全 文 ：林业科学研究摇 圆园员猿渊专刊冤院园园员 园园愿云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员猿冤专刊鄄园园园员鄄园愿
落叶松实时定量 孕悦砸内参基因的筛选
吴摇 涛员袁圆裕袁 李万峰员裕袁 张俊红员袁 韩素英猿袁 杨文华员袁 齐力旺员鄢
渊员郾 中国林业科学研究院林业研究所袁 北京摇 员园园园怨员曰 圆郾 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室袁
云南省森林植物培育与开发利用重点实验室袁 云南 昆明摇 远缘园圆园员曰 猿郾 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所袁 北京摇 员园园园怨员冤
收稿日期院 圆园员猿鄄园愿鄄圆圆
基金项目院 国家野怨苑猿冶计划项目渊圆园园怨悦月员员怨员园远冤曰国家自然科学基金渊猿园愿猿园园愿远袁猿员圆园园源远源冤曰国家野愿远猿冶计划项目渊圆园员员粤粤员园园圆园猿袁
圆园员猿粤粤员园圆苑园源冤 资助
裕为共同作者援
作者简介院 吴 摇 涛 渊员怨苑怨要冤袁男袁云南宣威人援 助理研究员袁主要从事林木生物技术方面的研究援 耘鄄皂葬蚤造院 赠灶葬枣憎贼岳 员圆远援 糟燥皂袁电
话院员猿缘圆怨圆员员苑猿远援
李万峰渊员怨苑怨要冤袁男袁河南南阳人援 助理研究员袁主要从事林木生长发育方面的研究援 耘鄄皂葬蚤造院造蚤憎枣岳 糟葬枣援 葬糟援 糟灶袁电话院园员园 原 远圆愿愿怨远圆愿
鄢通讯作者院 分子遗传学博士袁研究员袁博士生导师袁从事林木遗传改良研究工作援 耘鄄皂葬蚤造院造憎择蚤岳 糟葬枣援 葬糟援 糟灶袁电话院园员园鄄远圆愿愿愿源源缘
摘要院本研究针对日本落叶松渊蕴葬则蚤曾 噪葬藻皂责枣藻则蚤 渊蕴葬皂遭援 冤 悦葬则则援 冤体细胞胚胎发育过程中原胚团时期到胚胎成熟时期尧
种子萌发过程尧植株幼年生长阶段和成年生长阶段等生长发育过程中的 猿员 份材料袁应用实时荧光定量 孕悦砸渊择孕悦砸冤
技术袁分析了 员圆 个持家基因渊粤悦栽源尧粤孕皂尧悦澡糟尧郧葬责糟尧砸孕蕴员尧砸孕蕴圆尧耘云员尧耘云圆尧藻陨云尧耘猿哉蕴尧哉月匝和 哉孕蕴圆冤在这 猿员 份材料
中的表达情况遥 经 早藻晕燥则皂和 晕燥则皂云蚤灶凿藻则两种分析软件对这 员圆 个持家基因进行表达稳定性分析袁结果表明院粤孕皂在
不同器官尧体细胞胚胎发育和种子萌发过程中表达均最为稳定曰耘云员 在不同生长年龄植株的顶梢中表达最为稳定曰
藻陨云在不同年龄植株的针叶中表达最为稳定遥 分析结果表明袁针对不同的研究材料和发育阶段应选择适合的持家基
因做内参基因使用遥 进行基因表达细微差异研究时袁可根据需要使用 圆 个或 圆 个以上内参组合遥
关键词院落叶松曰持家基因曰择孕悦砸曰基因表达曰稳定性
中图分类号院杂苑怨员援 圆圆 文献标识码院粤
杂贼葬遭蚤造蚤贼赠 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 砸藻枣藻则藻灶糟藻 郧藻灶藻泽 枣燥则 蕴葬则糟澡 郧藻灶藻
耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 杂贼怎凿蚤藻泽 遭赠 匝怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 砸藻葬造鄄栽蚤皂藻 孕悦砸
宰哉 栽葬燥员袁圆袁 蕴陨 宰葬灶鄄枣藻灶早员袁 在匀粤晕郧 允怎灶鄄澡燥灶早员袁 匀粤晕 杂怎鄄赠蚤灶早猿袁 再粤晕郧 宰藻灶鄄澡怎葬员袁 匝陨 蕴蚤鄄憎葬灶早员
渊员郾 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬曰圆郾 再怎灶灶葬灶 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 枣燥则 悦燥灶泽藻则增葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 砸葬则藻袁
耘灶凿葬灶早藻则藻凿 葬灶凿 耘灶凿藻皂蚤糟 云燥则藻泽贼 孕造葬灶贼泽 燥枣 杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁 再怎灶灶葬灶 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 枣燥则 云燥则藻泽贼 孕造葬灶贼 悦怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶 葬灶凿 哉贼蚤造蚤扎葬贼蚤燥灶曰
再怎灶灶葬灶 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 运怎灶皂蚤灶早摇 远缘园圆园员袁 再怎灶灶葬灶袁 悦澡蚤灶葬曰 猿郾 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥则藻泽贼 耘糟燥造燥早赠袁 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼 葬灶凿
孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽澡藻 泽藻造藻糟贼蚤燥灶 燥枣 泽怎蚤贼葬遭造藻 则藻枣藻则藻灶糟藻 早藻灶藻 蚤泽 葬灶 蚤皂责燥则贼葬灶贼 责则藻则藻择怎蚤泽蚤贼藻 枣燥则 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠鄄
泽蚤泽 遭赠 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 渊 择孕悦砸冤援 栽澡藻 葬怎贼澡燥则泽 蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻凿 贼澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 泽贼葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 员圆 藻灶凿燥早藻灶燥怎泽
澡燥怎泽藻鄄噪藻藻责蚤灶早 早藻灶藻泽 渊粤悦栽源袁 粤孕皂袁 悦澡糟袁 郧葬责糟袁 砸孕蕴员袁 砸孕蕴圆袁 耘云员袁 耘云圆袁 藻陨云袁 耘猿哉蕴袁 哉月匝 葬灶凿 哉孕蕴圆冤 蚤灶 猿员
泽葬皂责造藻泽 燥枣 蕴葬则蚤曾 噪葬藻皂责枣藻则蚤 渊蕴葬皂遭援 冤 悦葬则则援 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 灶藻藻凿造藻泽袁 泽贼藻皂泽袁 则燥燥贼泽袁 责燥造造藻灶泽袁 扎赠早燥贼蚤糟 藻皂遭则赠燥泽 葬灶凿 泽燥皂葬贼蚤糟
藻皂遭则赠燥泽援 栽澡藻 郧藻晕燥则皂 葬灶凿 晕燥则皂云蚤灶凿藻则 葬造早燥则蚤贼澡皂泽 葬灶葬造赠泽蚤泽 则藻增藻葬造泽 贼澡葬贼 贼澡藻 粤孕皂 蚤泽 贼澡藻 皂燥泽贼 泽贼葬遭造藻 早藻灶藻 葬皂燥灶早 凿蚤枣鄄
枣藻则藻灶贼 燥则早葬灶泽 葬灶凿 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼葬造 泽贼葬早藻泽 渊 泽燥皂葬贼蚤糟 藻皂遭则赠燥早藻灶藻泽蚤泽 葬灶凿 泽藻藻凿 早藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶冤袁 耘云员 葬灶凿 藻陨云 葬则藻 皂燥泽贼 泽贼葬鄄
遭造藻 葬皂燥灶早 泽贼藻皂泽 葬灶凿 灶藻藻凿造藻泽 凿怎则蚤灶早 责造葬灶贼 早则燥憎贼澡 渊怨园 凿葬赠泽袁 员援 缘 赠藻葬则泽袁 缘 赠藻葬则泽袁 员园 赠藻葬则泽袁 圆缘 赠藻葬则泽 葬灶凿 缘园 赠藻葬则冤袁
则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 憎燥怎造凿 责则燥增蚤凿藻 燥责贼蚤皂怎皂 蚤灶贼藻则灶葬造 则藻枣藻则藻灶糟藻 早藻灶藻泽 枣燥则 造葬则糟澡 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 怎泽蚤灶早
择孕悦砸援
运藻赠 憎燥则凿泽院 蕴葬则蚤曾曰 澡燥怎泽藻鄄噪藻藻责蚤灶早 早藻灶藻曰 择孕悦砸曰 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰 泽贼葬遭蚤造蚤贼赠
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
基因表达的变化是调控生命活动过程的核心机
制遥 通过比较同一类或不同种类细胞在不同发育阶
段或不同生理条件下的基因表达差异袁可为分析生
命活动过程提供重要信息咱员暂 遥 因此袁基因表达分析
在发现和预测新的基因及其功能尧了解基因表达调
控的复杂网络等研究中起着重要作用遥 在转录水平
上研究基因表达的变化主要方法有基因芯片分析
渊皂蚤糟则燥葬则则葬赠冤尧晕燥则贼澡藻则灶 杂交渊晕燥则贼澡藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早冤和实
时定量 孕悦砸渊择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸袁择孕悦砸冤等遥
其中袁为精确判断基因表达的水平袁需要用一个稳定
的组成性表达的持家基因渊澡燥怎泽藻鄄噪藻藻责蚤灶早 早藻灶藻冤作内
部标准渊即内参冤来对未知样本 砸晕粤 量进行校正和
均一化咱圆 原 源暂 遥 但是袁持家基因并非在不同个体尧不同
发育阶段尧不同器官或部位尧不同生理状态或不同实
验条件下都稳定表达咱缘 原 远暂 遥 运用未经筛选的持家基
因对目的基因表达水平进行均一化袁常得到不同的
甚至是相反的结果咱苑暂 遥 因此袁针对特定对象和具体
研究目的进行基因表达水平研究时袁选择合适的持
家基因是确保分析结果准确的关键遥
择孕悦砸是一种将 糟阅晕粤 合成与 孕悦砸 技术结合用
以分析基因 砸晕粤表达水平的快速尧灵敏的方法遥 在
择孕悦砸 分析中袁常用来做内参基因的持家基因有
郧粤孕阅匀尧 粤悦栽陨晕杂尧 哉月陨匝哉陨栽陨晕尧 悦再悦蕴韵孕匀陨蕴陨晕袁 则砸晕粤
等咱圆 原 远暂 遥 择孕悦砸相关研究的早期袁人们在没有更好的
内参基因供选择的情况下袁往往采用传统的持家基
因作内参基因而不考虑其在该实验条件下的表达是
否会发生变化遥 现在袁多项研究已表明袁持家基因在
不同的组织器官尧发育时期或生理状态下的表达并
非恒定袁如杨树基因表达研究最常使用的 员园 个持家
基因在不同组织尧不同发育阶段和不同实验条件下
的表达并不稳定咱愿暂 遥 哉凿增葬则凿蚤等咱怨暂在野择孕悦砸的 员员 条
黄金法则冶中强调袁要根据文献或研究目的从至少 源
个候选内参基因中选择最稳定的持家基因作为内参
基因遥 本文以日本落叶松渊蕴葬则蚤曾 噪葬藻皂责枣藻则蚤 渊蕴葬皂遭援 冤
悦葬则则援 冤不同发育过程中的组织为材料袁利用 择孕悦砸技
术分析了 员圆 个持家基因 渊 粤悦栽源尧粤孕皂尧悦澡糟尧郧葬责糟尧
砸孕蕴员尧砸孕蕴圆尧耘云员尧耘云圆尧藻陨云尧耘猿哉蕴尧哉月匝 和 哉孕蕴圆冤的
表达水平袁并利用 郧藻晕燥则皂咱员园暂和 晕燥则皂云蚤灶凿藻则咱员员暂软件
对其表达变化进行比较分析袁以期筛选出落叶松不
同发育阶段内表达最稳定的持家基因袁为运用 择孕悦砸
技术开展落叶松基因表达分析提供支持遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 实验材料
本研究共用 猿员 份材料袁包括日本落叶松胚性细
胞系 韵远猿愿 增殖 圆 凿尧员源 凿和萌发 员圆 澡尧圆 凿尧愿 凿尧员源 凿尧
圆圆 凿尧圆愿 凿尧猿缘 凿尧源怨 凿 的体细胞胚胎曰种子萌发 园 澡
渊干种子冤尧员 凿渊吸胀冤尧苑 凿渊胚根冤时的种胚曰植株生
长 怨园 凿尧员援 缘 葬尧缘 葬尧员园 葬尧圆缘 葬尧缘园 葬 的顶梢及其上面
的针叶曰员 年生植物的根尧茎尧叶袁种子萌发时的种
胚袁萌发 圆员 凿幼苗的针叶袁圆园 葬生植株的花粉等 远 个
不同器官遥 采集不同发育阶段的同一组 辕类样品时袁
均选择在上午 员园要员圆 点进行遥 采集的样品迅速放
入液氮中速冻 员 圆 澡 后置于 原 愿园益冰箱中保存
待用遥
员郾 圆摇 研究方法
员援 圆援 员摇 择孕悦砸引物设计摇 根据本研究组获得的日本
落叶松体转录组数据咱员圆暂 袁选择 员圆 个其它植物 择孕悦砸
研究中常用的持家基因作为候选内参渊表 员冤袁运用
孕则蚤皂藻则 责藻则皂蚤藻则 缘援 园 软件设计 员圆 对持家基因的特异
引物袁引物由上海生工渊北京合成部冤合成遥
员援 圆援 圆 摇 总 砸晕粤 提取和 糟阅晕粤 合成 摇 使用 栽则蚤扎燥造
渊陨灶增蚤贼则燥早藻灶冤提取上述 猿员 个样品的总 砸晕粤遥 所有样
品先用 砸晕葬泽藻鄄枣则藻藻 阅晕葬泽藻 处理袁以消除可能存在的
阅晕粤污染曰经 晕阅员园园园 测定浓度后袁取 圆 滋早 总 砸晕粤
进行反转录反应遥 反转录反应总体积 源园 滋蕴袁反应
体系院愿 滋蕴 月怎枣枣藻则袁圆 滋蕴 砸陨 砸晕葬泽藻 陨灶澡蚤遭蚤贼燥则袁圆 滋蕴 韵造蚤鄄
早燥 渊凿栽冤员愿 责则蚤皂藻则袁源 滋蕴 凿晕栽孕 酝蚤曾袁圆 滋蕴 砸藻增藻则泽藻 贼则葬灶鄄
泽糟则蚤责贼葬泽藻遥 源圆益袁员 澡曰苑园益袁缘 皂蚤灶终止反应遥
员援 圆援 猿摇 择孕悦砸体系和程序摇 采用荧光染料法进行检
测遥 试剂使用 杂再月砸 襆 孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬择栽酝渊栽葬运葬砸葬冤袁
扩增过程在 苑缘园园 砸藻葬造 栽蚤皂藻 孕悦砸 杂赠泽贼藻皂 渊粤责责造蚤藻凿 月蚤鄄
燥泽赠泽贼藻皂冤上完成遥
将 猿员 个样品的 糟阅晕粤模板各取 圆 滋蕴 等量混合
后袁用 砸晕葬泽藻鄄枣则藻藻 匀圆韵稀释 员园 倍后用作候选内参引
物扩增曲线尧熔解曲线分析时的模板遥 候选内参引
物的扩增效率通过对 糟阅晕粤原液的等量混合模板的
员园 倍梯度稀释产物执行标准曲线作图后袁以其斜率
带入公式后换算获得袁计算公式为院扩增效率渊耘枣枣蚤鄄
糟蚤藻灶糟赠冤袁 耘 越 员园 原员 辕 泽造燥责藻袁其中袁 泽造燥责藻 为标准曲线的
斜率遥
在对 猿员 个样品进行扩增时袁糟阅晕粤 模板均是反
转录原液的 员园 倍稀释产物遥 反应体系渊圆园 滋蕴冤院猿 滋蕴
圆
专刊 吴摇 涛等院落叶松实时定量 孕悦砸内参基因的筛选
表 员摇 员圆 个持家基因及其扩增引物信息
名称 引物序列 渊缘忆鄄猿忆冤 扩增产物长度 辕 灶贼 耘杂栽编号 蛋白功能注释
粤悦栽源 云砸
栽郧悦栽栽郧粤栽栽悦栽郧郧悦郧粤栽郧郧
悦栽悦栽郧悦郧郧栽栽郧栽郧郧栽郧粤粤郧 员远员 允砸员源远猿愿怨 细胞骨架结构蛋白
粤孕皂 云砸
悦郧悦粤粤栽郧粤悦悦悦栽郧郧粤粤粤郧
粤郧粤栽郧郧栽郧郧悦粤粤郧郧粤粤粤粤 远园 允砸员源园圆缘猿 网格蛋白配体复合物亚基
悦澡糟 云砸
郧悦悦粤悦粤郧悦粤郧栽栽栽粤悦粤郧郧粤
悦栽悦郧郧悦郧粤栽栽郧粤栽粤郧悦粤栽粤 怨苑 允砸员缘园缘圆猿 网格蛋白重链成分
郧葬责糟 云砸
郧郧郧栽悦粤粤栽郧粤郧悦粤悦悦粤粤栽粤
悦悦栽栽悦粤粤悦粤粤栽悦悦悦粤粤粤悦栽 员员愿 允砸员缘源猿愿园 磷酸甘油醛脱氢酶 悦亚基
砸孕蕴员 云砸
栽郧粤悦悦粤栽粤郧粤粤栽粤悦郧粤悦悦悦栽
栽郧栽栽粤栽郧栽粤栽粤郧悦悦郧栽郧悦悦 员怨缘 允砸员源圆苑缘园 缘园杂核糖体蛋白 蕴圆
砸孕蕴圆 云砸
栽粤栽郧粤粤悦粤郧栽栽粤栽悦郧悦悦栽悦悦
栽郧栽悦悦栽粤栽悦粤栽栽郧粤悦悦悦栽悦栽 缘苑 允砸员源园员员源 缘园杂核糖体蛋白 蕴圆猿
耘云员 云砸
郧粤悦栽郧栽粤悦悦栽郧栽栽郧郧栽悦郧栽郧
悦悦栽悦悦粤郧悦粤郧粤郧悦栽栽悦粤栽 员圆缘 允砸员源远圆怨愿 延伸因子 员鄄琢
耘云圆 云砸
栽栽悦郧栽悦悦悦栽粤栽栽栽悦栽郧郧栽栽
悦悦栽悦栽栽粤郧郧悦栽悦粤郧粤悦粤悦悦 员员苑 允砸员缘员远圆远 延伸因子 员鄄琢
藻陨云 云砸
郧悦粤郧粤粤悦粤悦栽栽悦粤郧悦粤粤郧郧
悦粤悦栽栽悦悦郧粤粤粤栽粤栽悦粤郧悦粤栽栽郧 员猿缘 允砸员缘猿苑园缘 翻译起始因子鄄员
耘猿哉蕴 云砸
栽悦悦粤郧悦悦粤郧栽悦栽栽悦栽悦悦粤郧
栽悦栽郧悦悦栽悦悦粤栽栽栽郧郧栽粤栽郧悦 员愿源 允砸员缘苑缘远园 耘猿 泛素连接酶
哉月匝 云砸
郧郧悦栽栽粤栽栽栽悦悦栽悦郧栽悦悦粤栽
栽栽栽郧悦悦粤栽粤粤悦栽悦郧栽悦悦悦 员园源 允砸员缘圆源源远 泛素连接酶
哉孕蕴圆 云砸
栽栽悦悦粤郧悦悦郧粤粤悦悦悦栽粤粤栽
悦粤粤悦悦粤悦悦悦栽悦悦悦粤粤栽粤粤 苑猿 允砸员缘猿猿怨愿 泛素连接酶 哉孕蕴圆
糟阅晕粤 模板袁员园 滋蕴 杂再月砸襆 孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬择栽酝袁上下游
引物各 园援 源 滋蕴遥 择砸栽鄄孕悦砸扩增程序为院怨缘益袁圆 皂蚤灶曰
源园 个循环院怨缘益袁员缘 泽曰远园益袁员 皂蚤灶遥 每个样本重复 猿
次遥 扩增程序结束之后进行熔解曲线分析并对扩增
产物进行电泳袁确认扩增产物的单一性遥
员援 圆援 源摇 数据分析摇 初始数据使用 耘曾糟藻造 进行整理袁
得到各持家基因在 猿员 个样品中的平均循环阈值
渊皂藻葬灶 悦栽冤遥 表达水平变化幅度用箱线图渊月燥曾责造燥贼冤
进行展示遥 持家基因在不同发育时期的稳定性袁采
用内参基因稳定性分析软件 早藻晕燥则皂 和 晕燥则皂云蚤灶凿藻则
分别进行分析后比较 圆 种分析结果的一致性遥
以特定候选内参基因在各组样品内表达量最低
的平均循环阈值渊最大的 悦栽 值冤做减数袁其它样品
的平均循环阈值分别减去该值袁得到的差值经
圆渊 原 驻悦栽冤换算后作为 郧藻晕燥则皂 和 晕燥则皂云蚤灶凿藻则 软件分析
所需的数据遥 运行软件后获得各基因所有样品和分
组样品的稳定性数值袁根据稳定值进行候选内参基
因的排序遥 郧藻晕燥则皂 程序计算每个基因表达稳定度
的平均值 酝袁对内参基因的表达稳定度进行排序渊酝
值越小袁表达越稳定冤袁并通过内参基因标准化因子
的配对差异分析渊灾灶辕 灶 垣 员 冤来判定内参基因的最适数
目遥 晕燥则皂云蚤灶凿藻则程序针对每个基因生成一个稳定测
量值袁该值越小说明基因表达越稳定遥 组间样品允
许直接估测表达变化和根据模型库中表达相近的方
法排列基因遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 总 砸晕粤的提取质量
提取的总 砸晕粤 经 晕阅员园园园 检测袁 粤圆远园 辕 粤圆愿园 为
员郾 愿园 员援 怨缘袁粤圆远园 辕 粤圆猿园比值 员援 愿缘 圆援 园圆袁浓度为 圆园园
源缘园 灶早窑滋蕴 原员遥 员援 园豫 琼脂糖凝胶电泳检测总
砸晕粤质量袁圆愿杂与 员愿杂形成两条明显的带袁说明提取
的总 砸晕粤纯净度高尧完整性好袁满足反转录和定量
实验要求遥
圆援 圆摇 持家基因的引物检测及扩增效率
择砸栽鄄孕悦砸技术敏感性强袁引物扩增的特异性和
扩增效率都会对实验结果的准确性造成影响遥 员圆
个候选内参基因均产生扩增曲线袁表明引物能够正
常工作遥 熔解曲线也表明扩增产物单一尧不存在非
特异性扩增袁反应条件和退火温度的参数设置较为
适宜遥
琼脂糖凝胶电泳结果显示渊图 员冤袁员圆 个候选内
参基因的扩增产物大小符合表 员 中所列的预期片段
长度袁泳道内条带单一袁非模板对照渊晕栽悦冤无条带袁
说明引物特异性强遥
猿
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
栽院模板曰晕栽悦院非模板对照曰酝院酝葬则噪藻则
图 员摇 员圆 个持家基因的 择孕悦砸产物的电泳结果
用 员园 倍系列梯度稀释的模板浓度作横坐标袁循
环阈值渊悦栽冤作纵坐标袁分别绘制 员圆 个持家基因的
标准曲线袁获得它们的标准曲线的相关系数渊砸圆 冤和
扩增效率渊耘冤袁砸圆 在 园援 怨苑圆 园援 怨怨怨 之间袁耘 在 怨圆援
猿豫 员园圆援 远豫之间遥 引物检测及扩增效率分析结果
表明袁员圆 个持家基因的引物设计及扩增结果符合
择孕悦砸实验对引物的要求遥
圆援 猿摇 持家基因的表达水平变化情况
在同一阈值的设定条件下袁分析 员圆 个持家基因
在 猿员 个样品中的平均循环阈值渊悦栽冤袁其表达水平
可用 悦栽 大小分为高尧中尧低 猿 种类型院高度表达类型渊悦栽臆圆猿援 缘冤袁如 耘云员渊平均 悦栽 值为 圆员援 苑愿 依 圆援 园员冤和
郧葬责悦渊圆猿援 园缘 依 员援 怨园冤曰中度表达类型渊圆猿援 缘 约 悦栽 约圆愿援 园冤袁如 砸孕蕴员渊圆猿援 缘怨 依 员援 怨怨冤尧藻陨云渊圆猿援 愿园 依 员援 员远冤尧
耘云圆渊圆缘援 园源 依 员援 苑远冤尧砸孕蕴圆 渊圆缘援 圆圆 依 圆援 远怨冤尧粤悦栽源
渊圆远援 源圆 依 圆援 园缘冤尧耘猿哉蕴渊圆远援 愿远 依 员援 远圆冤尧哉孕蕴圆渊圆远援 怨圆
依 员援 远缘冤曰低度表达类型渊悦栽逸圆愿冤袁如 悦澡糟渊圆愿援 缘员 依猿援 园源冤尧哉月匝渊圆愿援 缘怨 依 圆援 远远冤尧粤孕皂渊圆怨援 圆苑 依 员援 猿园冤遥
图 圆 为 员圆 个持家基因表达水平的箱线图袁其直
观地呈现出基因在 猿员 个样品间的表达水平变化情
况遥 由图能够看出袁员圆 个基因的 悦栽 值在所有样品
中的分布整体上看较为集中袁最集中的是 藻陨云袁最分
散的是 砸孕蕴圆袁未出现偏离的极端值遥
摇 摇 注院矩形盒上下边界分别对应上四分位数和下四分位数袁内部粗横线代表中位数袁矩形盒
外的上下延伸线分别代表最大值和最小值遥
图 圆摇 持家基因表达水平变化的箱线图分析
源
专刊 吴摇 涛等院落叶松实时定量 孕悦砸内参基因的筛选
圆援 源摇 持家基因的稳定性分析
箱线图展示了 员圆 个持家基因在 猿员 个样品中整
体的基因表达情况袁同时其离散程度也概要性地表
明持家基因在所有样品中的基因稳定性遥 为了进一
步找出不同器官和不同发育阶段最适合的内参基因
或内参组合袁本研究采用 早藻晕燥则皂和 晕燥则皂云蚤灶凿藻则两种
软件程序对其稳定性进行了排序遥
圆援 源援 员摇 早藻晕燥则皂 分析摇 猿员 个样品分为 缘 组袁分别是
不同器官尧体细胞胚胎增殖和成熟不同阶段尧种子萌
发不同阶段尧茎的不同生长阶段和叶的不同生长阶
段遥 早藻晕燥则皂软件分析结果表明渊表 圆冤袁员圆 个持家基
因根据稳定值从小到大袁即稳定性从最稳定到最不
稳定排序分别是院不同器官院粤孕皂 跃 耘猿哉蕴 跃 藻陨云 跃
哉孕蕴圆 跃 哉月匝 跃 耘云员 跃 砸孕蕴员 跃 耘云圆 跃 郧葬责糟 跃 砸孕蕴圆 跃
悦澡糟 跃 粤悦栽源曰体细胞胚胎增殖和成熟不同阶段院粤孕皂
跃 哉孕蕴圆 跃 耘云员 跃 砸孕蕴圆 跃 郧葬责糟 跃 藻陨云 跃 耘云圆 跃 砸孕蕴员 跃
哉月匝 跃 耘猿哉蕴 跃 粤悦栽源 跃 悦澡糟曰种子萌发不同阶段院粤孕皂
跃 耘云圆 跃 悦澡糟 跃 耘云员 跃 藻陨云 跃 哉孕蕴圆 跃 哉月匝 跃 郧葬责糟 跃
砸孕蕴员 跃 耘猿哉蕴 跃 砸孕蕴圆 跃 粤悦栽源曰茎的不同生长阶段院
耘云员 跃 郧葬责糟 跃 砸孕蕴圆 跃 粤孕皂 跃 粤悦栽源 跃 悦澡糟 跃 哉孕蕴圆 跃
砸孕蕴员 跃 耘猿哉蕴 跃 藻陨云 跃 耘云圆 跃 哉月匝曰叶的不同生长阶
段院藻陨云 跃 耘云员 跃 哉月匝 跃 哉孕蕴圆 跃 郧葬责糟 跃 粤孕皂 跃 悦澡糟 跃
耘猿哉蕴 跃 砸孕蕴员 跃 砸孕蕴圆 跃 耘云圆 跃 粤悦栽源遥
表 圆摇 员圆 个持家基因用 早藻晕燥则皂分析的稳定值及其排名情况
基因 器官 辕组织稳定值 排名
体细胞胚胎
稳定值 排名
种子萌发
稳定值 排名
茎
稳定值 排名
针叶
稳定值 排名
粤悦栽源 圆援 圆员园 员圆 员援 园园猿 员员 圆援 源怨愿 员圆 园援 苑员愿 缘 员援 猿猿远 员圆
粤孕皂 员援 圆怨源 员 园援 缘远源 员 园援 愿园愿 员 园援 远源猿 源 园援 源愿圆 远
悦澡糟 圆援 员怨园 员员 员援 缘缘远 员圆 园援 愿圆园 猿 园援 苑缘员 远 园援 缘员园 苑
耘猿哉蕴 员援 猿猿愿 圆 园援 怨愿怨 员园 员援 员缘员 员园 园援 苑怨员 怨 园援 远源源 愿
耘云员 员援 远愿愿 远 园援 远园缘 猿 园援 怨圆猿 源 园援 缘苑远 员 园援 源猿缘 圆
耘云圆 员援 愿远远 愿 园援 远缘怨 苑 园援 愿员源 圆 园援 怨源猿 员员 园援 苑愿猿 员员
藻陨云 员援 猿远远 猿 园援 远源缘 远 园援 怨缘源 缘 园援 愿源怨 员园 园援 源圆远 员
郧葬责糟 圆援 园猿苑 怨 园援 远员源 缘 员援 园愿远 愿 园援 远猿缘 圆 园援 源缘圆 缘
砸孕蕴员 员援 愿远园 苑 园援 远远缘 愿 员援 员猿猿 怨 园援 苑愿怨 愿 园援 远苑员 怨
砸孕蕴圆 圆援 园源园 员园 园援 远园怨 源 员援 圆猿缘 员员 园援 远源员 猿 园援 远怨缘 员园
哉月匝 员援 缘苑远 缘 园援 苑猿猿 怨 园援 怨愿圆 苑 员援 缘源缘 员圆 园援 源猿苑 猿
哉孕蕴圆 员援 缘猿远 源 园援 缘愿圆 圆 园援 怨远远 远 园援 苑愿园 苑 园援 源猿愿 源
月藻泽贼 早藻灶藻 粤孕皂 粤孕皂 粤孕皂 耘云员 藻陨云
早藻晕燥则皂软件同时能够给出最适内参组合数目袁
当默认取舍值小于 园援 员缘 时袁即当 灾灶辕 灶 垣 员 约 园援 员缘 时袁
表明 灶个基因渊组合冤可作为 择砸栽鄄孕悦砸的内参基因袁
此时使用更多的内参基因袁并不能进一步增加分析
结果的准确性遥 本研究列出了 缘 组样品的 灾灶辕 灶 垣 员值
渊表 猿冤袁除不同器官样品组的 灾灶辕 灶 垣 员值始终大于 园郾 员缘
之外袁体细胞胚胎增殖和成熟不同阶段尧种子萌发不
同阶段尧茎的不同生长阶段和叶的不同生长阶段 源
组样品的 灾圆 辕 猿分别为 园援 园愿圆尧园援 园远怨尧园援 园苑苑 和 园郾 园缘园袁
均小于默认设定值袁所以这 源 组样品需要的最适内
参数目均为 圆 个袁分别是 粤责皂和 悦澡糟渊体细胞胚胎冤尧
粤孕皂和 哉月匝渊种子萌发冤尧耘云员 和 郧葬责悦渊茎冤尧藻陨云 和
耘云员渊叶冤遥 不同器官样品组的 灾灶辕 灶 垣 员值较大的原因袁
可能是该组内样品时间跨度大渊从 员葬生到 圆园葬 生以
上冤尧器官差异大渊从合子胚尧子叶到根尧茎尧叶和花
粉冤所致遥 灾葬灶凿藻泽燥皂责藻造藻咱员园暂在 早藻晕燥则皂操作手册中也
提出袁灾灶辕 灶 垣 员值设定为 园援 员缘 并非总是必要遥 本研究
考虑到对其引入更多的内参袁并不能降低 灾灶辕 灶 垣 员值袁
故参考 灾猿 辕 源的值渊园援 员愿冤相对较小的情况袁认为其最
适内参数目为 猿 个渊粤孕皂尧藻陨云和 耘猿哉蕴冤遥
表 猿摇 持家基因配对差异分析结果
项目 器官 辕组织 体胚 种子萌发 茎 针叶
灾圆 辕 猿 园援 圆员 园援 园愿 园援 园苑 园援 园愿 园援 园缘
灾猿 辕 源 园援 员愿 园援 园愿 园援 园怨 园援 员园 园援 园源
灾源 辕 缘 园援 圆员 园援 园苑 园援 员猿 园援 园怨 园援 园源
灾缘 辕 远 园援 圆园 园援 园远 园援 员猿 园援 园愿 园援 园源
灾远 辕 苑 园援 圆员 园援 园远 园援 员园 园援 园苑 园援 园源
灾苑 辕 愿 园援 圆员 园援 园缘 园援 园怨 园援 园苑 园援 园缘
灾愿 辕 怨 园援 员怨 园援 园远 园援 园愿 园援 园愿 园援 园远
灾怨 辕 员园 园援 员苑 园援 园苑 园援 员园 园援 园苑 园援 园缘
灾员园 辕 员员 园援 员苑 园援 园愿 园援 员园 园援 园苑 园援 园远
灾员员 辕 员圆 园援 员远 园援 员猿 园援 圆员 园援 员圆 园援 员员
圆援 源援 圆 摇 晕燥则皂云蚤灶凿藻则 分析 摇 晕燥则皂云蚤灶凿藻则 软件与
缘
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
早藻晕燥则皂软件类似袁也是通过稳定值对候选内参基因
的稳定性进行评价和排序遥 晕燥则皂云蚤灶凿藻则 分析结果表
明渊表 源冤袁员圆 个候选内参基因根据稳定值从小到大袁
即稳定性从最稳定到最不稳定排序分别是院不同器
官院粤孕皂 跃 耘猿哉蕴 跃 藻陨云 跃 哉月匝 跃 哉孕蕴圆 跃 耘云员 跃 砸孕蕴员 跃
耘云圆 跃 砸孕蕴圆 跃 郧葬责糟 跃 粤悦栽源 跃 悦澡糟曰体细胞胚胎增殖和
成熟不同阶段院哉孕蕴圆 跃 粤孕皂 跃 砸孕蕴圆 跃 郧葬责糟 跃 藻陨云 跃
耘云员 跃 砸孕蕴员 跃 哉月匝 跃 耘云圆 跃 粤悦栽源 跃 耘猿哉蕴 跃 悦澡糟曰种子
萌发不同阶段院粤孕皂 跃 悦澡糟 跃 耘云圆 跃 耘云员 跃 藻陨云 跃 哉孕蕴圆
跃 砸孕蕴员 跃 哉月匝 跃 砸孕蕴圆 跃 郧葬责糟 跃 耘猿哉蕴 跃 粤悦栽源曰茎的
不同生长阶段院耘云员 跃 砸孕蕴圆 跃 郧葬责糟 跃 粤孕皂 跃 哉孕蕴圆 跃
粤悦栽源 跃 悦澡糟 跃 砸孕蕴员 跃 耘猿哉蕴 跃 藻陨云 跃 耘云圆 跃 哉月匝曰叶的
不同生长阶段院 藻陨云 跃 耘云员 跃 哉孕蕴圆 跃 郧葬责糟 跃 悦澡糟 跃
哉月匝 跃 粤孕皂 跃 砸孕蕴员 跃 耘猿哉蕴 跃 砸孕蕴圆 跃 耘云圆 跃 粤悦栽源遥
表 源摇 员圆 个持家基因用 晕燥则皂云蚤灶凿藻则分析的稳定值及其排名情况
名称 器官 辕组织稳定值 排名
体胚
稳定值 排名
种子萌发
稳定值 排名
茎
稳定值 排名
针叶
稳定值 排名
粤悦栽源 员援 猿园圆 员员 园援 缘苑圆 员园 员援 苑园怨 员圆 园援 猿圆愿 远 园援 怨园园 员圆
粤孕皂 园援 圆园苑 员 园援 员猿圆 圆 园援 园圆圆 员 园援 圆源猿 源 园援 员缘苑 苑
悦澡糟 员援 猿员愿 员圆 员援 园源远 员圆 园援 园圆圆 圆 园援 猿缘缘 苑 园援 员员缘 缘
耘猿哉蕴 园援 猿缘缘 圆 园援 远猿园 员员 园援 苑圆远 员员 园援 猿怨怨 怨 园援 猿苑源 怨
耘云员 园援 苑源苑 远 园援 圆猿怨 远 园援 圆源苑 源 园援 园苑园 员 园援 园远源 圆
耘云圆 员援 园园苑 愿 园援 猿园苑 怨 园援 园苑园 猿 园援 缘缘员 员员 园援 源猿怨 员员
藻陨云 园援 源园员 猿 园援 圆猿苑 缘 园援 源猿员 缘 园援 源苑源 员园 园援 园源愿 员
郧葬责糟 员援 员苑圆 员园 园援 圆园圆 源 园援 远远远 员园 园援 圆员愿 猿 园援 员员缘 源
砸孕蕴员 园援 怨愿远 苑 园援 圆缘缘 苑 园援 缘园怨 苑 园援 猿愿园 愿 园援 猿源员 愿
砸孕蕴圆 员援 员缘员 怨 园援 员猿远 猿 园援 远圆源 怨 园援 员猿圆 圆 园援 猿怨愿 员园
哉月匝 园援 远怨员 源 园援 圆愿源 愿 园援 缘缘远 愿 员援 园圆缘 员圆 园援 员员愿 远
哉孕蕴圆 园援 远怨苑 缘 园援 员员怨 员 园援 源愿猿 远 园援 猿圆远 缘 园援 员园怨 猿
月藻泽贼 早藻灶藻 粤孕皂 哉孕蕴圆 粤孕皂 耘云员 藻陨云
圆援 源援 猿 摇 早藻晕燥则皂 与 晕燥则皂云蚤灶凿藻则 分析结果的比较 摇
早藻晕燥则皂与 晕燥则皂云蚤灶凿藻则的分析结果整体较为一致袁不
同器官尧种子萌发不同阶段尧茎和叶的不同生长阶段
最稳定的候选内参基因分别都是 粤孕皂尧粤孕皂尧耘云员 和
藻陨云袁仅体细胞胚胎增殖和成熟不同阶段的最稳定候
选内参存在微小差异遥 早藻晕燥则皂 中最稳定的候选内
参是 粤孕皂渊稳定值 园援 缘远源冤袁哉孕蕴圆 紧随其次渊稳定值
园援 缘愿圆冤曰晕燥则皂云蚤灶凿藻则 中最稳定的候选内参是 哉孕蕴圆
渊稳定值 园援 员员怨冤袁粤孕皂 紧随其次渊稳定值 园援 员猿圆冤遥
两种分析方法获得的候选内参基因的稳定性排序结
果基本一致袁相互之间存在微小的次序变动渊图 猿冤遥
对两种方法得到的稳定值进行相关性分析袁二者之
间的相关系数 砸圆 分别为 园援 怨苑怨 远渊器官冤尧园援 怨苑猿 怨
渊体胚冤尧园援 愿怨猿 怨渊种子萌发冤尧园援 怨缘苑 园渊茎冤尧园援 怨苑圆 源
渊叶冤袁表明两种分析结果的一致性高遥
猿摇 小结与讨论
本研究根据落叶松转录组数据袁从中选出
粤悦栽源尧粤孕皂尧悦澡糟尧郧葬责糟尧砸孕蕴员尧砸孕蕴圆尧耘云员尧耘云圆尧 藻陨云尧
耘猿哉蕴尧哉月匝和 哉孕蕴圆 员圆 个持家基因作为候选内参基
因袁对其在落叶松体细胞胚胎发育的原胚团时期到
胚胎成熟时期尧种子萌发过程尧植株幼年生长阶段和
成年生长阶段等个体发育过程中的 猿员 个样品中表
达的稳定性进行了分析袁结果表明 粤孕皂尧耘云员 和 藻陨云
猿 个持家基因在落叶松不同器官尧大部分个体发育
时期渊体细胞胚胎原胚团时期到胚胎成熟时期尧种子
萌发过程尧植株幼年生长阶段到成年生长阶段冤表达
稳定袁适合作为 择孕悦砸 的内参基因使用遥 其中院粤孕皂
在不同器官中尧体细胞胚胎发育和种子萌发过程中
表达均最为稳定曰耘云员 在不同生长年龄植株主干的
顶端茎中表达最为稳定曰藻陨云在不同年龄植株的针叶
中表达最为稳定遥 进行基因表达细微差异研究时袁
可根据需要使用 圆 个或 圆 个以上内参组合遥
同类型甚至同一个持家基因在不同植物和不同
样品间的稳定性存在显著差异咱员猿暂 遥 对 苑 个传统持
家基因 渊 郧粤孕阅匀尧 耘云员琢尧 栽月孕尧 砸孕蕴愿尧 粤孕栽尧 阅晕粤允尧
栽哉粤冤和 源 个新的候选内参基因渊栽陨孕源员尧杂粤晕阅尧悦粤悦
和 杂郧晕鄄哉猿源远怨园愿冤在番茄渊蕴赠糟燥责藻则泽蚤糟燥灶 藻泽糟怎造藻灶贼怎皂冤圆苑
个不同发育时期的组织器官中的表达稳定性进行比
较袁发现新的候选内参基因的稳定性优于传统内参
基因袁其中 悦粤悦和 栽陨孕源员 最为稳定袁而 耘云员琢和 栽哉粤
的稳定性最差咱员源暂 遥 葡萄渊灾蚤贼蚤泽 增蚤灶蚤枣藻则葬冤浆果 员愿 个不
远
专刊 吴摇 涛等院落叶松实时定量 孕悦砸内参基因的筛选
图 猿摇 早藻晕燥则皂与 晕燥则皂云蚤灶凿藻则的稳定性排名比较
同发育时期的样品中袁郧粤孕阅匀尧粤悦栽尧耘云员琢 和 杂粤晕阅
在 员源 个候选内参基因渊粤孕源苑尧悦再孕尧耘云员琢尧郧粤孕阅匀尧
酝阅匀尧 孕孕圆粤尧 杂粤晕阅尧 栽陨孕源员尧 栽哉粤尧 栽哉月尧 哉月悦尧 哉月匝鄄
蕴源园尧哉月匝员园冤中最为稳定咱员缘暂 遥 哉月匝苑 和 郧遭责燥造赠怎遭蚤择鄄
怎蚤贼蚤灶鄄员 在棉花渊郧燥泽泽赠责蚤怎皂 澡蚤则泽怎贼怎皂冤纤维发育过程中
稳定性较好袁而 粤悦栽圆 和 郧遭责燥造赠怎遭蚤择怎蚤贼蚤灶鄄圆 稳定性最
差咱员远暂 遥 郧粤孕阅匀 和 粤悦栽茁 在茶树渊悦葬皂藻造造蚤葬 泽蚤灶藻灶泽蚤泽冤
第 员 片至第 源 片叶片的 源 个候选内参基因中渊员愿杂
则砸晕粤尧郧粤孕阅匀尧茁鄄葬糟贼蚤灶 和 琢鄄贼怎遭怎造蚤灶冤最为稳定咱员苑暂 遥
在大豆渊郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾冤不同发育时期样品中袁耘蕴云员月
和 悦再孕圆 稳定性最好袁郧远孕阅 和 哉月匝员园 稳定性最
差咱员愿暂 遥 本研究中袁在落叶松不同器官或发育的不同
阶段袁粤孕皂尧耘云员 和 藻陨云较稳定袁而 哉月匝和 粤悦栽源 稳定
性较差遥 粤悦栽源 在 员圆 个持家基因中表达最不稳定袁
不适宜作为落叶松个体发育或不同组织 辕器官基因
比较研究的内参曰而 悦澡糟 在种子萌发不同阶段的样
品中较为稳定袁在不同器官和体胚增殖与成熟不同
阶段表达最不稳定袁在不同生长阶段的茎及叶中稳
定性居中遥 表明持家基因用作内参基因时袁物种间
甚至是同一物种不同器官或不同发育阶段并无绝对
的通用性袁需要根据实验目的加以评价从而选出适
宜的内参基因遥
落叶松是我国北方重要的针叶速生用材造林树
种袁目前袁正在深入开展其杂种优势咱员怨暂 尧速生机
制咱圆园暂及 皂蚤砸晕粤功能咱圆员暂等分子机理研究遥 择孕悦砸 技
术具有重复性好尧灵敏度高尧准确快速等优点袁已成
为分子生物学研究中分析基因表达的重要工
具咱员 原 远暂 遥 利用 择孕悦砸技术开展落叶松基因的表达水
平分析已有报道袁如 蕴蚤等咱圆圆暂关于落叶松体细胞胚胎
成熟过程中 蕴葬 酝再月猿猿 的表达水平受 皂蚤砸员缘怨 调控
的研究遥 但目前有关落叶松内参基因选择的研究国
内外鲜见报道遥 通过本研究袁明确了 员圆 个持家基因
在落叶松生长发育阶段中的表达稳定性袁为使用
择孕悦砸技术分析落叶松基因表达提供了适宜内参基
因袁给深入开展落叶松体细胞胚胎发生和生长发育
相关的分子生物学研究奠定方法学基础遥
参考文献院
咱员暂 酝葬泽糟蚤葬 栽袁 杂葬灶贼燥增蚤贼燥 耘袁 郧葬造造蚤贼藻造造蚤 阅袁 藻贼 葬造援 耘增葬造怎葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻枣藻则藻灶糟藻
早藻灶藻泽 枣燥则 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 则藻增藻则泽藻 原 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 责燥造赠皂藻则葬泽藻 糟澡葬蚤灶 则藻葬糟鄄
贼蚤燥灶 灶燥则皂葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 蚤灶 蚤灶枣藻糟贼藻凿 贼燥皂葬贼燥 责造葬灶贼泽咱 允暂 援 酝燥造 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造援 袁
圆园员园袁 员员院 愿园缘 原 愿员远
咱圆暂 匀藻蚤凿 悦 粤袁 杂贼藻增藻灶泽 允袁 蕴蚤增葬噪 运 允袁 藻贼 葬造援 砸藻葬造 贼蚤皂藻 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 孕悦砸
咱允暂 援 郧藻灶燥皂藻 砸藻泽袁 员怨怨远袁远 渊员园冤院 怨愿远 原 怨怨源
咱猿暂 砸葬凿燥灶蚤糟 粤袁 栽澡怎造噪藻 杂袁 酝葬糟噪葬赠 陨 酝袁 藻贼 葬造援 郧怎蚤凿藻造蚤灶藻 贼燥 则藻枣藻则藻灶糟藻
苑
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆远 卷
早藻灶藻 泽藻造藻糟贼蚤燥灶 枣燥则 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 则藻葬造 原 贼蚤皂藻 孕悦砸咱允暂 援 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 葬灶凿
月蚤燥责澡赠泽蚤糟葬造 砸藻泽藻葬则糟澡 悦燥皂皂怎灶蚤糟葬贼蚤燥灶泽袁 圆园园源袁 猿员猿院 愿缘远 原 愿远圆
咱源暂 胡瑞波袁 范成明袁 傅永福援 植物实时荧光定量 孕悦砸 内参基因的
选择咱允暂 援 中国农业科技导报袁 圆园园怨袁 员员渊远冤院 猿园 原 猿远
咱缘暂 蕴藻藻 允 酝袁 砸燥糟澡藻 允 砸袁 阅燥灶葬早澡赠 阅 允袁 藻贼 葬造援 灾葬造蚤凿葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻枣藻则藻灶糟藻
早藻灶藻泽 枣燥则 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 砸栽鄄孕悦砸 泽贼怎凿蚤藻泽 燥枣 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 责藻则藻灶灶蚤葬造
则赠藻早则葬泽泽 渊蕴燥造蚤怎皂 责藻则藻灶灶藻 蕴援 冤咱允暂 援 月酝悦 酝燥造 月蚤燥造袁 圆园员园袁 员员院 愿
咱远暂 凿藻 韵造蚤增藻蚤则葬 蕴 粤袁 月则藻贼燥灶 酝 悦袁 月葬泽贼燥造造葬 云 酝袁 藻贼 葬造援 砸藻枣藻则藻灶糟藻 早藻灶藻泽
枣燥则 贼澡藻 灶燥则皂葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 耘怎糟葬造赠责贼怎泽 泽责藻糟蚤藻泽咱 允暂 援
孕造葬灶贼 悦藻造造 孕澡赠泽蚤燥造袁 圆园员圆袁 缘猿 渊圆冤院 源园缘 原 源圆圆
咱苑暂 悦扎藻糟澡燥憎泽噪蚤 栽袁杂贼蚤贼贼 酝袁粤澡灶皂灶灶 栽袁藻贼 葬造援 郧藻灶燥皂藻 憎蚤凿藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶
葬灶凿 贼藻泽贼蚤灶早 燥枣 泽怎责藻则蚤燥则 则藻枣藻则藻灶糟藻 早藻灶藻泽 枣燥则 贼则葬灶泽糟则蚤责贼 灶燥则皂葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 蚤灶
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥员袁 圆园园缘袁 员猿怨院 缘 原 员苑
咱愿暂 月则怎灶灶藻则 粤 酝袁 再葬噪燥增造藻增 陨 粤袁 杂贼则葬怎泽泽 杂 匀援 灾葬造蚤凿葬贼蚤灶早 蚤灶贼藻则灶葬造 糟燥灶鄄
贼则燥造泽 枣燥则 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 责造葬灶贼 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 泽贼怎凿蚤藻泽咱 允暂 援 月酝悦 孕造葬灶贼
月蚤燥造燥早赠袁 圆园园源袁 源院 员源
咱怨暂 哉凿增葬则凿蚤 酝 运袁 悦扎藻糟澡燥憎泽噪蚤 栽袁 杂糟澡藻蚤遭造藻 宰 砸援 耘造藻增藻灶 早燥造凿藻灶 则怎造藻泽 燥枣
择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 砸栽鄄孕悦砸咱允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造袁 圆园园愿袁 圆园渊苑冤院 员苑猿远 原 员苑猿苑
咱员园暂 灾葬灶凿藻泽燥皂责藻造藻 允袁 阅藻 孕则藻贼藻则 运袁 孕葬贼贼赠灶 云袁 藻贼 葬造援 粤糟糟怎则葬贼藻 灶燥则皂葬造蚤鄄
扎葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 砸栽鄄孕悦砸 凿葬贼葬 遭赠 早藻燥皂藻贼则蚤糟 葬增藻则葬早蚤灶早
燥枣 皂怎造贼蚤责造藻 蚤灶贼藻则灶葬造 糟燥灶贼则燥造 早藻灶藻泽咱允暂 援 郧藻灶燥皂藻 月蚤燥造袁 圆园园圆袁 猿 渊苑冤院
砸耘杂耘粤砸悦匀园园猿源
咱员员暂 粤灶凿藻则泽藻灶 悦 蕴袁 允藻灶泽藻灶 允 蕴袁 韵则灶贼燥枣贼 栽 云援 晕燥则皂葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻葬造鄄贼蚤皂藻
择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 则藻增藻则泽藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶鄄孕悦砸 凿葬贼葬院 葬 皂燥凿藻造鄄遭葬泽藻凿 增葬则蚤葬灶糟藻
藻泽贼蚤皂葬贼蚤燥灶 葬责责则燥葬糟澡 贼燥 蚤凿藻灶贼蚤枣赠 早藻灶藻泽 泽怎蚤贼藻凿 枣燥则 灶燥则皂葬造蚤扎葬贼蚤燥灶袁 葬责鄄
责造蚤藻凿 贼燥 遭造葬凿凿藻则 葬灶凿 糟燥造燥灶 糟葬灶糟藻则 凿葬贼葬 泽藻贼泽咱允暂 援 悦葬灶糟藻则 砸藻泽袁 圆园园源袁
远源 渊员缘冤院 缘圆源缘 原 缘圆缘园
咱员圆暂 在澡葬灶早 再怎葬灶袁 在澡葬灶早 杂澡燥怎早燥灶早袁 匀葬灶 杂怎赠蚤灶早袁 藻贼 葬造援 栽则葬灶泽糟则蚤责贼燥皂藻
责则燥枣蚤造蚤灶早 葬灶凿 蚤灶 泽蚤造蚤糟燥 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 泽燥皂葬贼蚤糟 藻皂遭则赠燥泽 蚤灶 允葬责葬灶藻泽藻 造葬则糟澡
渊蕴葬则蚤曾 造藻责贼燥造藻责蚤泽冤 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造 砸藻责燥则贼泽袁 圆园员圆袁 猿员 渊怨冤院 员远猿苑
原 员远缘苑
咱员猿暂 袁摇 伟袁 万红建袁 杨悦俭援 植物实时荧光定量 孕悦砸内参基因的
特点及选择咱允暂 援 植物学报袁 圆园员圆袁 源苑渊源冤院 源圆苑 原 源猿远
咱员源暂 耘曾责燥泽蚤贼燥鄄砸燥凿则蚤早怎藻扎 酝袁 月燥则早藻泽 粤 粤袁 月燥则早藻泽鄄孕藻则藻扎 粤袁 藻贼 葬造援 杂藻造藻糟鄄
贼蚤燥灶 燥枣 蚤灶贼藻则灶葬造 糟燥灶贼则燥造 早藻灶藻泽 枣燥则 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 砸栽鄄孕悦砸
泽贼怎凿蚤藻泽 凿怎则蚤灶早 贼燥皂葬贼燥 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 责则燥糟藻泽泽咱 允暂 援 月酝悦 孕造葬灶贼 月蚤燥造袁
圆园园愿袁 愿院 员猿员
咱员缘暂 砸藻蚤凿 运 耘袁 韵造泽泽燥灶 晕袁 杂糟澡造燥泽泽藻则 允袁 藻贼 葬造援 粤灶 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 早则葬责藻增蚤灶藻
砸晕粤 蚤泽燥造葬贼蚤燥灶 责则燥糟藻凿怎则藻 葬灶凿 泽贼葬贼蚤泽贼蚤糟葬造 凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻枣藻则藻灶糟藻
早藻灶藻泽 枣燥则 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 砸栽鄄孕悦砸 凿怎则蚤灶早 遭藻则则赠 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 咱 允暂 援 月酝悦
孕造葬灶贼 月蚤燥造袁 圆园园远袁 远院 圆苑
咱员远暂 涂礼莉袁 张献龙袁 刘迪秋袁 等援 棉花纤维发育和体细胞胚发生
过程中实时定量 孕悦砸 内对照基因的筛选 咱 允暂 援 科学通报袁
圆园园苑袁 缘圆渊圆园冤院 圆猿苑怨 原 圆猿愿缘
咱员苑暂 孙美莲袁 王云生袁 杨冬青袁 等援 茶树实时荧光定量 孕悦砸分析中
内参基因的选择咱允暂 援 植物学报袁 圆园员园袁 源缘 渊缘冤院 缘苑怨 原 缘愿苑
咱员愿暂 允蚤葬灶 月袁 蕴蚤怎 月袁 月蚤 再袁 藻贼 葬造援 灾葬造蚤凿葬贼蚤燥灶 燥枣 蚤灶贼藻则灶葬造 糟燥灶贼则燥造 枣燥则 早藻灶藻
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 泽贼怎凿赠 蚤灶 泽燥赠遭藻葬灶 遭赠 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 咱 允暂 援
月酝悦 酝燥造 月蚤燥造袁 圆园园愿袁 怨院 缘怨
咱员怨暂 李摇 爱袁 刘摇 超袁 韩春乐袁 等援 落叶松优势杂交子代与亲本间
基因组 阅晕粤甲基化变异研究咱 允暂 援 南开大学学报院自然科学
版袁 圆园员圆袁 源缘渊缘冤院 远远 原 苑员
咱圆园暂 在澡葬灶早 杂澡燥怎早燥灶早袁 匀葬灶 杂怎赠蚤灶早袁 蕴蚤 宰葬灶枣藻灶早袁 藻贼 葬造援 皂蚤砸晕粤 则藻早怎造葬鄄
贼蚤燥灶 蚤灶 枣葬泽贼 葬灶凿 泽造燥憎鄄早则燥憎蚤灶早 澡赠遭则蚤凿 蕴葬则蚤曾 贼则藻藻泽咱 允暂 援 栽则藻藻泽袁 圆园员圆袁
圆远渊缘冤院 员缘怨苑 原 员远园源
咱圆员暂 在澡葬灶早 允怎灶澡燥灶早袁 在澡葬灶早 杂澡燥怎早燥灶早袁 匀葬灶 杂怎赠蚤灶早袁 藻贼 葬造援 郧藻灶燥皂藻鄄
憎蚤凿藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 皂蚤糟则燥砸晕粤泽 蚤灶 允葬责葬灶藻泽藻 造葬则糟澡 葬灶凿 泽贼葬早藻鄄泽责藻鄄
糟蚤枣蚤糟 皂燥凿怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 藻造藻增藻灶 糟燥灶泽藻则增藻凿 皂蚤糟则燥砸晕粤泽 葬灶凿 贼澡藻蚤则 贼葬则早藻贼泽
凿怎则蚤灶早 泽燥皂葬贼蚤糟 藻皂遭则赠燥早藻灶藻泽蚤泽 咱 允 暂 援 孕造葬灶贼葬袁 圆园员圆袁 圆猿远 渊 圆 冤院
远源苑鄄远缘苑
咱圆圆暂 蕴蚤 宰葬灶枣藻灶早袁 在澡葬灶早 杂澡燥怎早燥灶早袁 匀葬灶 杂怎赠蚤灶早袁 藻贼 葬造援 砸藻早怎造葬贼蚤燥灶 燥枣
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葬灶凿 泽燥皂葬贼蚤糟 藻皂遭则赠燥 皂葬贼怎则葬贼蚤燥灶 蚤灶 蕴葬则蚤曾 噪葬藻皂责枣藻则蚤 渊蕴葬皂遭援 冤 悦葬则则援
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