全 文 ：收稿日期 : 2002212220
基金项目 : 江苏省农业三项工程“优良观赏保健绿化树种大叶冬青资源引进扩繁与开发”项目 SX(2001 - 068) 及“国
家天然林保育技术研究与示范”协作项目研究内容之一
作者简介 : 刘根林 (1963 —) ,男 ,江苏姜堰人 ,高级工程师.
林业科学研究　2003 ,16 (4) :439～443
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2003) 0420439205
优良保健树大叶冬青组培扩繁的研究
刘根林 , 李晓储 , 梁珍海 , 倪竞德 , 李玉巧 , 黄利斌
(江苏省林业科学研究院 ,江苏 南京　211153)
摘要 : 以大叶冬青具节茎段芽体增殖产生试管苗 ,适宜培养基为 MS + 1. 0μmol NAA + 8. 8μmol BA 或
MS + 1. 0μmol NAA + 9. 1μmol ZT;幼叶外植体诱导的愈伤组织块转培于 WPM + 5. 0μmol TDZ + 3. 0
μmol IAA 培养基上 ,能产生较多不定芽苗 (每一愈伤组织块平均产生 11. 2 株) ;BA 对大叶冬青外植体
不定芽的处理能产生较好的增殖系数与高生长 ;试管苗适宜生根处理为 1/ 4MS + 1. 0μmol NAA (或 +
1. 0μmol IBA) ;室外移栽成活率达 90 %。
关键词 : 大叶冬青 ;组培扩繁 ;具节茎段 ;不定芽苗
中图分类号 : S72213 + 7 　　　文献标识码 : A
大叶冬青 ( Ilex latifolia Thunb. )属冬青科 (Aquifoliaceae)冬青属 ( Ilex)常绿高大乔木 ,是自然
分布于我国长江以南地区的一种珍贵的观赏绿化树种。大叶冬青叶片含有多种药用成分 ,具
有很高的药理与保健作用 ,是国内保健饮品 ———苦丁茶的主要原料。所以 ,该树种具绿化、美
化与保健等多种功能[1 ,2 ] 。随着人民生活水平的提高 ,人们对优质天然保健饮品 ———苦丁茶
的需求量越来越大 ,而该树种常规的播种育苗因种子深休眠 ,一般发芽需 2 a 以上时间。扦插
能生根 ,但幼苗生长很慢。因此 ,该树种传统育苗方法 ,难以短期满足苗木市场的巨大需求。
利用组织培养可以在短时期内获得大量的优良无性系植株。
有关冬青属植物的组织培养至今已有不少报道[3～10 ] ,但是 ,由大叶冬青具节茎段诱导芽
体发生、增殖和从叶外植体诱导愈伤组织继而产生不定芽苗以及大叶冬青试管苗扩繁、室外移
栽等技术尚缺少较为完整的报道。本文特就大叶冬青组培扩繁技术研究进行了总结报道。
1 　材料与方法
1. 1 　供试材料
材料来自浙江省金华市引进的大叶冬青幼树 ,年龄 7 a ,树高 1 m ,胸径 2 cm。
1. 2 　培养条件与方法
11211 　大叶冬青具节茎段诱导芽体发生与增殖方法　接种培养基为 Andersson 的改良 MS 培
养基[10 ] ,蔗糖 30 g. kg - 1 ,琼脂 6. 5 g·kg - 1 ,pH值 5. 4 ,1. 0 kg·cm - 2热压灭菌 18 min ,培养基中分
别加入 1. 6 ,8. 8 ,11. 0μmol BA ;0. 8 ,1. 0 ,1. 3μmol NAA 和 4. 5 ,6. 8 ,9. 1μmol ZT。外植体来自当
年春发新枝具节茎段。每组接种 20 枚 (每瓶 1 枚) 。培养 40 d ,观察并记录芽体发生、生长与
增殖情况。培养室温度 27 ±1 ℃,光照强度 1 500 lx ,每日光照时间 8 h。
11212 　不定芽苗再生方法　将腋芽外植体接种于 MS 培养基上培养 15 d 后长出的幼叶切成
两半 ,接种于 WPM + TDZ + IAA 培养基上 ,激素浓度分别为 0. 1 ,1. 0 ,3. 0 和 5. 0μmol ,形成 16
种不同浓度配比的组合 ,暗处理 40 d ,形成愈伤组织 ,再置于 26 ±1 ℃,4 000 lx 与日光照 16 h
条件下培养 40 d ,诱导不定芽苗再生。观察、记录愈伤组织及不定芽苗的生长与增殖情况 ,并
通过细胞分裂素 BA、TDZ、ZT、KT与 22ip (22异戊烯基腺嘌呤) ,在 IAA 浓度为 5. 0μmol 时 ,了解
不定芽苗的增殖与高生长。
11213 　试管苗生根处理方法　生根处理培养基为 1/ 4MS ,在培养基中分别加入 0 ,0. 25 ,0. 50 ,
0. 75 ,1. 0μmol NAA 或 0 ,0125 ,0150 ,0175 ,110μmol IBA ,在半透性膜袋式容器中培养诱导 ,观察
并记录诱导生根情况。
11214 　室外移栽　将叶片舒展较好的具根小苗从瓶中取出 ,洗去根部粘着的琼脂后 ,移植至
小型塑料杯 (直径 5 cm)中 ,杯中培养基质分两层 :下层 (2/ 3) 消毒处理过的松林土 ,上层 (1/ 3)
细河沙。培养温度 25 ±1 ℃,光照 1 500 lx ,相对湿度 80 %～85 %。移栽后以 1/ 8MS 盐溶液每
隔 3 d 喷浇 1 次。3 周后 ,将成活小苗移栽至瓦盆 (直径 10 cm) 内 ,炼苗 3 周后移入实验田地
中。定期测定小苗生长情况。
2 　结果与分析
2. 1 　大叶冬青具节茎段芽体发生、生长及增殖
从表 1 可知 ,当接种培养基中加入 1. 0
μmol 的 NAA 时 ,具节茎段上芽体发生率最高
(89. 3 %) ;当培养基中另加入的 BA 浓度达
8. 8μmol 时 ,芽体发生率与芽体平均高度均
表现得较好。如果培养基中另加入的为 9. 1
μmol ZT ,芽体发生率最高 ,芽体平均高度较
好 ,芽体增殖能力也最强。因此 ,MS + 1. 0
μmol NAA + 8. 8μmol BA 或 MS + 1. 0 μmol
NAA + 9. 1μmol ZT为比较适宜于大叶冬青具
节茎段发生、生长与增殖的培养基。
2. 2 　不定芽苗的再生
表 1 　不同激素浓度组合对大叶冬青具节茎段
芽体发生、生长与增殖的影响
激素浓度/
μmol
芽体发生
率/ %
芽体平均
高度/ mm
丛生芽平均
数/ 个
NAA
0. 8 81. 2a — —
1. 0 89. 3c — —
1. 3 84. 1b — —
NAA + BA
1. 0 + 1. 6 90. 4a 17. 9a 4. 1a
1. 0 + 8. 8 93. 2b 21. 1c 5. 4b
1. 0 + 11. 0 93. 1b 18. 3b 6. 2c
NAA + ZT
1. 0 + 4. 5 91. 1a 19. 2a 5. 1a
1. 0 + 6. 8 93. 2b 21. 3c 6. 3b
1. 0 + 9. 1 95. 5c 18. 5b 7. 9c
　注 :数据处理根据最小显著差数法进行 , p = 0. 05 ; n = 20。
　　形成的愈伤组织培养 40 d 后 ,不同处理培养物上分化出不定芽苗 ,这些芽苗没有根 ,因此
可以断定它们属于器官发生而非体胚发生。由图 1 可知 , TDZ 能促进不定芽苗的再生 ,5. 0
μmol 的浓度比 3. 0μmol 的浓度更有效果。培养基为 WPM + 5. 0μmol TDZ + 3. 0μmol IAA 时 ,
平均每一愈伤组织块再生芽苗的数量可达 11. 2 株。在培养基 WPM + 5. 0μmol TDZ + 5. 0μmol
IAA 中能再生芽苗的有效愈伤组织块占培养总数的百分比为最高 ,达 60 % (见图 2) 。上述结
果与 1990 年 Al2Juboory[11 ]报道的培养在含 TDZ与 NAA 培养基上的阿尔及利亚常春藤 ( Hedera
canariensis L. )不定芽苗分化的情形大体相似。
044 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷
图 1 　TDZ与 IAA 对大叶冬青叶外植体
愈伤组织再生不定芽苗数的影响
　
图 2 　TDZ与 IAA 对大叶冬青叶外植体
有效愈伤组织块百分率的影响
　
　　细胞分裂素显著地影响着不定芽苗的增殖。如图 3 所示 ,BA、TDZ和 ZT比 KT与 22ip 更
能提高不定芽苗的增殖系数 ,最大增殖系数都出现在 5 个激素浓度都为 15. 0μmol 时。而芽苗
的高生长却随着 5 个相关激素浓度的增高而下降 (图 4) 。这说明细胞分裂素对芽苗的增殖与
高生长作用存在着显著差异。BA、TDZ与 ZT处理的最大增殖系数分别为 3. 7、6. 0 和 7. 4 ;在
BA 与 22ip 浓度都为 3. 0μmol 时 ,芽苗高度为最大 ,分别为 34 mm 与 45 mm ;而相同浓度下 ,KT、
TDZ和 ZT处理的芽苗高度则仅为 19、13 和 10 mm。从图 3、4 中还可知 ,在 IAA 浓度一定 (5. 0
μmol )时 ,高浓度的 BA (15. 0μmol ) 处理 ,芽苗增殖系数高 (3. 7) ;低浓度的 BA (3. 0μmol ) 处
理 ,芽苗高生长较好 (34 mm) 。这表明 ,作为细胞分裂素的 BA 对大叶冬青叶外植体不定芽的
处理 ,能够产生较好的增殖系数与高生长。
图 3 　几种细胞分裂素对不定芽苗增殖的影响
　
图 4 　几种细胞分裂素对不定芽苗高生长的影响
　
2. 3 　试管苗生根处理
从表 2 可知 ,在大叶冬青试管苗诱导生根处理中 ,存在着显著差异。当 NAA 与 IBA 浓度
最大 (1. 0μmol )时 ,出现了最多诱导根数、最短平均根长和最高生根率。此时最多诱导根数分
别为每株 6. 2 和 6. 4 根 ,而对照未产生根系。
2. 4 　生根处理中袋培与瓶培培养基用量的比较
培养基的用量是工厂化育苗成本的一个重要组成部分 ,因此 ,减少培养基用量 ,提高培养
基利用率 ,是降低生产成本的有效途径之一。
144第 4 期 刘根林等 :优良保健树大叶冬青组培扩繁的研究
传统的生根诱导 1 次需装入近 30 mL 的培养基 ,我们改用半透性膜袋式容器 ,以培养沟的
形式装入培养基 ,只需装 10 mL 就可达到瓶培装入 30 mL 所达到的高度 ,使培养基的利用率从
22. 85 %提高到 70. 0 %[12 ] 。
表 2 　不同 NAA或 IBA浓度对试管苗生根的影响
项目
NAA/μmol
0 0. 25 0. 50 0. 75 1. 0
IBA/μmol
0 0. 25 0. 50 0. 75 1. 0
根数/ (条·株 - 1) 0. 0a 2. 2b 3. 7c 5. 1d 6. 2e 0. 0a 2. 9b 4. 5c 5. 3d 6. 4e
平均根长/ mm 0. 0a 55d 50cd 45bc 37b 0. 0a 47d 35cd 32bc 26b
生根率/ % 0. 0a 45b 70c 100d 100d 0. 0a 50b 80c 100d 100d
　　注 :表中数据处理根据最小显著差数法进行 , p = 0. 05 ; n = 20 。
2. 5 　室内组培扩繁
通过上述大叶冬青具节茎段新芽发生、生长与增殖法和以幼叶外植体诱导愈伤组织继而
再生不定芽苗法 ,再进行继代培养 ,培养 1 个月 ,获得的继代培养平均增殖系数为 6. 0。通过 1
年多的组培及其扩繁 ,计生产出试管苗 30 000 株 ,为室外批量移栽提供了基础。
2. 6 　组培苗田间移栽效果
经移栽试验 ,室外移栽的 10 000 株试管苗有 90 %陆续木质化成活 ,生长良好。进入大田 ,
其无性系苗性状稳定。6 个月时 ,苗高生长达 5. 3 cm。
3 　小结
(1) 以大叶冬青具节茎段芽体增殖产生试管苗 ,适宜培养基为 MS + 1. 0μmol NAA + 8. 8
μmol BA 或 MS + 1. 0μmol NAA + 9. 1μmol ZT ,后者因玉米素 (ZT)昂贵 ,难为生产应用。
(2)幼叶外植体诱导的愈伤组织块转培于 WPM + 5. 0μmol TDZ + 3. 0μmol IAA 培养基上 ,
能产生较多不定芽苗 (每一愈伤组织块平均产生 11. 2 株) ;BA 对大叶冬青外植体不定芽的处
理能产生较好的增殖系数与高生长。
(3) 试管苗适宜生根处理为 1/ 4MS + 1. 0μmol NAA(或 + 1. 0μmol IBA) 。
(4) 半透性膜袋式容器内诱导生根比瓶装培养器提高了 47. 15 %。
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Techniques of Tissue Culture and in vitro
Clonal Propagation of Ilex latifolia
LIU Gen2lin , LI Xiao2chu , LIANG Zhen2hai , NI Jing2de , LI Yu2qiao , HUANG Li2bin
(Jiangsu Forestry Academy ,Nanjing 　211153 , Jiangsu , China)
Abstract : The optimum medium for in vitro growth and multiplication of Ilex latifolia from nodal segments was
MS + 1. 0μmol NAA + 8. 8μmol BA or MS + 1. 0μmol NAA + 9. 1μmol ZT. When calli resulted from cultured
young leaves were transferred to WPM supplemented with 5. 0μmol TDZ and 3. 0μmol IAA ,the most of adventi2
tious shoots (11. 2 per callus) formed. And BA was suitable for the multiplication and height growth of adventi2
tious shoots. 1/ 4 MS + 1. 0μmol NAA(or + 1. 0μmol IBA) optimized the rooting of shoots. And the plantlets
got acclimatized well , with the survival up to 90 %.
Keywords : Ilex latifolia ; clonal propagation ; nodal segment ; adventitious shoot
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2003 年 6 月
344第 4 期 刘根林等 :优良保健树大叶冬青组培扩繁的研究