全 文 ：DrugMetabDispos, 2002, 30(8):883-891.
[ 3] 　BARIRIANN, DESAGERJP, PETITM, etal.CYP3A4activity
infourdiferentanimalspecieslivermicrosomesusing7-benzy-
loxyquinolineandHPLC/spectrofluorometricdetermination[ J] .J
PharmBiomedAnal, 2006, 40(2):211-214.
[ 4] 　ZHUXH, LOUJS.EvaluationonselectiveprobesforCYP3A
[ J].ChinJClinPharmacolTher(中国临床药理学与治疗学),
2004, 9(4):365-369.
[ 5] 　GONZALEZRCB, HAWYLERJ, BOESSF, etal.Invitroin-
vestigationontheimpactofthesurface-activeexcipientsCremo-
phorEL, Tween80andSolutolHS15onthemetabolismofmid-
azolam[J] .BiopharmDrugDispos, 2004, 25(1):37-49.
[ 6] 　KIMRB, WANDELC, LEAKEB, etal.Interrelationshipbe-
tweensubstratesandinhibitorsofhumanCYP3AandP-glycopro-
tein[ J].PharmRes, 1999, 16(6):408-414.
[ 7] 　COTREAUMM, VONMOLTKELL, BEINFELDMC, etal.
Methodologiestostudytheinductionofrathepaticandintestinal
cytochromeP450 3AatthemRNA, proteinandcatalyticactivity
level[J] .JPharmacolToxicolMethods, 2000, 43(1):41-54.
[ 8] 　DEWILDTSN, KEAMSGI, LEEDERJS, etal.Cytochrome
P4503A:ontogenyanddrugdisposition[J] .ClinPharmacokinet,
1999, 37(8):485-505.
(收稿日期:2009-07-14)
基金项目:国家科技支撑计划(2007BAI27B06);海南省科技计划资助项目(081011);海南省自然科学基金资助项目(309029);广东省自然科学
基金团队项目(8351063201000003)
作者简介:张俊清 ,硕士 ,教授　　研究方向:药物质量标准及药物代谢动力学研究　　＊通讯作者:刘明生 , 男 ,教授　　研究方向:天然产物
化学研究　　Tel:(0898)66893826　　E-mail:pharmacy1999@hotmail.com
海南大叶冬青中 2种活性成分的含量研究
张俊清 1 ,谭银丰 1 ,李海龙1 ,刘明生 1＊ ,范春林 2 ,叶文才 2(1.海南医学院海南省热带药用植物研究开发重点实验室 , 海口
571101;2.暨南大学中药及天然药物研究所 ,广州 510632)
摘要:目的　建立同时测定海南大叶冬青叶中苦丁苷 A、D含量的高效液相色谱法。 方法　色谱柱:DikmaDiamonsilC18(4.6
mm×250mm, 5 μm)色谱柱;流动相:乙腈-水(36∶64);流速:1.0 mL· min-1;测定波长苦丁苷 A为 228 nm, 苦丁苷 D为 261
nm, 柱温 40℃。结果　线性范围苦丁苷 A为 0.190 ～ 5.80μg(r=0.999 9);苦丁苷 D为 0.236 ～ 7.100μg(r=0.999 9);平均
回收率(n=6)分别为 99.3%(RSD=1.6%)和 99.2%(RSD=1.3%)。结论　该法稳定 , 重现性好 , 操作简单 , 是测定大叶冬
青中苦丁苷 A和 D的较理想方法。
关键词:高效液相色谱法;大叶冬青;苦丁苷 A;苦丁苷 D
中图分类号:R284　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2010)09-0658-03
StudyonContentsofTwoActiveConstituentsinIlexlatifoliafromHainanProvince
ZHANGJun-qing1 , TANYin-feng1 , LIHai-long1 , LIUMing-sheng1＊ , FANChun-lin2 , YEWen-cai2(1.HainanMed-
icalCollege, HainanProvincialKeyLaboratoryofR＆DofTropicalHerbs, Haikou571101, China;2.InstituteofTraditionalChinese
MedicineandNaturalProducts, JinanUniversity, Guangzhou510632, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　ToestablishaHPLCmethodforthesimultaneousdeterminationofkudinosideAandDinleavesofIlex
latifolia.METHODS　ThesamplewasanalyzedonaDikmaDiamonsilC
18
(4.6 mm×250mm, 5μm)columnwithmobilephasecon-
sistingofacetonitrile-water(36∶64)attheflowrateof1.0 mL· min-1.Thedetectionwavelengthwas228 nmforkudinosideAand
261 nmforkudinosideD.Thecolumntemperaturewas40℃.RESULTS　Thecalibrationcurveswerelinearintherangesof0.190-
5.80 μg(r=0.999 9)forkudinosideA, 0.236-7.100μg(r=0.999 9)forkudinosideD.Theaveragerecoveries(n=6)were
99.24% (RSD=1.59%)and99.14% (RSD=1.29%)ofkudinosideAandD.CONCLUSION　Thismethodwasstableandac-
curate.It′ssuitabletodeterminekudinosideAandDinIlexlatifolia.
KEYWORDS:HPLC;Ilexlatifolia;kudinosideA;kudinosideD
　　大叶冬青(IlexlatifoliaThumb.)为冬青科冬青属
植物 ,主产于我国长江以南地区 。大叶冬青是中药苦
丁茶的正品来源之一 ,刘国民在海南岛发现了苦丁茶
的野生种大叶冬青 [ 1] ,并成功繁殖了数万株苗木。此
·658· ChinPharmJ, 2010May, Vol.45 No.9　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2010年 5月第 45卷第 9期
后 ,陶忠良在海南儋州引种大叶冬青成功 [ 2] 。本实验
所研究的即来自海南岛人工种植的大叶冬青。
大叶冬青含有三萜皂苷 、黄酮 、生物碱等多种化
学成分 [ 3] ,具有抗肿瘤 、降血糖及降血脂等药理作
用 [ 3] ,三帖皂苷类成分作为大叶冬青所含的重要活
性成分 ,尚未有对大叶冬青中苦丁苷 A、D[ 4-5]进行
含量测定的文献报道 。本实验在从海南大叶冬青中
分离制备出苦丁苷 A、D两种单体的基础上 ,建立了
其中苦丁苷 A、D两种成分同时测定的方法 ,以期更
好地对大叶冬青药材进行质量控制提供科学依据。
1　仪器与试药
Waters515 液相色谱系 统 (Waters515 泵;
2996PDA检测器 , DOA-V130 -BN真空泵 , 美国
Waters公司), CascadeIX超纯水器 (美国 Pal公
司), KR-702型离心机(日本 Kubota公司)。苦丁
苷 D、苦丁苷 A(广东省暨南大学药学院 ,纯度 99%
以上)。乙醇为分析纯 , 乙腈为色谱纯 ,水为超纯
水 。大叶冬青采于海南省万宁市 ,由中国医学科学
院药用植物研究所兴隆分所陈伟平教授鉴定为冬青
科冬青属大叶冬青。
2　方法与结果
2.1　对照品溶液
精密称取苦丁苷 D对照品 5.8mg、苦丁苷 A对
照品 7.1 mg、置 10mL量瓶中 ,甲醇溶解 、定容至刻
度 ,得 1号混合对照品溶液 ,稀释 6倍得到 2号混合
对照品溶液 ,临用前以 0.45 μm微孔滤膜过滤 。
2.2　供试品溶液
精密称取大叶冬青细粉 0.4 g,置具塞锥形瓶
中 ,加入体积分数 70%乙醇 50 mL,称定质量 ,沸水
浴回流提取 30min,放冷后补重 ,摇匀 ,即得 。使用
前以 0.45 μm微孔滤膜过滤 。
2.3　色谱系统适用性研究
色谱柱:DiamonsilC18柱(4.6 mm×250 mm, 5
μm);流动相:乙腈-水 (36∶64);流速:1.0 mL·
min-1;测定波长苦丁苷 A为 228 nm,理论塔板数
6 000以上;苦丁苷 D为 261 nm,理论塔板数 6 000
以上;柱温 40 ℃。色谱图见图 1。
2.4　线性关系考察
分别精密吸取 1号混合对照品溶液 2、4、6、8、
10 μL,另分别吸取 2号混合对照品溶液 2、4、6、8、
10 μL,分别注入液相色谱仪中 ,按 “ 2.3”色谱条件
测定。以对照品含量(μg)为横坐标(X),对应峰面
　　
图 1　对照品(A)与大叶冬青样品(B、C)HPLC图谱
Fig.1　HPLCChromatogramsofreferencesubstances(A)and
sampleofIlexlatifolia(B、C)
积(A)为纵坐标(Y),绘制标准曲线 ,苦丁苷 A、苦丁
苷 D的回归方程依次如下:
苦丁苷 D:Y=1.80 ×106 X-6.97 ×103 , r=
0.999 9,线性范围 0.190 ～ 5.800μg;苦丁苷 A:Y=
4.64 ×105 X-3.41 ×103 , r=0.999 9, 线性范围
0.236 ～ 7.10 μg。
2.5　精密度实验
精密吸取供试品溶液 10μL,按 “2.3”色谱条件
重复进样 6次 ,求得峰面积相对标准偏差(RSD)苦
丁苷 A为 1.58%;苦丁苷 D为 0.67%,说明仪器精
密度良好 。
2.6　稳定性实验
供试品溶液在室温下放置 ,按 “2.3”色谱条件 ,
在放置 0, 1 , 2, 4, 6, 8, 10 h进样测定 ,进样量为 10
μL,求得峰面积相对标准偏差 (RSD)苦丁苷 A为
1.58%;苦丁苷 D为 0.67%,说明供试品在 10 h内
稳定性良好。
2.7　重复性实验
取大叶冬青粉末 0.400 0 g,共 6份 ,按 “ 2.2”项
下方法制备 ,按 “2.3”色谱条件各取 10μL进行测定 ,
求得峰面积相对标准偏差 (RSD)苦丁苷 A为
0.91%;苦丁苷 D为 0.55%,说明该方法重复性良好。
2.8　加样回收率实验
取已知苦丁苷 A、苦丁苷 D含量的大叶冬青粉末
·659·中国药学杂志 2010年 5月第 45卷第 9期　　　　　　　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2010May, Vol.45No.9
6份 ,每份约 0.250 0g,精密称定 ,分别置具塞锥形瓶
中 ,每组分别加入一定量的对照品溶液 ,按 “2.2”项下
方法制备 ,按 “2.3”色谱条件各取 10 μL进行测定 ,根
据测定结果 ,计算加样回收率 。结果见表 1。
2.9　样品含量测定
精密称取大叶冬青粉末 0.400 0 g,共 6份 ,按
“ 2.2”项下方法制备 ,取 10 μL进样测定。结果见
表 2。
3　讨　论
3.1　本实验在比较了大叶冬青用 3种不同体积分
数(60%、 70%、 80%)的甲醇 、乙醇超声提取 、水浴
回流提取的提取效率 ,结果表明 ,供试品用 70%乙
醇水浴加热回流 30 min提取效率最高。
3.2　采用 PDA检测器在 200 ～ 400 nm内分别扫
描苦丁苷 A、苦丁苷 D对照品溶液 ,结果苦丁苷
D在 261 nm处有最大吸收 ,苦丁苷 A在 203 nm
处有最大吸收 ,但此处溶剂末端吸收干扰较大 ,
为提高对检测的灵敏度和准确度 ,苦丁苷 A选择
次低吸收峰 228 nm处为测定波长 ,苦丁苷 D选
择 261 nm为测定波长 。
3.3　在流动相选择实验中 ,考察了甲醇 -水溶液系
统和乙腈 -水溶液系统 ,结果表明 ,乙腈-水溶液系统
可使样品中待测成分得到满意的分离 ,且时间较短。
3.4　实验结果表明 ,大叶冬青中苦丁苷 D、苦丁苷
A含量较高 ,均为三贴皂苷类有效成分 ,选择该 2种
主要有效成分作为大叶冬青质量控制指标成分是可
行的 。
表 1　回收率实验结果
Tab.1　Resultofrecovery
Component Original/μg
Added
/μg
Found
/μg
Recovery
/%
Averagerecovery
/%
RSD
/%
kudinosideA 1.508 0.645 2.143 98.4 99.3 1.6
1.508 0.645 2.159 101.0
1.382 1.183 2.540 97.9
1.382 1.183 2.584 101.6
1.276 1.638 2.889 98.5
1.276 1.638 2.885 98.2
kudinosideD 0.421 0.527 0.942 98.9 99.2 1.3
0.421 0.527 0.953 100.9
0.386 0.967 1.344 99.1
0.386 0.967 1.356 100.3
0.356 1.338 1.661 97.5
0.356 1.338 1.670 98.2
表 2　大叶冬青中 2种活性成分的百分含量测定结果 .n=6, x±s
Tab.2　Determinationof2activeconstituentsinIlexlatifolia.n=6, x±s
Lot
number
KudinosideA KudinosideD
Content/% Average/% RSD/% Content/% Average/% RSD/%
1 2.11 0.59
2 2.10 0.59
3 2.12 2.10±0.01 0.71±0.00 0.59 0.59±0.00 0.54±0.00
4 2.08 0.58
5 2.09 0.59
6 2.09 0.59
REFERENCES
[ 1] 　LIUGM.Areportonthediscoveryofthewildkudingteatreein
Hainanislandandtheobservationofitsbotaniccharacteristicsand
properties[ J].NatSciJHainanUniv(海南大学学报:自然科
学版), 1997, 15(2):129-133.
[ 2] 　TAOZL.IntroductionandcultureofIlexlatifoliainDanzhou,
Hainan[J] .SubtroPlantSci(亚热带植物科学), 2001, 30
(2):42-45.
[ 3] 　SHURG, YAOMN, MINL.Researchadvancesinchemical
componentsandpharmacologyofdiferentoriginsofKudingTea
[ J] .JJiangxiUnivTraditChinMed(江西中医学院学报),
2008, 20(6):91-94.
[ 4] 　OUYANGMA, WANGHQ, CHENZL, etal.Triterpenoidgly-
cosidesfromilexKudingcha[ J] .Phytochemistry, 1996, 43(2):
443-445.
[ 5] 　OUYANGMA, WANGHQ, CHENZL, etal.Triterpenesand
triterpenoidglycosidesfromtheleavesofIlexKudingcha[ J].
Phytochemistry, 1996, 41(3):871-877.
(收稿日期:2009-08-03)
·660· ChinPharmJ, 2010May, Vol.45 No.9　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2010年 5月第 45卷第 9期