全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 2) : 302～ 307
Forest Research
᭛ゴ㓪ো : 1001-1498( 2010) 02-0302-06
⊍㤊 SRAP-PCRডᑨԧ㋏ⱘӬ࣪
ᄂ᛽᛽1, 2 , ॿ ଻2 , ฆࢗ॥2 , ྍ໌ܟ2 , ཷഃ଼1 *
( 1. 西南大学资源环境学院 , 重庆 400716 ; 2 . 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳 311400)
݇䬂䆡 : 油茶 ; SRAP;正交设计;体系优化
Ё೒ߚ㉏ো : S794.4 ᭛⤂ᷛ䆚ⷕ : A
收稿日期 : 2009-09-27
基金项目 : “十一五”国家科技支撑专题“高产优质油茶香榧新品种选育”( 2006BAD01A1706) ; 中国林科院公益性科研基金专项“高油
高抗油茶杂交新种质创制”( CAFYBB2008005) ; 中国林科院亚林所公益性科研基金专项“油茶品种分子鉴别系统构建及油茶基因芯片开发”
( RISF6804)
作者简介 : 郑婷婷 ( 1984— ) , 女 , 黑龙江佳木斯人 ,硕士研究生 , 主要从事林木遗传育种研究 .
* 通讯作者 .
Optimization of SRAP-PCR System for Camellia oleifera
ZHENGTing-ting1, 2, LIN Ping2 , WANGKai-liang2, YAO Xiao-hua2 , YANG Shui-ping1
( 1. College of Resources and Environment of Southwest China University, Chongqing 400716, China;
2. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, Zhejiang, China)
Abstract: Camellia oleifera is one of the important oil tree species in south China, and C. oleifera industry is
quickly developed with the support of the national policies in recent years. The disorder of C. oleifera varieties is
one of the key issues restricting the development of C. oleifera industry. Because of high polymorphism, good
repeatability, less use of DNA and so on, SRAP as a new marker was used in identification of cultivars, analysis of
genetic resources and genetic diversity in recent years. In this paper, the orthogonal design was used to optimize
SRAP-PCR system for C. oleifera by 5 factors ( Mg2 + , dNTPs, primer, Taq polymerase, DNA template) and 4
levels, respectively. The data were analyzed by software SPSS V13. 0. A suitable SRAP-PCR system ( 20 μL) was
established as: 75 ng DNA template, 1. 5 mmol·L - 1 Mg2 + , 0. 15 mmol·L - 1 dNTPs, 1U Taq DNA polymerase,
0. 4 μmol·L - 1 primer, 1 ×PCR buffer. The result of optimal SRAP-PCR system will provide a foundation for the
identification of C. oleifera cultivars.
Key words:Camellia oleifera; SRAP; orthogonal design; system optimization
油茶( Camellia oleifera Abel. ) 是我国南方特有
的木本食用油料树种 [ 1] ,具有栽培历史悠久、分布区
域广、栽培面积大、用途多等特点 [ 2] 。茶油不饱和脂
肪酸含量高,为各种食用油之冠,长期食用能益寿延
年;茶枯和茶壳是提取茶皂素、制刨光粉和提取糠醛
的工业原材料;油茶适应性广,能耐干旱瘠薄, 保持
水土、涵养水源能力强。因此,油茶具有良好的经济
效益、生态效益和社会效益。
作为我国南方的主要木本油料树种,从 20 世纪
60 年代开始, 全国广泛开展了油茶良种选育工作,
并取得了重大突破, 先后育出了以优良农家品种为
主的一代良种和高产稳产的无性系二代良种。但由
于传统的形态鉴别方法很难区分各品种,高产油茶
的推广栽培遇到了很大阻碍,造成目前市场上苗木
良莠不齐、鱼龙混杂的现状。随着分子标记技术的
发展,从 DNA水平区分和鉴别物种的方法被越来越
多地得到应用, 目前国内已有学者开展了油茶的
RAPD
[ 3 - 5] 和 ISSR[ 6 - 7 ] 分子鉴别研究。然而, RAPD
第 2 期 郑婷婷等:油茶 SRAP-PCR反应体系的优化
存在反应不稳定、重复性差等缺点 [ 6 ] ,很难得到广泛
推广应用; ISSR作为一种显性标记 ( 部分共显性) ,
多数情况下不能区别一个位点扩增的 DNA片段,鉴
别亲缘关系较近的无性系比较困难 [ 8] 。
相关序列扩增多态性 ( Sequence-related ampli-
fied polymorphism, SRAP) 标记是基于聚合酶链式反
应( PCR) 的新型分子标记技术 [ 9 ] , 其原理是利用独
特的引物设计对开放读码框( ORFs) 进行扩增,上游
引物长 17 bp,对外显子进行特异扩增,下游引物长
18 bp,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增,因
个体不同及物种的内含子、启动子与间隔长度不等
而产生多态性。SRAP具有简便、中等产量、高共显
性、重复性好、易于分离条带及测序等优点 [ 10] 。该
技术已经在西瓜 ( Citrullus vulgaris Schrad. ) [ 11 ]、番
茄( Lycopersicum esculentum Mill. ) [ 12 ]、石榴 ( Punica
granatum L. )
[ 13 ]、烟草 ( Nicotiana tabacum L. ) [ 14] 、
甘薯( Ipomoea batatas Lam. ) [ 15 ] 等植物的遗传多态
性分析、品种分子鉴定等方面得到了应用,但用于油
茶研究尚未见报道。本研究拟采用正交试验设计的
方法,对 SRAP-PCR 反应体系中模板 DNA、引物、
dNTPs、Mg2 +浓度及 Taq DNA 聚合酶用量等参数进
行试验,对油茶 SRAP反应体系进行优化,旨在建立
和优化油茶 SRAP反应体系, 为油茶分子鉴别提供
技术支持,为利用分子标记技术解决油茶生产上品
种混乱问题提供科学依据。
1 ϫॸူֺ֥
1. 1 䆩偠ᴤ᭭
油茶长林 18 号、23 号、174 号、77 号、81 号、8
号、10 号、44 号、20 号、32 号、27 号无性系幼叶于
2008 年 7 月采自浙江省金华市东方红林场,提取其
DNA作为 SRAP-PCR 反应的模板。Taq DNA 聚合
酶( 5 U·μL - 1 ) 、MgCl2 ( 25 mmol·L
- 1 ) 、dNTPs( 2. 5
mmol·L- 1 ) 、10 ×PCR Buffer( Mg2 + Free) 和 100 bp
DNA Marker均购自 TaKaRa公司, SRAP引物由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成, 浓度为 10
μmol·L - 1 ,引物序列为 Me1: 5′-TGAGTCCAAACCG-
GAAA-3′; Me3: 5′-TGAGTCCAAACCGGAAC-3′; Me4:
5′-TGAGTCCAAACCGGAAG-3′; Em7: 5′-GACTGCG-
TACGAATTTGA-3′; Em8: 5′-GACTGCGTACGAATTT-
GC-3′; Em11: 5′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′;
Em14: 5′-GACTGCGTACGAATTCAG-3’; Em22: 5′-
GACTGCGTACGAATTGAT-3′。
1.2 䆩偠ᮍ⊩
1. 2. 1 ဒЏᆙ DNA ԅඔ௜ DNA 提取采用改良
CTAB法, DNA纯度与浓度经 1%琼脂糖凝胶电泳和
紫外分光光度计检测, 稀释至 30 ng·μL - 1 , - 20℃
保存备用。
1. 2. 2 ࿤๞౑༪ 按照 G. Li等 [ 9 ]的 SRAP引物设
计原则设计引物,由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成。选用 4 个油茶无性系, 参考烟草等
SRAP扩增体系 [ 16 ] , 对 SRAP 引物组合进行多态性
筛选,选择多态性好、条带清晰稳定的引物组合进行
油茶 SRAP反应体系优化研究。
1. 2. 3 SRAP-PCR ֱ࿫࿙ഭഃ଼ԅ௲Շူჾ߬ζ
ԅಁޙ 为了确定 PCR 反应中 5 个因素的最佳水
平,采用正交设计 L16 ( 4
5 ) 在 4 个水平上进行试验。
参与 PCR反应的因素水平见表 1, L16 ( 4
5
) 正交设计
方案见表 2。
㸼 1 PCRডᑨⱘ಴㋴∈ᑇ
因素
水平 ( 体系终浓度 )
1 2 3 4
Taq DNA聚合酶 / ( U·20 μL - 1) 0. 5 1. 0 1. 5 2 . 0
Mg2 + / ( mmol·L - 1 ) 1. 25 1. 50 1. 75 2. 00
模板 DNA /( ng·20 μL - 1) 45 60 75 90
DNTPs / ( mmol·L - 1 ) 0. 10 0. 15 0. 20 0. 25
引物 / ( μmol·L - 1 ) 0. 3 0. 4 0. 5 0 . 6
1. 2. 4 SRAP-PCRࣴ႙ඨߑ 采用油茶 18 号无性
系 DNA模板和 Me3、Em22 引物对对表 2 中的 16 个
处理进行实验, 每处理重复 3 次。扩增反应在 ABI
2720 Thermal CyclerPCR仪上进行;选用 G. Li等 [ 9 ]
的扩增程序,即 94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 1 min,
35 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 5个循环; 94 ℃变
性 1 min, 50 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 35 个循
环;最后 72 ℃延伸 10 min, 4 ℃保存。
1. 2. 5 ࣴ႙С๞ԅ޿Љ PCR 产物用 6% 变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳, Na2CO3 银染法染色显影,阴凉
通风处干燥 3 ～ 4 h, 扫描仪采集图像,观察分析条
带,参照何正文等 [ 1 7] 的方法, 根据扩增条带的敏感
性与特异性对结果进行评分,并将评分结果输入统
计软件 SPSS V13. 0 中进行分析,得到油茶的 SRAP-
PCR反应 5 个因素的最佳水平及组合。
1. 2. 6 SRAP-PCR ֱ࿫඘ຂԅ௲ो 以上述确定
的条 件, 用 Me1 / Em8、Me1 / Em11、Me3 / Em14 和
Me4 / Em7 引物组合对随机选取的 10 个油茶无性系
的 DNA模板分别进行扩增,对优化过的油茶 SRAP
反应体系的稳定性进行检测。
303
林 业 科 学 研 究 第 23卷
㸼 2 PCR ডᑨⱘ಴㋴∈ᑇ L16( 4
5) ℷѸ䆒䅵
编号
Taq DNA 聚合酶 /
( U·20 μL - 1)
Mg2 + /
( mmol·L - 1)
模板 DNA /
( ng·20 μL - 1)
dNTPs /
( mmol·L - 1)
引物 /
( μmol·L - 1 )
1 0. 5 1. 25 45 0. 10 0. 3
2 0. 5 1. 50 60 0. 15 0. 4
3 0. 5 1. 75 75 0. 20 0. 5
4 0. 5 2. 00 90 0. 25 0. 6
5 1. 0 1. 25 60 0. 20 0. 6
6 1. 0 1. 50 45 0. 25 0. 5
7 1. 0 1. 75 90 0. 10 0. 4
8 1. 0 2. 00 75 0. 15 0. 3
9 1. 5 1. 25 75 0. 25 0. 4
10 1. 5 1. 50 90 0. 20 0. 3
11 1. 5 1. 75 45 0. 15 0. 6
12 1. 5 2. 00 60 0. 10 0. 5
13 2. 0 1. 25 90 0. 15 0. 5
14 2. 0 1. 50 75 0. 10 0. 6
15 2. 0 1. 75 60 0. 25 0. 3
16 2. 0 2. 00 45 0. 20 0. 4
2 ࠒڴူד๥
2. 1 ℷѸ䆒䅵䆩偠⬉⋇㒧ᵰ䆘ߚ
按表 2 设计的 16 个处理进行 PCR扩增后,产物
用 6%的聚丙烯酰胺凝胶进行检测。
根据图 1 电泳结果,参照何正文等 [ 17 ] 的方法,
按照条带数量丰富度、扩增条带的敏感性与特异性
即条带的强弱和杂带的多少、背景深浅的原则,依次
给 16 个处理打分,最佳产物记为 16 分,最差的记为
1 分,分数越高,表示敏感性、特异性越好。3 次重复
分别独立统计,从 3 次重复的结果来看,各个处理的
重复性较好。依处理次序得到的 3 次分数分别记
为: 5, 11, 12, 16, 8, 13, 15, 9, 14, 10, 7, 4, 6, 3, 2, 1;
5, 10, 12, 13, 9, 14, 15, 8, 16, 11, 6, 4, 7, 1, 3, 2; 6, 11,
12, 13, 9, 14, 15, 10, 16, 8, 7, 4, 5, 3, 2, 1。
M: 标准分子量 ; 1 ～ 16: 处理编号
图 1 正交设计 SRAP-PCR 产物电泳结果
2.2 ৘಴㋴ᇍ PCRডᑨᕅડⱘᏂᓖߚᵤ
用统计软件 SPSS V13. 0 对上述处理和评分结
果进行方差分析, 结果见表 3。由 F 值可知, Taq
DNA聚合酶量对反应结果的影响最大, Mg2 +浓度的
影响最小,各因素水平的变化对 PCR反应的影响从
大到小依次为: Taq DNA聚合酶、模板 DNA、dNTPs、
引物、Mg2 +。由于各因素水平间的差异均达到显著
水平,可以进一步进行因素内多重比较分析。
㸼 3 PCR ডᑨ৘಴㋴䯈ᮍᏂߚᵤ
变异来源 自由度 方差 均方 F值
Taq DNA聚合酶 3 527. 167 175 . 722 227. 964 * *
Mg2 + 3 32. 500 10 . 833 14. 054 * *
模板 DNA 3 190. 500 63 . 500 82. 378 * *
dNTPs 3 142. 833 47 . 611 61. 766 * *
引物 3 102. 333 34 . 111 44. 252 * *
误差 32 24. 667 0 . 771
( 总计 ) 48 4 488. 000
注 : * * 表示 0. 01 水平差异显著。
2.3 ಴㋴ݙⱘ৘∈ᑇᇍ PCR㒧ᵰⱘᕅડ
2. 3. 1 Taq DNAࡪۦਝૉէճ PCRࠒڴԅ࿵ູ
Taq DNA聚合酶的各浓度水平组合间的差异均达到
极显著水平 ( 图 2) , Taq DNA聚合酶浓度对 PCR结
果的影响较大。Taq DNA 聚合酶浓度过低, PCR产
物信号弱,背景浅,浓度过高, 扩增反应的特异性降
低,有杂带且背景深, 不利于观察分析。从图 2 可
知, Taq DNA聚合酶量为 1. 0 U·20 μL - 1时扩增效
果最好,选择 1. 0 U·20 μL - 1水平为 Taq DNA聚合
酶的最佳反应水平。
2. 3. 2 Mg
2 +ૉէճ PCRࠒڴԅ࿵ູ Mg2 +浓度在
403
第 2 期 郑婷婷等:油茶 SRAP-PCR反应体系的优化
1. 25 mmol·L - 1与 1. 50 mmol·L - 1、1. 25 mmol·
L- 1与 1. 75 mmol·L - 1、1. 50 mmol· L - 1 与 1. 75
mmol·L- 1水平间差异不显著, 其余水平组合间差
异极显著。在 1. 25～ 2. 00 mmol·L - 1范围内,随着
Mg
2 +浓度的增加, PCR 结果均值先升后降 ( 图 3) 。
Mg
2 +主要是通过改变聚合酶的活性对 PCR 反应结
果产生影响, Mg2 +浓度过高,反应特异性降低, 浓度
过低降低 Taq酶的活性, PCR反应产物减少。本试
验选择峰值 1. 5 mmol·L - 1为 Mg2 +最佳浓度水平。
图 2 Taq DNA聚合酶量与 PCR结果均值的关系 图 3 Mg2 +浓度与 PCR结果均值的关系
2. 3. 3 ੦͐ DNA ૉէճ PCR ࠒڴԅ࿵ູ 模板
DNA浓度在 45 ～ 90 ng·20 μL - 1范围,随着浓度的
增加, PCR结果均值先降低后升高 ( 图 4) , 45 ng·
20 μL - 1与 60 ng·20μL - 1水平间差异不显著,其余
水平间差异极显著。已有其它研究表明 [ 18 - 19 ] ,模板
DNA的合适浓度范围较宽, 浓度在 45 ～ 90 ng·
20μL - 1范围内均可,结合实验分析结果综合考虑,
本试验选择 75 ng·20μL - 1为模板最佳浓度水平。
2. 3. 4 dNTPs ૉէճ PCR ࠒڴԅ࿵ູ dNTPs作
为 PCR反应的原料,其浓度直接影响 PCR扩增产物
的生成,浓度过低时会使扩增反应不完全;浓度过高
时会对 Mg2 +产生拮抗作用,主要原因是 dNTPs分子
中的磷酸基团能定量地与 Mg2 +结合,使实际反应中
Mg
2 +的浓度下降而影响聚合酶的活力; 而且 dNTPs
过多也导致不必要的浪费,同时错配率也明显增加。
dNTPs浓度在 0. 10 ～ 0. 25 mmol·L - 1范围内, PCR
结果均值呈现上升趋势, 0. 15 mmol·L - 1与 0. 20
mmol·L - 1水平间差异不显著,其余水平间差异极
显著。从经济的角度考虑,选择 dNTPs最佳浓度水
平为 0. 15 mmol·L - 1 (图 5)。
图 4 模板 DNA浓度与 PCR 结果均值的关系 图 5 dNTPs浓度与 PCR 结果均值的关系
2. 3. 5 ࿤๞ૉէճ PCRࠒڴԅ࿵ູ 在 PCR反应
中,引物浓度过低,与模板 DNA的结合率低, PCR产
物量少,浓度过高增加非特异性结合的机率,容易形
成引物二聚体, 并且会与 Taq DNA 聚合酶竞争
Mg2 +。本试验引物浓度各水平间差异均达到极显
著水平,浓度为 0. 4 μmol·L - 1时的效果最好,定为
引物的最佳浓度水平(图 6)。
2. 3. 6 SRAP-PCRֱ࿫඘ຂԅ௲ो 以优化的体
系, 用 Me1 /Em8、Me1 /Em11、Me3 / Em14 和 Me4 / 图 6 引物浓度与 PCR结果均值的关系
503
林 业 科 学 研 究 第 23卷
Em7 引物组合分别对随机选取的油茶无性系进行扩
增(图 7) ,电泳检测扩增谱带清晰、多态性强、稳定
性较好,该体系适合油茶 SRAP-PCR反应。
图 7 4 个引物组合在部分油茶无性系上的扩增
3 ඉৢ
作为一种新型分子标记技术, SRAP技术扩增
谱带比 RAPD标记稳定,但同样受反应条件及物种
不同的影响。本研究采用正交设计对油茶 SRAP-
PCR反应体系进行优化,结合统计软件分析,比单因
素试验简便快捷,结果更加科学可靠。
试验研究表明,采用不同的反应体系对油茶的
SRAP-PCR扩增结果影响较大。Taq DNA 聚合酶是
影响试验结果的一个重要因素, Taq DNA聚合酶量
过高, 易产生非特异性扩增, 而且造成浪费; Taq
DNA聚合酶量过低,会降低扩增产物的合成率, Taq
DNA聚合酶量为 1. 0 U·20μL - 1时扩增效果最好。
Mg
2 +通过影响 Taq DNA聚合酶间接影响 PCR扩增,
Mg2 +浓度过高抑制 Taq DNA聚合酶的活性,过低导
致 Taq DNA聚合酶的活性降低,反应产物减少, 1. 5
mmol·L - 1为 Mg2 +最佳浓度水平。模板 DNA 浓度
适应范围较宽, 本试验选择 75 ng·20μL- 1为模板
DNA最佳浓度水平。dNTPs 直接影响 PCR 扩增产
物的生成,浓度过低使扩增反应不完全;浓度过高使
反应中 Mg2 +的浓度下降而影响聚合酶的活力,不仅
浪费,错配率也明显增加, 0. 15 mmol·L - 1为 dNTPs
最佳浓度水平。引物浓度也要适量,过低降低产物
量,过高容易产生非特异性结合和引物二聚体,且与
Taq DNA 聚合酶竞争 Mg2 + , 0. 4 μmol·L - 1为最适
引物浓度。本研究建立的最佳反应体系,用于其他
引物组合和其他油茶品种上扩增结果稳定。通过正
交设计建立的油茶 SRAP-PCR最佳反应体系,可用
于油茶 SRAP 分子鉴别体系的构建及油茶品种鉴
别,进行油茶遗传多样性分析等研究,在生产上加快
油茶优良品种的推广应用,更好地促进油茶产业的
发展。
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