全 文 ：林业科学研究　2005 ,18 (1) :1～09
Forest Research
　　文章编号 :100121498 (2005) 0120001209
枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的
组织培养保藏和嫁接传染研究
田国忠1 , 温秀军2 , 李　永1 , 孙朝晖2 , 赵玉芬2 , 郭晓军2 ,
黄钦才1 , 李志清3 , 赵俊芳3
(11 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 ,北京　100091 ; 21 河北省林业科学院森林保护研究所 ,河北 石家庄　050051 ;
31 河南省濮阳市林业科学研究所 ,河南 濮阳　457000)
摘要 :分别从河北唐县赞皇大枣、辽宁凌源梨枣和河南濮阳扁核酸 3 个品种的枣疯病和来自山东、江西和北京的不同
无性系的泡桐丛枝病树上采集丛枝枝条作为组织培养材料 ,获得的枣疯病和泡桐丛枝病组培苗皆表现典型的丛枝症
状。其中感染植原体的赞皇大枣组培苗 (Ft)和扁核酸组培苗 (HPD)在未加任何激素的 MS培养基和其它培养基交替继
代培养 1 a 以上仍能维持丛枝苗生长 ;而发病梨枣 (LD)除产生丛枝外 ,还出现叶片黄化和植株矮化、枯梢等衰退症状。
泡桐丛枝病植原体可在不同无性系组培苗上通过各种培养基交替和单纯的MS培养基继代培养 ,并已在实验室内连续
保藏达 10 a ,其引致丛枝症状的能力无明显的改变。用枣树 Ft 染病材料作接穗 ,以健康冬枣 (DJ)和抗病婆枣 (W14)砧
木进行组培苗间嫁接传病试验 ,可使部分 DJ 和 W14 发病 ;而嫁接未发病的砧木多数像健苗一样正常生长。用感染山
东泡桐丛枝病植原体 ZD 株系丛枝组培苗为接穗 ,嫁接健康泡桐无性系组培苗致使无性系 MB33、TY2T和 C125 发病。
用植原体 16SrDNA 通用引物进行 PCR ,确证了泡桐和枣树发病苗和嫁接发病组培苗体内存在植原体。用 DAPI 荧光显
微镜技术比较组培苗韧皮部筛管中的植原体浓度 ,结果显示 ,Ft 和嫁接发病冬枣 (DJ2Ft)筛管中植原体浓度相对较高 ,
但仍低于各泡桐无性系染病丛枝组培苗 ;HPD 和LD 浓度中等 ,而发病的 W14 砧木含有植原体的筛管数量较少、且浓
度很低。在嫁接不成功或未发病的 DJ 和 W14 砧木组织及健康对照组织中皆检测不到植原体荧光。
关键词 :枣疯病植原体 ;泡桐丛枝病 ;组织培养 ;嫁接传病
中图分类号 :S763 　　　　　文献标识码 :A
收稿日期 : 2003206223
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (300706221) 、国家“十五”科技攻关项目 (2001BA509B1202) 和河北省林业厅项目 (2000185) ,并得到中
央级科研院所科技基础性工作专项 (2001DEA10004)资金支持
作者简介 : 田国忠 (1963 —) ,男 ,山东莒县人 ,研究员 ,博士.
Propagation and Long2Term Preservation of Several Isolates of Jujube
Witches’Broom and Paulownia Witches’Broom2Phytoplasmas in in vitro
Cultured Plantlets and Grafting Transmission of the Pathogens
from the Diseased to Healthy Plantlets
TIAN Guo2zhong1 , WEN Xiu2jun2 , LI Yong1 , SUN Zhao2hui2 , ZHAO Yu2fen2 , GUO Xiao2jun2 ,
HUANG Qin2cai1 , LI Zhi2qing3 , ZHAO Jun2f ang3
(11Research Institute of Forest Ecology ,Environment and Protection ,CAF ,Beijing 　100091 ,China ;
21Institute of Forest Protection ,Hebei Academy of Forestry ,Shijiazhuang 　050061 ,Hebei ,China ;
31Puyang Institute of Forestry ,Henan Province ,Puyang 　457000 ,Henan ,China)
Abstract :The diseased shoots of three jujube ( Ziziphus zizyphus) cultivars ,Pozao from Tang County ,Hebei Province ,Lizao from
Lingyuan County ,Liaoning Province and Bianhesuanzao from Puyang ,Henan Province ,respectively infected with different isolates
of jujube witches’broom (JWB)2phytoplasmas as well as paulownia ( Paulownia spp . ) witches’broom( PWB)2phytoplasma from
Shandong ,Jiangxi Provinces and Beijing were collected and cultured in vitro on various media. The in vitro cultured and infected
plantlets displayed typical witches’broom symptoms ,except for the hypertrophy and whiting of axillary and top buds often associ2
ated with some paulownia plantlets with PWB2phytoplasma. Plantlets with JWB2phytoplasma Pozao (jujube) isolate (Ft) and Bian2
hesuanzao (jujube) isolate ( HPD) were subcultured on MS medium without addition of any hormone and grew well all along with
witches’broom symptom for more than one year ,while the Lizao (jujube) isolate (LD) showed obvious decline symptoms such as
leaf yellows ,dwarf and dieback besides ordinary witches’broom. PWB2phytoplasma isolates had been maintained in the laboratory
in variety of paulownia tissue2cultured plantlets for over 10 years and no pathogenic mutation associated with these phytoplasma
isolates was detected. When Ft scions with JWB2phytoplsams were grafted on the healthy jujube stocks ,certain percentages of
stocks of Dongzao (jujube) (DJ) and Pozao ( W14) cultivars became infected and appeared typical witches’broom symptoms ,
while there was no typical symptom on unsuccessful2grafting stocks. The ZD scion with PWB2phytoplasma C852028D isolate was
also used to graft2transmit the phytoplasma into three paulownia clones , C125 , TY2T and MB33 , consequently causing typical
witches’broom symptoms. The existence of both JWB2 and PWB2phytoplasmas in diseased plantlets and graft2transmitted stocks
was certified by polymerase chain reaction (PCR) using phytoplasmal 16SrDNA universe primer pairs ,R16mF2/ R2. The relative
concentrations of both phytoplasmas in the phloems of JWB and PWB plantlets were also evaluated by DAPI staining fluorescence
microscopy. The results showed that Ft and graft2infected DJ had relative more strong JWB2phytoplasma fluorescence emitted from
the phloem than that of HPD and LD , but still rather lower than that of paulownia plantlets infected with PWB2phytoplasma ;
whereas less phytoplasmas and less number of phloem with JWB2phytoplasmas were detected in W14 stock already with witches’
broom symptom which coincided with its relatively high resistance to JWB2phytoplasma. There were no phytoplasma fluorescence
observed in the healthy plantlet as well as the stock grafted unsuccessfully.
Key words :jujube witches’broom (JWB)2phytoplasma ;paulownia witches’broom( PWB)2phytoplasma ; in vitro culture ;grafting
transmission
由于枣疯病和泡桐丛枝病植原体都不能离体人
工培养 ,给这类病害研究带来了许多困难。比如毒
源的采集和保藏、病菌的纯化、病理学研究、抗病性
鉴定等即受到季节、采样地点、环境条件等的限制。
本实验室曾通过组织培养方法成功地用泡桐组织培
养苗繁殖和保藏了几个泡桐 ( Paulownia spp1) 丛枝
病植原体株系 ,并以此为基础开展了一系列基础和
应用研究[1～4 ] 。在枣树 ( Ziziphus zizyphus (L. ) Meik2
le)的组培和脱毒研究方面也有一些研究报道[5～9 ] 。
但对枣树组培苗体内的植原体的浓度变化则缺乏研
究 ;而且 ,在相同培养条件下 ,对枣树与泡桐染病组
培苗症状的变化、病菌浓度差异比较、枣树病与健株
组培苗间的嫁接试验研究及长期保藏方法等方面 ,
皆未见相关研究报道。
本研究收集了我国不同地区的染病泡桐和枣树
材料 ,通过组织培养方法获得了不同植原体株系 ,并
进一步采用微芽嫁接方式将病原物传染至多个无性
系 (品种)健康组培苗上 ,并探讨了染病枣树和泡桐之
间在症状、病原物繁殖等方面的异同 ,为植原体病害
研究 ,特别是病菌遗传多样性和致病性变异分析、抗
病性鉴定和治疗药剂筛选等研究奠定良好的基础。
1 　材料与方法
111 　试验材料
携带泡桐丛枝病植原体的发病泡桐材料的组织
培养始于 1990 年 8 月份[1] 。毒源分别来自于山东兖
州 (C443D、C852028D、C83244D、C852034D、Q4D) 、北京
(GDR) ,江西分宜 (FYD) [3] 。所获得的染病组培苗一
直通过茎段继代培养在实验室内长期保存。所用的
健康组培苗材料 ,多数为经过了温度处理和茎尖培养
获得的脱毒苗 ,包括从上述染病苗经脱毒获得的无性
系 C852028(简称 T852028) ,直接取自田间的外植体后
经脱毒处理无性系为C125(兰考泡桐 P. elongate S. Y.
Hu) 、TY2T(覃优 2 号)和MB33(毛白 33) 。
感染枣疯病植原体、并表现典型丛枝症状的枣
树病枝鲜材料分别采自不同地区的不同品种上。
2001 年 6 月份采自河北唐县的毒源 ,引起婆枣丛枝
症状 ,编号为 Ft。2002 年 7 月份采自辽宁凌源四官
营子镇的毒源 ,在梨枣品种表现典型丛枝症状 ,编号
为LD ;2002 年 9 月份采自河南濮阳市郊的毒源 ,引
起当地扁核酸品种发病 ,编号为 HPD ;健康枣树品种
组培苗包括抗病材料 W14 ,冬枣 DJ 由河南泌阳市农
2 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18 卷
科所提供。
112 　植原体2植物共生体组织培养及长期保藏方法
从田间采集的病枝 (去掉叶片) ,截成 2～3 cm 具
节茎段 ,然后用自来水流冲洗 1～2 h ,用 70 %酒精处
理 1 min ,然后放在 011 %升汞溶液中消毒 15～20 min ,
用灭菌水洗涤后 ,接种于固体培养基上 ,并于 25 ℃光
照培养箱中培养。15 d 至 1 个月间隔转接至新培养
基上。获得的无菌存活外植体侧芽萌条生长至 2 cm
以上后 ,截取新抽出的具芽抽条转入新的培养基中继
代培养。并在 1～2 个月间隔内继代培养 1 次。
用于培养枣树和泡桐病与健康组培苗的培养基
主要包括 :普通 MS ,A (MS + 62BA 214 mg·L - 1 + NAA
012 mg·L - 1) 、B (MS + IBA 011 mg·L - 1 + NAA 011 mg·
L - 1) ,、ZF(MS + 62BA 210 mg·L - 1 + IBA 015 mg·L - 1 +
蔗糖 30 g·L - 1) 、JA (MS + 62BA 510 mg·L - 1 + IBA 011
mg·L - 1 + NAA 011 mg·L - 1 + KT 215 mg·L - 1) 、Hy(1/ 2
MS + IBA 0102 mg·L - 1 + NAA 0102 mg·L - 1) 、Ly(MS +
62BA 012 mg·L - 1 + NAA 0101 mg·L - 1)等。
在培养方式上 ,采用棉塞、耐高温的塑料膜、用
石蜡将含有染病组培苗的三角瓶完全封口等方式 ,
然后 ,在正常的光照培养条件下培养。
用含 MS 培养基的试管斜面插入组培苗枝条 ,
然后放入 5～8 ℃的冰箱内暗保藏 ,并于 30 d 间隔从
冰箱中取出 ,于正常组培条件下光照培养 1～2 d ,然
后放回冰箱内继续低温保藏。
113 　微芽嫁接传病试验
将染病接穗基部用灭菌的解剖刀削成楔状 ,在
砧木主茎中部叶柄与主茎交接的主茎偏上部位向下
斜切一口 ,然后将适宜粗细和大小、感染植原体的接
穗插在切口上 (接口不需绑缚) ,将接种体小心移入
含有新制备的培养基的广口培养瓶中 ,于正常光照
条件下培养。所有嫁接操作皆在超净工作台上完
成 ,嫁接所用工具都要经过高温灭菌处理[3 ] 。
114 　DAPI荧光显微镜观察
分别取田间发病的病枝、组培苗及嫁接传病苗
茎段进行徒手横切和纵切片。5 %戊二醛固定切片 ,
DAPI(4′,26 二脒基的22 苯基吲哚盐酸) 染色 ,后用
Olympus 落射荧光显微镜检查韧皮部植原体特异性
荧光 ,紫外线激发滤光片波长为的 365 nm ,阻断滤光
片波长为 420 nm[11 ] 。
115 　直接和巢式 PCR
取待测枣树或泡桐组培苗新鲜组织约 013 g ,抽
提植物总 DNA ,以植原体 16S rRNA 基因保守序列设
计引物对 R16mF2/ R2 和 R16F2/ R2 ,进行直接多聚
酶链式反应 ( PCR) 和巢式 PCR (nested2PCR) ,扩增产
物用 1 %琼脂糖凝胶电泳 ,然后于紫外灯下检查 115
kb 或 112 kb 的特异扩增片段的有无[3 ] 。
2 　结果与分析
211 　染病枣树和泡桐外植体在组培条件下的症状
表达和病菌浓度比较
21111 　感染植原体枣树和泡桐组培苗症状的异同
　在培养过程中 ,经表面消毒的染病枣树外植体在
枝条分支部位开始有新的隐芽萌生。将萌芽分别于
不同的培养基上继代培养 ,结果发现 ,组培苗生长、
分化及丛枝症状表达受培养时间、培养基内激素的
影响较大。在未加激素的 MS 培养基上 , Ft 丛枝症
状典型 ,枝条细弱 ,腋芽伸长明显 ,基部无明显的愈
伤化 ,个别组培苗还出现根芽分化现象。当将外植
体转接到新的 MS 培养基后 ,病苗的早期生长较快 ,
叶片淡绿至深绿 ,1 个月之后生长减慢、部分中下部
叶片开始黄化 ,若一直在此培养基上连续培养 2～3
个月后 ,多数苗会出现部分或全部叶片枯死或脱落
现象 ,直至整株死亡。这种现象的出现似乎多数与
培养基的水分和养分供应短缺无直接联系。在 ZF
培养基上 ,Ft 除表现为枝条丛生、叶片变小、黄化或
褪绿 ,严重时出现顶梢枯死外 ,还在基部形成松散的
愈伤组织 ;在 A 培养基上 ,其茎基部产生较大松软的
白色愈伤组织 ,主茎丛簇生长 ,节间缩短 ;在 B 培养
基上 ,Ft 生长较旺 , 叶色绿 ,腋芽伸长明显 , 并有较
多短粗根分化 ;在 HY 培养上 , Ft 植株生长明显衰
退 ,枯梢或叶尖枯 ,整株叶片黄化、矮缩 (见图 1) 。
在 MS 培养基上 , HPD 也表现出典型的丛枝症
状 ,但病株叶片较 Ft 大 ,叶色淡绿 ,植株矮化程度较
低 ;随着培养时间加长 ,也出现部分苗叶片黄化 ,甚
至枯死现象 ;当将其从 MS 培养基转入 A 培养基后 ,
基部分化出较大愈伤组织块 , 地上部茎叶绿色 , 丛
枝症状明显。
LD 外植体在 A 培养基上初期分化出较多的丛
生芽 ,丛生芽叶片较小 ,叶色淡绿 ,将其转接于 MS
培养基上培养后 ,表现出典型的丛枝症状 ,节间较
短、叶片变小、黄化和或退化、次级腋芽萌生、植株生
长缓慢 ,后期则出现明显梢枯和生长衰退症状。将
其移入A、JA、ZF 等培养基中皆未能逆转病苗衰退的
趋势。
健康的枣树品种冬枣 (DJ ) 、W14 和梨枣 (WL1)
3第 1 期 田国忠等 :枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究
在相应的培养基上的形态与染病组培苗有明显差
异 ,表现为主茎明显比病苗粗 1～3 倍。在 MS 培养
基上 ,健康组培苗叶片大 ,叶面积为病苗的 2～5 倍 ,
无明显的腋芽萌生、节间较长 ,个别苗有根系分化 ;
后期多数苗有中长根生长。
与枣疯病组织培养特性相比 ,各无性系泡桐丛
枝病组织培养苗在 MS 培养基上皆表现典型的丛枝
症状 ,而且在继代培养后期 (约 30 d 后) 一些无性系
会出现特有的腋芽和顶芽膨大和白化症状。这类症
状在受试的枣树品种上一直未观察到。而且 ,染病
泡桐各无性系组培苗茎段在移入新的培养基后 ,能
维持丛枝苗较长时间的连续生长或存活。在培养基
水分供应正常和有足够的生长空间的条件下 ,可维
持生长达半年以上 ,很少出现枣疯病苗培养过程中
常出现的严重衰退或全株死亡现象。泡桐丛枝病组
培苗与枣疯病组培苗在培养过程中存活能力变化的
差异原因尚不清楚。但结合田间发病枣树死亡率明
显高于泡桐发病树的事实分析 ,两种病菌与其相应
的寄主之间的互作关系可能存在着很大的差异。
21112 　染病组培苗体内植原体的检测　用 DAPI 对
不同染病枣树和泡桐组培苗幼茎切片染色 ,然后在落
射荧光显微镜下检查植原体特异荧光的分布和强度。
结果显示 ,在 MS 培养基上 ,枣树组培苗 Ft 的韧皮部
筛管中植原体浓度中至强 ,HPD 次之。但 Ft 在 A、Hy
、Ly 和 ZF 培养基上生长时 ,似乎茎部组织的植原体浓
度低于在MS培养基的浓度。对枣树病苗基部分化的
愈伤组织的切片观察结果显示 ,仍存在不规则的微管
束的愈伤组织的木质部外围筛管部位仍易于检测到
植原体荧光。而且在已变褐或未分化的、松散的黄褐
色愈伤组织薄壁细胞内也观察不到细胞核荧光 ,说明
这些组织细胞已经瓦解。相比之下 ,在泡桐丛枝病组
培苗组织中 ,几乎所有具微管束组织的横切片和纵切
片筛管中都被大量植原体特异性荧光充满。可见 ,泡
桐染病苗在各类组培条件下良好的生长特性和有利
于植原体生长和繁殖的特点 ,成为植原体繁殖和纯化
理想的实验材料 (参见图 2) [12 ] 。各无性系 (品种) 染
病苗体内的植原体都易于用植原体的通用引物对
R16mF2/ R2 经直接 PCR 扩增出 115 kb 的特异片段 ,
而不必经过 nested2PCR 过程。这也进一步肯定了发
病苗体内植原体的存在。
212 　病与健康组培苗间的嫁接传病
21211 　2 个枣树品种嫁接传病结果　枣树嫁接传病
实验是以普通冬枣 (DJ )和抗病婆枣无性系 W14 健康
组培苗为砧木 ,以 Ft 组培苗为接穗进行嫁接的。嫁接
后 ,多数嫁接组合的接口愈合良好 ,并在接口处产生
少量淡绿色的愈伤组织。少数嫁接体的接穗在接口
处变褐枯死。也有部分嫁接接穗在嫁接后从接口上
脱落 (表 1) 。由于嫁接实验是在两地由不同人员操作
完成的 ,两品种间嫁接成功率的差异可能与嫁接技术
有关 ,而非品种特性所致。在嫁接成功的组合中 (以
接穗能正常存活 30 d 以上为准) ,砧木的反应和生长
可归为 3 种不同类型 : (1)砧木能在 MS 或其它培养基
上产生典型丛枝症状 ; (2) 砧木生长衰退 ,节间缩短 ,
叶片黄化或部分枝叶枯死 ,在部分嫁接组合中也出现
了接口处组织变褐和坏死现象 ; (3) 砧木生长与未嫁
接植株无明显的差异 ,叶片大、节间长 ,无明显腋芽分
化 ,主茎较粗。DJ 和 W14 砧木皆可通过嫁接发病 ,并
表现出类似 Ft 接穗的典型丛枝症状 ,但这两个无性系
的症状也有明显差异 (见图 1) ,其中 ,感病冬枣叶片较
大 ,茎较粗 ,而发病 W14 苗叶片很小、主茎纤细。嫁接
接种后同一品种出现上述三种不同反应可能与不同
生理或抗性状态的枣树组培苗个体间对嫁接接种反
应的不同有关。也可能有时虽然接穗被成功地固定
于砧木上 ,但接穗和砧木的韧皮部未能直接连通 ,接
穗仅能通过砧木木质部从培养基中吸收水分维持接
穗的存活 ,而未能传病。
DAPI植原体检测结果显示 ,嫁接发病冬枣在筛
管内发出中等强度的植原体荧光 ,存在植原体的筛
管比例也很高 ,甚至出现高于 Ft 的情况。而发病后
的 W14 在多数筛管内植原体的特异荧光强度都较
低 ,且存在较多未有明显植原体荧光的筛管分子和
许多未有明显植原体存在的切片。用 Ft 接穗嫁接
W14 的某些组合中 ,也出现了虽然病接穗已枯死而
W14 砧木照样发病 ,发病砧木中也检测到了植原体
存在的现象。但在嫁接后未发病的 DJ 和 W14 则检
测不到植原体荧光。直接 PCR 和 nested2PCR 也进一
步证明了发病嫁接苗体内植原体的存在。虽然 W14
发病苗体内植原体的浓度比 DJ 发病苗低 ,但仍能像
DJ 一样用直接 PCR 即可扩增出植原体的特异 DNA
带 ,说明体内的植原体已达到一定的浓度。
当部分嫁接组合的接穗在嫁接后不久从接口脱
落后 ,这些组合的砧木都未表现病症。这暗示病与
健苗短时间的伤口接触引起病菌从接穗侵入砧木的
可能性较小。只有待接穗和砧木的韧皮部筛管相连
通后病菌才可能顺利侵染健康砧木组织。而且也发
现 ,从接口脱落到 MS 培养基上的病接穗与仍在砧
4 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18 卷
木上的病接穗相比 ,掉到培养基上病接穗的叶色较
绿、丛枝症状典型、生长量较大。而与砧木愈合良
好、嫁接成功的病接穗多数叶色较淡、生长减慢、出
现枯梢或枯叶等衰退现象。
表 1 　枣树嫁接传病试验结果
嫁接组合
(砧木2接穗) 株数 成活株数 未接活株数 丛枝症状株数 衰退株数 发病率/% 备注
W142Ft
DJ2Ft 104 104 0 60 0 571723 18 6 17 0 73199 4 5 2 1 2212 嫁接组合体在 ZF 培养基上生长 ,后取发病砧木转入 MS培养基培养嫁接组合体在 JA 培养基上生长 ,后取发病砧木转入 MS培养基培养
　　注 :W142Ft 组合嫁接在河北省林科院完成 ,第一栏为在河北省林科院组培室内调查结果 ,调查时间为 2002 年 10 月 ,第二栏为 2002 年 9 月份
从河北省林科院移入中国林科院森环所组培室的嫁接苗 ,并转接培养基 1 次后于 2003 年 2 月份的调查结果。
图 1 　泡桐和枣树染病组培苗症状、嫁接传病实验和长期保藏实验结果
1～4 :感染枣疯病外植体的组织培养 ,11 河南濮阳扁核酸丛枝组培苗 ,21 辽宁凌源市梨枣丛枝组培苗 ,3、41 河北唐县婆枣品种丛枝组培
苗 ,其中 3 为在 A 培养基中 ,1、2 和 4 为 MS培养基 ;5～7 :枣树嫁接传病实验 ,5、61 用 Ft 病组培苗为接穗 ,以 W14 健苗为砧木 ,5 为嫁接
43 d 结果 ,6 为嫁接 174 d 结果 ,左示嫁接不成功的砧木和接穗 (切口处组织褐化) ,右示嫁接成功组合 ,接穗和砧木皆表现为丛枝症状 ;
71DJ2Ft 嫁接成功苗 ,箭头示嫁接接口 ;81C125 嫁接发病苗在 MS培养基上持续培养 233 d ,丛枝症状典型 ;91 泡桐 TY2TD 病苗茎段在 MS
和石蜡密封的容器中培养实验 ;101 枣树染病组培苗茎段低温保藏实验 ,示保藏 84 d 时茎段维持绿色 ,未有明显生长。
5第 1 期 田国忠等 :枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究
图 2 　染病组培苗和嫁接发病苗的病原检测结果
1～6 :DAPI 荧光显微镜检查枣树和泡桐染病组培苗幼茎切片中植原体荧光。11 嫁接发病冬枣 DJ 幼茎纵切片 ,示筛管内
中量植原体荧光 ,21HPD 幼茎纵切 ,31W14 嫁接发病苗横切片 ,示植原体荧光低至无 ,41LD 幼茎横切片 ,51FT在 A 培养基
上在基部形成愈伤组织中的不规则的韧皮部区域有强植原体荧光 ;61 嫁接发病的 TY2TD 泡桐丛枝组培苗幼茎横切片 ,示
大量的被植原体充满的筛管分子。箭头指向为韧皮部植原体荧光位置。7 : PCR 检测组培苗体内植原体的存在 ,a2DNA
marker ,b2Ft ,c2W14 健康组培苗 ,d2LD ,e2HPD ,f2TY2T ,g2MB33 健康组培苗 ,h2ZD ,i2GY2TD ,j2清水对照。
21212 　3 个泡桐无性系嫁接传病结果　本实验用泡
桐染病组培苗为接穗 ,成功地使 3 个新的泡桐无性
系 MB33、C125 和 TY2T组培苗嫁接传染泡桐丛枝病
植原体 ,发病后的 3 个无性系在普通的MS 培养基上
皆表现典型丛枝症状。但从症状严重程度看 ,以
TY2T丛枝症状最重 ,C125 症状相对较轻。用 C125
重症苗茎段继代培养过程中 ,同一瓶中常出现类似
过去 C443D 和 C852034D 等的重症苗、轻症苗或无症
苗共存的情况[13 ] 。重症苗叶片和叶柄退化 ,腋芽和
顶芽膨大白化、无根 ;轻症苗腋芽伸长 ,叶片变小 ,节
间变短 ,无根或有细短根分化 ;无症苗生长近健康
苗 ,无明显腋芽分化 (图 128) 。在以前的研究中 ,曾
开展过几种泡桐无性系嫁接接种实验研究 ,但 C125
无性系在多次嫁接实验中一直都未发病[3 ] ,本次实
6 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18 卷
验最终使 C125 嫁接发病。分析成功的原因可能与
本次嫁接时砧木的生理状态更有利于病菌的侵染和
定殖有关 ,并暗示了植株抗性的丧失或抗性诱导表
达能力的变化等因素可能在发挥作用。
213 　植原体的长期保藏方法及效果
21311 　植原体株系的组织培养保藏效果 　对本实
验室通过泡桐和枣树无性系 (品系或品种) 组织培养
方式保存的植原体株系的统计结果可以看出 (表
2) ,用组织培养病原物与寄主共生体的方法是长期
保存植原体株系 (分离物)的一种有效方法。在本实
验室内通过定期 (1～3 个月)的茎段继代培养 , 保存
时间最长的、来自山东兖州的泡桐丛枝病植原体一
株系 C852028D 已达 10 a 之久。虽然最初保存此分
离物的泡桐无性系 (C852028) 已因污染而丢失 ,但此
病原物已通过嫁接传染至中林 3 号无性系 ( Paulow2
nia fortuneii ( Seem1) Hemsl1 ×P1 tomentosa ( Thunb1)
Steud1) (ZH)上 (编号为 ZD) ,并进一步通过嫁接传染
至多个泡桐无性系组培苗上 ,包括本次嫁接传病到
了 TY2T、MB33 和 C125 三个无性系上 ,所引致的丛
枝症状典型 ,也未发现病菌在致病性方面的显著遗
传变异。多年来利用此材料开展的大量实验结果说
明 ,此技术是保藏植原体活体的理想方式之一。在
本实验室内 ,枣树染病苗的组培时间也已达 2 a 多。
但枣树染病苗生活力随着在单一培养基上持续培养
时间增长而出现明显的衰退现象 ,所以 ,定期的继代
培养是保存枣树与植原体共生体的关键。在相对感
病品种上 ,像婆枣、冬枣等组培苗体内植原体可维持
在一个中等浓度水平 ,能够用作接穗嫁接传染健康
的组培苗。Dai 等 (1999)的研究发现 ,在对感染桑树
萎缩病植原体 (16SrI2B , 16SrI2B ( rp2B ) 的桑树 ( Morus
alba L1)组培苗继代培养过程中 ,出现许多桑树苗体
内的植原体消失而使组织自动脱毒的现象。但这种
情况在多数枣树和泡桐与之相应的植原体株系共生
体培养过程中较少出现[12 ] 。
21312 　不同组织培养方法和低温保藏方式的比较
　用上述常规方式定期继代培养共生体的方法长期
保存植原体毒源的不足之处是仍比较费时、费工。
在操作过程中 ,常会因培养基污染或其它管理失误
而导致菌种被毁坏 ,比如来自江西分宜的 FYD 株
系、保存在几个泡桐无性系上的多个山东分离株系
皆因各种原因而未能保存至今 (见表 2) 。所以在现
有保藏技术的基础上 ,建立更有效、规范、安全和简
便的植原体株系组织培养保藏程序和技术是提高植
原体保藏质量的重要任务。
表 2 　通过泡桐和枣树无性系(品系或品种)组织培养保存的植原体株系
植原体2寄主组合
植
原
体
组合编号
寄主品种
(无性系) ①
病原物来源
获得发病组
培苗年份
获得染病组
培苗方式
病组培苗在 MS
培养基上症状②
幼茎筛管
病菌浓度③
保藏持续
时间④
泡
桐
丛
枝
病
植
原
体
C443D
C83244D
C852034D
Q4D
FYD
GDR
C852028D
C020D
CAD
ZD
C125D
TY2TD
MB33D
台湾泡桐×海岛泡桐
德州毛泡桐
楸叶泡桐
楸叶泡桐
白花泡桐
种源未知
C852028 (毛泡桐)
C020 (白花泡桐)
XuH(蓿县毛泡桐)
ZH(中林 3 号)
C125 (兰考泡桐)
TY2T(覃优 2 号)
MB33T(毛白 33)
山东兖州
同上
同上
同上
江西分宜
北京
山东兖州
C852028D
同上
同上
同上
同上
同上
1990
1991
1991
1991
1993
1991
1991
1999
1995
1995
2001
2001
2001
田间病枝直接组培
同上
同上
同上
同上
同上
同上
嫁接传病
同上
同上
同上
同上
同上
WB ,THW
WB ,THW
WB ,THW
WB ,THW
WB
WB ,THW
WB ,THW
WB ,THW
WB ,THW
WB ,THW
WB ,THW
WB ,THW
WB ,THW
强
强
强
中
中
中
强
强
强
中
中至强
中
强
至 1994
至 1994
至 1994
至 1994
至 1996
至 1996
至 2000
至 2000
至 2000
至今
至今
至今
至今
枣
疯
病
植
原
体
HPD
LD
Ft
　
　
扁核酸枣
梨枣
赞黄大枣
W14 (抗病婆枣)
DJ (冬枣)
河南濮阳
辽宁凌源
河北唐县
Ft
同上
2002
2002
2001
2002
2002
田间病枝直接组培
同上
同上
嫁接发病
嫁接发病
WB
WB
WB
WB
WB
低至中
低至中
中
低或无
中
至今
至今
至今
至今
至今
　　注 : ①台湾泡桐 Paulownia kawakamii Ito ,毛泡桐 P1 tomentosa (Thunb1) Steud1 ,楸叶泡桐 P1catalpifolia Gong Tong ,白花泡桐 P1fortunei (Seem1)
Hemsl1 ,中林 3 号 Paulownia fortuneii (Seem1) Hemsl1 ×P1 tomentosa (Thunb1) Steud1 ,兰考泡桐 P1elongata S1Y Hu ,枣 Ziziphus zizyphus (L1) Meikle ; ②
WB 为丛枝症状 ,THW为腋芽和顶芽膨大和白化 ; ③为 DAPI 荧光显微镜检查结果 ,“强”表示韧皮部大部分筛管被植原体荧光充满 ,“中”表示约
有半数以上筛管内检测到中量的植原体荧光 ,荧光在筛管内分布不均匀或强度中等 ,“低”; ④截至 2003 年 5 月底。
7第 1 期 田国忠等 :枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究
在泡桐染病组培苗培养过程中 ,当三角瓶的塞
子由棉塞 (外包牛皮纸)改为耐高温的聚苯乙烯塑料
膜封口后 ,继代培养频次明显降低了 ,由原来的 1～
2 个月转接一次 ,可减少到 2～4 个月转接 1 次。塑
料封口瓶与棉塞和带透气滤膜的培养瓶相比大大降
低了培养基的水分蒸发速度 ,避免了因培养基的水
分短缺造成的组培苗生长衰退。而且也发现 ,泡桐
丛枝病组培苗在相对密闭的塑料膜封口处理情况
下 ,培养早期的丛枝症状比透气条件好的棉塞培养
瓶内的病苗症状轻。这在一定程度上延长了染病组
培苗的培养时间。
当将泡桐病苗 TY2TD 组培苗茎段放入含充足的
MS培养基的大三角瓶内 ,然后用石蜡将瓶口完全封
闭 ,在断绝与大气的气体交换的密闭三角瓶中光照培
养情况下 ,早期 (60 d 内)病苗根系分化比与外界有正
常气体交换的培养瓶中病苗的根分化时间略有提早、
根分化数目也相对较多 ,并有叶片增大趋势。但培养
后期 (至 120 d 后)这种差异逐渐减小 ,且完全封闭组
培丛枝苗首先出现了从根和茎基部向主茎的变褐和
坏死现象。至 180 d ,各处理瓶皆出现从茎基部向梢
部扩展的变褐坏死现象 ,但此时梢部仍存活、且丛枝
症状明显。取存活梢部丛枝茎段移入新的MS培养基
上 ,其丛枝症状典型。DAPI 荧光显微镜检查丛枝组
织韧皮部筛管内的病原浓度仍很高。
将感病组培苗 Ft、LD 和泡桐 ZD 组培苗茎段插
入试管内的 MS 培养基斜面上 ,然后将此含染病组
培苗活体的试管置于低温下 (8 ℃左右) 保藏 (1～2
月取出 2～3 次于光照条件下培养 1～2 d 后重新放
回冰箱冷藏) 。结果显示 ,保藏 84 d 后的茎段仍维
持组织存活 ,在新的 MS 培养基中皆能重新生长 ,且
DAPI染色切片证明病菌的繁殖。但当冰箱温度降 4
～6 ℃时 ,导致大部分泡桐无性系染病组培苗枯梢
或全株死亡。而枣树染病苗 Ft、HPD 和 LD 在此温
度保藏 60 d 以上仍未被冻死。说明枣树组培苗比
泡桐对低温的耐受能力强。通过适当降低组培苗和
植原体的生长和代谢活动可以延长保藏时间、大大
减少转代次数。此进一步的保藏条件和长期保藏效
果实验仍在进行中。
3 　讨论
迄今 ,植原体毒源的繁殖和保藏只能在活体寄
主植物上。由于枣树和泡桐皆为落叶树种 ,在树木
长达 5 个月的休眠期 (华北为 11 月至次年 3 月) 和 2
～3 个月的低浓度期 (4～6 月) 间获取毒源带来很大
困难。即使是在生长和发病期间 ,也受树龄、品种抗
性、生长时期和环境的影响 ,其体内的病菌浓度出现
波动。这些都给枣疯病和泡桐丛枝病研究带来很多
不便。采用组织培养苗在室内活体保存和繁殖植原
体已被证明是这类病菌大量繁殖植原体和长期保存
毒源的良好方式之一 ,为进一步开展相关的研究带
来了极大的便利[2～4 ,13 ,14 ] 。国外对苹果树簇叶病植
原体 (16Srx2A)和杨树丛枝病植原体 [ 16SrI2B , 16SrI2
B( rp2B ) ] 等的组织保存试验也证明了这一结
论[15～18 ] 。现在所获得的不同地区、不同枣树品种上
的 3 个植原体株系同泡桐丛枝病组培苗一样将成为
植原体分类鉴定、遗传变异研究、植原体治疗药剂的
筛选和抗病品种的选育研究的重要材料。在长期保
藏植原体2寄主植物共生体方面 ,初步肯定了适宜的
低温条件可以做到象其它可培养微生物纯培养那样
方便。这不仅可以减少常规组织培养保藏的工作
量 ,减少病菌的变异 ,而且 ,可以有效地扩大保藏植
原体的种类和株系 ,使进一步开展相关研究成为可
能。能否采用保藏植物种质的超低温技术 ,比如液
氮 ,保藏植原体与寄主植物共生体也是值得研究的
课题。
根据本实验的结果尚无法确定这 3 个植原体株
系在遗传背景和致病性上的差异。虽然 3 个植原体
组培体系在相同培养基上表现出了生长和症状的差
异 ,但不清楚这种差异是由病菌还是寄主的遗传背
景造成的。进一步探讨通过嫁接传病方式将泡桐丛
枝病菌或枣疯病病原不同分离物转接至 1 种或几种
更适宜于组织培养、植原体繁殖和保藏的标准品种
上 ,将有助于确定植原体株系间的基因或致病性差
异。
从组培苗嫁接传病试验结果 ,及生产上大量应
用的枣树品种间及酸枣 ( Ziziphus zizyphus (L1) Meikle
var1 spinosa (Bunge) Y1L1Chen)和枣树品种间的嫁接
繁殖实践来看 ,泡桐不同种、无性系之间 ,枣树不同
品种之间皆具有良好的嫁接亲和性。因而可以采用
所获得的染病枣树和泡桐组培苗为毒源 ,对待鉴定
泡桐或枣树种质材料的抗性鉴定工作将变得更加方
便和可靠[3 ] 。现已开始对自然或田间嫁接接种鉴定
选择的抗性泡桐和枣树品系进行收集和组织培养工
作。将此嫁接技术用于对基因转化泡桐组培苗材料
的鉴定也已取得了初步的结果[19～21 ] 。
泡桐丛枝病和枣疯病的药剂治疗主要依赖四环
8 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18 卷
素簇药剂的树干注射方式 ,治疗后的复发和药害问
题是制约这类药剂推广应用的主要限制因素。筛选
高效、低毒的新型治疗药剂是这类病害防治上的重
要研究方向之一。现已建立起了泡桐丛枝病组培苗
体系 ,可用于多种植原体病害治疗剂的间接筛选研
究[4 ] 。所以 ,用枣树染病组培苗开展治疗枣疯病药
剂筛选对于找到针对于枣疯病防治的新型药剂可能
更有潜力。
关于不同来源枣疯病植原体、泡桐丛枝病植原
体之间 ,枣疯病植原体和泡桐丛枝病植原体之间生
物学和遗传关系是值得探讨的问题。比如两种植原
体的归类、致病性变异、相互传播等问题都尚待明
确。现已通过 16S rRNA 基因分析比较 ,将这两种病
菌划归不同的植原体组 ,其中枣疯病为榆树黄化组
[16 SrV2B ,16 SrV2B ( rp2C) ] ,泡桐丛枝病为翠菊黄化
组 (16SrI2D) ;并有研究根据分子生物学手段鉴别这
两种病菌 ,推断在田间存在泡桐丛枝病和枣疯病菌
可能的混合感染现象[22～24 ] 。也有研究报道 ,传播枣
疯病植原体的中华拟菱纹叶蝉 ( Hishimononides chi2
nensis Anufriev) 能够传播泡桐丛枝病[25 ] 。所以本实
验室也开展了用泡桐和枣树病与健康组培苗间相互
间嫁接传病试验 ,以期明确两种病菌的致病专化性 ,
这对于进一步明确二者的相互关系具有重要的理论
和实践意义。而且 ,在我国不同地区的枣疯病或泡
桐丛枝病植原体中是否存在遗传多态性 ,特别是在
致病性上的变异问题 ,可以通过收集、组培不同地
区、不同症状类型的枣树或泡桐染病组培苗 ,然后通
过嫁接传染至 1～2 种标准的鉴别品种上 ,来了解不
同分离物的致病性主要分化和变异状况。
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