杏
PAL基因的部分序列。Gbpal1已经被 Genebank收录 ,序列号为 AY578145。Southern杂交结果表明银杏 PAL是一个
多基因家族。
关键词 :银杏 ; PAL;克隆 ; Southern blot
中图分类号 : S792195　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2004212202
基金项目 : 湖北省科技厅科技攻关重大项目 (2002AB094)
作者简介 : 程水源 (1965—) ,男 ,湖北天门人 ,教授 ,浙江大学在站博士后 1
M olecular C lon ing of Phenyla lan ine Amm on ia2lya se in G inkgo biloba
CHENG Shui2yuan1 , DU He2wei3 , XU Feng2 , CHENG Kun2song1
(1. Fruit Science Institute of Zhejiang University, Hangzhou　310000, Zhejiang, China; 2. College of Gardening and Horticulture,
Yangtze University, J ingzhou　434025, Hubei , China; 3. College of L ife Science, Yangtze University, J ingzhou　434025, Hubei , China)
Abstract:According to the conservative domain of some other p lants DNA sequences of PAL gene, a pair of degenerate
p rimer was designed1A special DNA fragment was obtained by PCR amp lifying, which length is 862 bp, and it is named Gb2
pal11W e analysed the nucleotide and am ino acid sequence of sm ilarity to the corresponding gene of other organism, the re2
sults showed that Gbpal1 is a partial PAL gene of Ginkgo biloba. The sequence had been embodied in Genebank, and Ac2
cession NO. is AY578145. The southern blot analysis indicated that Ginkgo biloba PAL belonged to a multigene fam ily.
Key words: Ginkgo biloba; PAL; cloning; southern blot
银杏 (Ginkgo biloba L1)叶片中的黄酮类化合物
具有重要的药用价值。黄酮类化合物在生物体内合
成代谢是从苯丙氨酸解氨酶 ( Phenylalanine ammo2
nia2lyase, PAL, E. C4. 3. 1. 5)催化苯丙氨酸脱氨反
应开始的 [ 1 ] ,通过莽草酸酯和醋酸 2丙二酸酯两条生
物合成途径合成并衍生为黄酮类化合物。研究表
明 , PAL活性与叶黄酮的合成积累成正相关 ,是银杏
叶黄酮合成代谢途径中的关键酶之一 [ 2 ]。许多研究
表明 ,不同植物中 PAL的活性不同 ,同一植物的不
同组织和器官间 PAL的活性也存在差异 ,如毛果杨
×美洲黑杨 ( Popu lus trichocarpa Torr1et Groy ×Popu2
lus deltoides Bartr1)的幼叶、顶芽、幼茎中 PAL活性
最高 ,而老茎和成熟叶中 PAL则很低 [ 3 ]。另外 , PAL
的表达受发育和环境信号 (如温度、光质、机械损伤、
激素和营养等 )的调节 ,表现出严格的组织和时间特
异性 [ 4 ]。在植物的抗病、抗胁迫、花色素的合成等方
面起着重要的作用。 PAL为多基因家族所编码 ,在
诸如马铃薯 (Solanum tuberosum L1)、拟南芥 (A rabi2
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18卷
dopsis tha liana (L1) Heynh1)、烟草 (N icotiana taba2
cum L1 )、黄瓜 ( Cucum is sa tivus L inn1 ) 以及大麦
(Hordeum vulgare L inn1) [ 5～9 ]等植物中 ,已克隆到了
编码这个酶的 cDNA片段或基因组序列。
银杏叶片中存在大量 PAL的表达并受发育和
环境信号的调节 [ 10 ] ,但编码银杏 PAL酶的 cDNA和
基因组序列仍有待研究。克隆银杏中 PAL基因对
了解这个基因的结构、进化及其表达调控具有重要
意义 ,同时也为旨在提高银杏叶片中类黄酮含量的
遗传改良提供了基因资源。本研究以银杏叶为试
材 ,利用 PCR技术克隆 PAL基因组序列 ,为 PAL表
达调控研究奠定了基础 ,所获得基因片段命名为 Gb2
pa l1。
1　材料与方法
111　材料
银杏品种家系佛手 ,由长江大学园艺园林学院
银杏课题组栽培、提供 ,采其幼叶贮藏于 - 70 ℃冰
箱中备用。
112　方法
11211　银杏叶片 DNA提取 　用改良的 CTAB法提
取。提取缓冲液成分为 : 10 mmol·L - 1 Tris2HCl
(pH值 8. 0) , 2 100 mmol·L - 1 NaCl, 50 mmol·L - 1
EDTA, 2% PVP, 2% CTAB, 140 mmol·L - 1 β2ME
(β2ME在使用前加 )。
11212　PAL基因 PCR扩增 　根据其他植物 PAL基
因中的保守序列 ,设计了一对简并引物 :
Sense p rimer: 5′GC (A /T/C) TC ( T/C /G) GGT
GAT (C /T) T(A /G) GT( T/C) 3′
Anti2sense p rimer: 5′ACA TCT TGG TT (A /G)
TG ( T/C) TGC TC 3′
PCR扩增反应液 : 10 ×Buffer 2. 5μL, 25 mmol·
L - 1 MgCl2 2 μL, 10 mmol ·L - 1 dNTPs 0. 5 μL,
10μmol·L - 1 left Primer、right Primer 1μL, 5u·μL
Taq酶 0. 2μL, 30 ng ·μL - 1 模板 DNA 1μL, 加
ddH2 O至 25μL,混匀后加一滴矿物油。
PCR反应扩增运行程序 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 1
m in, 48 ℃ 1 m in, 72 ℃ 1 m in, 35个循环 ; 72 ℃ 10
m in, 4 ℃ 30 m in。
11213　PCR产物的回收、克隆及测序　PCR产物的回
收 :将 PCR扩增产物在 10 mg·g- 1琼脂糖凝胶中电泳 ,
然后在紫外灯下切下目的带 ,再使用试剂盒回收。
使用试剂盒将回收的 PCR产物构建到 T2载体
中 ,连接反应如下 :
pMD 182T vector 1μL, PCR回收产物 1μL, liga2
tion solutionⅠ 5μL, ddH2 O 3μL。于 4 ℃连接 24 h,
然后把连接产物转化 E. coli DH5α菌株 ,筛选重组
子用于测序。
DNA序列相似性比较及氨基酸序列保守区域
预测在 NCB I站点上用 BLAST和 RPS2BLAST完成 ,
氨基酸序列比较在 EMBL站点上用 Clustal X 1. 81完
成 , DNA序列分析利用软件 DNA ssist完成。
11214　Southern blot分析 　用 H IND Ⅲ酶切银杏基
因组 DNA (15μg/ samp le) , 37 ℃下过夜 ,并不切断
Gbpal1。酶切产物在 10 mg·g- 1琼脂糖凝胶中电
泳 ,经变性后应用毛细管转移法将酶切片断转移至
Hybond2N +尼龙膜上 (Amersham Pharmacia, UK) ,在
膜上做好位置标记 , 依次用双蒸水和新鲜 0. 4 mol
·L - 1 NaOH 溶液浸泡 , 充分湿润和平衡固定。探
针制备利用所扩增 DNA 片断 ( 862 bp ) ,采用 Pro2
mega公司的 Primer2a2Gene Labeling System 试剂盒
标记。62 ℃预杂交 2 h,然后加入标记探针 55 ℃水
浴杂交 12 h ,洗膜条件参考 Sambrook[ 11 ]等。显影采
用富士 X光胶卷在室温下曝光 30 m in。
2　结果与分析
211　银杏 PAL基因 PCR扩增结果
使用简并引物 ,对银杏叶片 DNA 进行 PCR扩
增 ,将 PCR扩增产物于 10 mg·g- 1琼脂糖凝胶中电
泳、检测 ,电泳结果如图 1,可以看出 ,经 PCR扩增 ,
得到了一条近 900 bp的特异性 DNA片段。
图 1　PCR产物电泳
475
第 5期 程水源等 :银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和序列分析
212　PCR扩增产物的克隆及测序
从 10 mg·g- 1琼脂糖凝胶中回收近 900 bp特
异性 PCR扩增 DNA片段 ,将回收的 DNA片段克隆
于 T2载体 ,经克隆、酶切及 PCR验证再挑选阳性克
隆测序 ,得到了 862 bp的 DNA片段。核酸及编码氨
基酸序列结果如图 2。
图 2　Gbpal1核苷酸序列及推测的氨基酸序列 ,方框部分为高度保守氨基酸残基序列
213　核苷酸序列比较分析
登录 NCB I网址主页 ,使用 B last对 Gbpal1序列
进行分析比较 ,结果如表 1。Gbpa l1DNA 序列与其
他植物的苯丙氨酸解氨酶基因具有很高的同源性 ,
与其它植物的 PAL基因的同源性都在 79% ～82%
之间。氨基酸序列与长白松 ( P inus sy lvestris var. sy l2
vestriform is Cheng et C. D. Chu)、海岸松 ( P inus pinas2
ter A it. )、火炬松 ( P inus taeda L. )和亮石杉 ( Huper2
zia lucidu la (M ichx1) Ching ) PAL的氨基酸同源性分
别为 93%、93%、91%和 90%。说明所获得的 DNA
序列的确是银杏苯丙氨酸解氨酶基因的部分序列。
表 1　Gbpal1核苷酸序列与其他植物 PAL基因的同源性
基因登录号 物种
碱基同
源性 /%
同源碱
基数
E值
AF353986
长白松 Pinus sylvestris var1
sylvestriform is Cheng et C. D. Chu 83 842 e - 153
AY641535 海岸松 P inus pinaster A it. 83 842 e - 151
U39792 火炬松 P inus taeda L inn. 82 842 e - 146
AY803280
三穗石松 Lycopodium trislachyum
Pursh
78 434 8e - 25
AY803279
亮 石 杉 Huperzia lucidula
(M ichx. ) Ching 82 228 5e - 26
AB015871 葡萄 V itis vin ifera L. 79 226 3e - 15
X63103 马铃薯 Solanum. tuberosum L. 79 212 1e - 11
AY803286
心月藏叶瓶尔小草 O phioglossum
reticu la tum L.
78 267 1e - 08
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18卷
214　氨基酸比较分析
使用 Clustal X1. 81软件其它几种植物 PAL基因
的氨基酸序列与所克隆的序列推测的氨基酸序列进
行比较 ,部分比较结果如图 3。从 Clustal X1. 81分析
比较的结果可以看出 , Gbpal1编码的氨基酸序列与酵
母 (Saccharom yces cerevisiae var. )、菜豆 ( Phaseolus ra2
diatus L inn. )、毛果杨 ( Populus trichocarpa Torr1et
Groy)、水稻 (O ryza sativa L. )的 PAL基因的氨基酸序
列具有非常高的同源性 ,进一步证实了 Gbpal1的
DNA序列为银杏 PAL基因的部分序列。
图 3　不同植物 PAL氨基酸序列的 Clustal分析 ( Ginkgo, Accession NO: AY578145; P11544; Yeast, Accession NO:
P11544; Navy bean, Accession NO: P19143; Pop lar, : Accession NO: P45731; R ice, Accession NO: P14717)
215　Southern blot分析
Gbpal1序列的限制性酶切图谱如图 5 所示 ,
H IND Ⅲ酶切银杏基因组 DNA,不会切断 Gbpal1片
段。Southern blot结果表明 ,银杏 DNA被 H IND Ⅲ酶
切后杂交 ,在 0. 5 Kb～10. 3 Kb之间有 8条以上的
特异条带 ,说明银杏 PAL是一个多基因家族。这与
所报 道 的 拟 南 芥 ( A rabidopsis tha liana ( L. )
Heynh1) [ 6 ]、三叶草 ( Trifolium subterraneum L. ) [ 12 ]、
大麦 ( Hordeum vulgare L inn. ) [ 13 ]、马尾松 ( P inus
m asson iana Lamb. ) [ 14 ]和毛果杨 ( Populus trichocarpa
Torr1et Groy) [ 15 ] PAL多基因家族的结果是一致的 , PAL基因家族中有 3个以上的基因成员。3　讨论使用简并引物对银杏叶片 DNA 进行 PCR 扩增 ,成功克隆了银杏 PAL基因的部分序列 Gbpal1,该序列被 GeneBank收录 ,登录号为 AY578145。利用增调中限速酶得活性来调控黄酮含量 ,是一种非常有效的方法。对银杏叶黄酮代谢途径中关键酶PAL的分子水平上的研究具有重要的理论和生产实践意义 [ 2, 16 ]。银杏 PAL基因的克隆 ,对阐明银杏叶黄酮合成的分子机理、提高银杏叶黄酮的含量以及
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第 5期 程水源等 :银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和序列分析
指导银杏叶黄酮的遗传改良等具有十分重要的理论
价值和实际应用价值。目前银杏 PAL基因的全长
克隆及功能证实等相关研究工作正在进行。
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