全 文 ：林业 科 学 研 究 《 ,
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文章编号 一 《《 陌 】 刃
银杏细胞培养中影响黄酮积累量的几个因素
房建军 ’, 阀国宁‘ , 韩一凡“
中国林业科学研究院亚热带林业研究所 , 浙江 富阳 中国林业科学研究院林业研究所 , 北京 口义阴
摘要 以幼苗茎段为外植体建立了生长黄酮的悬浮细胞培养体系 , 对细胞生长周期 、相应的黄酮积累量变化以及苯
丙氨酸解氨酶 活性进行了研究 。 结果表明 , 黄酮的积累在细胞生长对数期内增加 , 于 巧 达最高峰 。 在黄
酮积累的过程中以 活性也呈增加趋势 。 当培养细胞转换新鲜培养基时 , 活性增加了 倍 从 到 巧
。 用紫外线处理 , 培养于暗中细胞的 活性增加了 倍 从 到 。
关键词 银杏 黄酮 细胞培养 苯丙氨酸解氨酶 紫外光
中图分类号 文献标识码
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一 一
银杏 几 叶提取物中含有两类重
要的生理活性物质 —黄酮类化合物和菇内醋
, 这
些物质具有治疗和预防心脑血管疾病的能力 , 可用
于开发药品 、保键食品和化妆品 , 现世界上 已公认是
治疗脑动脉硬化最有效的药物之一 , 银杏提取物 占
有的市场份额排名均属植物药前 位川 。 离体条件
下研究植物次生物质的规律是常用的研究手段 , 也
是细胞工程的前期工作 , 作者试图以细胞培养的方
式研究银杏黄酮的积累情况 , 研究影响黄酮积累的
几个因素 。 目前 , 这一领域的研究 已涉及 余种
植物 , 多种物质 , 紫草 咖 盯
·
、人参 二 、黄连
枷 〕
、毛地黄 。心。
, 和长春花 。
等植物的提取物已实现工业化生产〔’〕但对于
多数物质的研究尚处于前期工作 , 对次生代谢物形
成的营养条件和光温气热等物理条件都所知不多 ,
尚不能用于工业化生产 。 发达国家如 日本 、德国 、韩
国等已对生物反应器内的微环境作出了很多研究 ,
研究与应用均走在世界前列 〔’〕。 我国虽然有植物资
收稿日期 一 一 修回 日期 朋 一伪
基金项 目 年林业部重点实验室基金 银杏离题培养与黄酮积累
作者简介 房建军 一 , 男 , 内蒙古宁城县人 , 博士
林 业 科 学 研 究 第 卷
源优势 , 坦此类研究呕待提高 。 总之这是一个具有
潜在价仁、的研究领域 , 也是植物生物技术的一个重
要组成部分 , 越来越引起人们重视 。
的变化情况 。 从黄酮的积累量看 , 基本与生长呈正
相关 , 即生长迅速的时候黄酮积累量也越多 。
妙喇鸽今留界
八共护,石甘﹃︸
材件与方法
愈伤组织的获得 培养基与外植体等详细
内容见落 考文献 〔 〕。 外植体为幼苗茎段 , 培养于
八 · 一 ’ 『 · 一 ’ 蔗糖
· 一 ’ , 州 值 的培养基 中 , 分光暗两种培养条
件
细胞悬浮培养 筛选愈伤组织并进行悬浮
培养
,
括仲量约 , 采用摇瓶培养 , 基本培
养基为
· 一 ’ · 一 ’
蔗糖
· 一 ’ 值 恒温摇床转速
·
, , 、 ,
一
‘ , 振幅为 。 温度设为 ℃ , 光照
·
’ 海瓶培养液 。 细胞生长用生物量作为
指标 , 士升诈一定时间后细胞悬浮液过滤 , 所得细胞于
弋 卜供 「至恒质量 ’一 。
, 紫外光照射 将 培养 个周期的细
胞转入 改径 的已灭菌的培养皿 中 , 用波长为
阴 , 的紫外光分别照射 、
、 , 再培养
、 、 、 、
后测定 的活性 。
苯丙氨酸解氨酶 活性测定 在 ℃
卜, 将处 于对数生长期的 细胞加人
‘ , · ’硼酸缓冲液 , 内含
· 一 ’
琉基乙阵 , 冰浴研磨 ,
· 一 ‘离心 巧
, 上
清液用作酶检测 。 检测反应 酶液加
, , 、 · 』 的苯丙氨酸 , ℃反应 印 , 然后于紫外
分光光 变计 波长下比色 , 测定光密度 “ 。
〕黄酮 总量 的测定 黄酮 总量 的测定采用
」 ·。 比色法 ’ 。
结果与分析
细胞的生长周期与黄酮积累
经观测 , 细胞干质量的变化基本上呈一条 “ ”
形曲线 图 , 其干质量积累随着培养时间的变化
而变化 生长滞后期约 , 在 内 , 细胞总
量缓慢增加 在 巧 内细胞增加的梯度较为
明显 , 与快速生长期 巧 后为生长稳定或衰老期 。
斤胡胞开始解体死亡 ,
一
干质量开始减少 , 在此实
验条们 卜, 细胞生长周期约为 。 如需继代培养 ,
要在第 左右转培养基 。 经过 的悬浮培养 ,
衍间限 取样 , 测定细胞鲜干质量与总黄酮含量
亡一 总黄酮含量
一。一细胞干质量
一洲,召‘亡、︸舟,穿。局
·
助且、咧如陇枢喃
时间
图 细胞生长过程中干质量与黄酮积累的变化情况
谢启昆等 ’」的研究表明 , 培养细胞的生长与次
生代谢物积累的关系大体上有 种类型 第 类 , 细
胞生长与代谢产物呈平行关系 , 如烟碱
、托品碱
、
蕙
酮等 第 类 , 细胞停止生长或死亡时代谢物产量最
高 , 如多酚与紫草素 第 类 , 产物的产生 曲线 比细
胞生长线推迟一些 , 如薯裁皂贰元 。 从本实验的结
果可看出 , 银杏的细胞培养基本上呈现出第 类 , 有
人也称之为偶联关系 , 由此可反映初级代谢对次级
代谢的主导作用 。
细胞生长过程中 活性的变化
图 说明了整个培养过程中 活性的变化 ,
在培养的一开始 , 可见 以 活性有一个短时间的升
高 , 出现在转换到新的培养基上之后不久 , 在类似的
研究中此类现象被称之为 “ 稀释效应 ” ‘ 」 于第
天时又有一个高峰 , 巧 后酶活性逐渐下降 。
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一 细胞干质量峨卜 以 活性
妙喇唱十盈界
时间
图 细胞生长过程中 活性的变化
紫外光照射对 的影响
光是细胞培养过程中最重要的因素之一 , 不同
波长的光会影响生物合成过程中酶的诱导 。 从图
可以看出 , 暗培养的细胞接受 后 , 其 活性增
加了 , 照射可引起 倍的瞬间升高 , 但光下
培养的细胞则没有这种变化 图 。 在对照中只看
到了微弱的稀释效应 。 在很多报道中 , 活性增
第 期 房建军等 银杏细胞培养中影响黄酮积累量的几个因素
强的最高峰在受到光 、致伤 、真菌侵害后的 , 但
由于细胞的异质性 , 本实验中在继代后 均
能看到这种变化 。 光暗两种细胞的不同表现可能是
因为 在光下的细胞中已经积累了一定数量的次生
代谢产物 , 产物抑制效应可能是一个主要原因 。
成酶 及一些基因在转录水平上活性提高的
结果 , 这反应了在外界条件改变的情况下 , 各种调
控因子综合作用所表现的结果 , 同时也反应了次生
代谢物研究的复杂性 。
︸、飞一︵︶划鹅曰山
时间
一奋一照射 面 闷 , 阳 照射 照射 面 长
图 对暗中培养细胞 活性的影响
一
亡尸 照射 一仁卜 照射
一 照射
今卜
丹皿
⋯
︸
︵︶和解闷
时间
图 对光下培养细胞 活性的影响
苯丙氨酸解氨酶 以 , 催化
苯丙氨酸直接脱氨产生反式肉桂酸 , 是苯丙烷类代
谢途径的关键酶和限速酶 , 它是连接初生代谢和苯
丙烷类代谢的纽带 , 成为植物次生代谢中研究得最
多的酶 。 酶蛋 白由 个亚基组成 , 编码
的基因是一个多基因家族 , 不同的基因可被不同的
因素所诱导 , 如 机械损伤 、真菌细胞壁诱导因子 、
各种类型 的光等等 , 因此是诱导酶 。 实验结果
表明 , 活性的增加在第 天时达到最高值 , 而
在此时细胞生长速率也达到最高 , 之后 , 酶的活性
又开始下降 , 细胞生长速率也随之下降 , 而银杏黄
酮的积累于 巧 时达到顶峰 , 这说明银杳黄酮 的
积累之前先有一个酶的活性增加过程 , 而终产物的
出现还存在滞后性 。 在紫外光照射培养于两种条
件下细胞中 活性研究的结果耐人寻味 。 据报
道 ‘“ 〕, 受紫外光照射时细胞 内大量积累类黄酮物
质 , 以吸收紫外光 类黄酮物质的积累是查尔酮合
讨论
国外有人作过 旨在产生菇 内醋的银杏细胞培
养〔川 , 但含量很低 , 远不能达到工业化生产的要求 。
本文以幼苗茎段为材料 , 得到了分散性良好的愈伤
组织 , 建立了悬浮培养体系 , 在研究方法上有了新的
尝试 , 为以后的进一步工作开了个头 。 至于银杏培
养细胞能否象紫草素一样进行工业化生产 , 尚有很
多工作要做 。 本文的研究表明 银杏细胞中不但含
有黄酮 , 而且初步分析其含量高于同等生长时间的
植物材料 , 这为以后的研究提供了基础数据 。
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