全 文 ：第 6 卷 第 4 期
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林 业 科 学 研 究 6 . N o
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泡桐丛枝病脱毒组培苗电子显微镜检测 ’::
孙福 生 张锡津 田 国忠
关甘词 泡桐丛枝病 、 类菌原体、 电子显微术
泡桐丛枝病是当前泡桐生产中的严重病害 , 对泡桐丛枝病的病原体—类菌原体 (Myc -
o p la sm a lik e o r g a n ism
, 简称 M LO ) 的研究与检测已愈来愈受到重视 。 目 前 对组织化 学
方法检测的报道较多 , 如迪纳氏染色 、 苯胺蓝染色 , 这些方法有时出现非特异反应 , 只能作
为检测 M LO 对植物侵染的一种辅助手段〔‘”几朱激等人 [ 3 J报道了用 D A PI ( 4 ‘ , 6 一二睐 基一
2 一苯基引噪)荧光显微术 , 可 以用光学显微镜看到 M LO 的类核 D N A 荧光 光点 , 这 是 目
前普遍认为比较成功的检测方法 。 但 D A P I也可使植物细胞内的 线粒 体 、 叶绿体 、 或侵入
的细菌 、 类细菌等发出荧光 , 仍存有一定干扰 , 因此这一手段的应用尚存在局限性。
M L O 的大小一般在80 ~ 80 0 n m 之间 , 只有用电子显微镜才能观察到 。 本文同时应用光
学显微和电子显微技术 , 在修块时注意保留植物组织的韧皮部 , 从而提高了 M LO 的电子显
微镜的检测效率和可靠性, 为泡桐温度处理脱毒组培苗的脱毒效果提供较 为 准 确 的鉴定结
论 。
1 材料和方法
泡桐组培苗的培养和高温脱毒过程参见有关报道〔‘l。 本工作采集 35 ℃ 处理的脱毒组培
苗 (正常生长 、 无丛枝病症状 ) 8 个 , 25 ℃处理的组培苗 (仍表现典型的丛枝病症状 ) 7 个 , 共
15 个样品 。 靠近苗的茎尖。. 5 c m 处切下细茎段 , 再切成 l 一 2 m m 长 的小段 。 在 4 ℃下 用
3 %戊二醛水溶液固定过夜 , 蒸馏水充分清洗后 , 用 1 %锹酸常温下 固 定 6 h , 乙 醇 系 列
脱水 , sP u r 树脂渗透包埋 〔“] 。 超薄切片之前 , 先仔细修块 , 暴露出中心束组织 , 并在超薄切
片机上切下几J一令厚片 , 厚度 约为 2 林m 。 经 1 %碱性番红染色后 , 置于 光 学显微 镜下观察 ,
以确定组织部位 。 再修块留下lJ 皮部及其周围组织 。 超薄切片经柠檬酸铅染色和醋酸双氧铀
染色后 , )月Philip s EM一4 0 0 T 透射电镜观察。
2 结 果
图版 I 一 1 是泡桐丛枝病症状明显的组培苗嫩茎纵切面 。中间细胞密集部分是中心束 , 外
层较大细胞区域为嫩茎的皮层 。 一般幼茎 的构造为 : 从中心向外依次是髓 、 初生木质部 、 维
1 9 93一 0 2一 16 收稿 。
孙 履生工程师 (, l, 因林业科学研究院分析中心 北京 10 0 9 1 ) , 张锡 津, 田国忠 (中国林业科学研究 院 林业研究所丸
* 本文为园家“ 八五 ”攻关项 目“泡桐丛枝病防治技术研 究” 中的一部分。
4 期 孙福生等 : 泡桐丛枝病脱毒组培苗电子显微镜检测
管形成层 、 初生韧皮部和皮层川 。 因此 , 幼茎纵切无论是弦面或径面 (或方向不大准确 ) , 韧
皮部均位于中心束外围 , 与皮层细胞相邻 , 易于辨识 。从图版 工一 1 , 2 可以看 到 , 25 ℃处理的
组培苗嫩茎韧皮部有染色很深的细长细胞 , 此部位的电镜观察表明 , 其中充满 了 MLO 。 对
35 ℃脱毒苗幼茎的相同部分观察 , 没有发现 M LO 存在 。
图版 工一 6 、 7 低倍电子显微照片更清晰地显示了上述情况 。 图版 工“ 6 为中心束内维管
形成层与韧皮部结构 , 图版 I 一 7 是韧皮部与皮层薄壁细胞的结构。 图片显示 , 尽管 韧 皮部
细胞内几乎充满了MLO , 而在相邻的皮层细胞与维管形成层细胞内 , 则没有或极少M LO 。
这与历来 MLO 检测结果一致 。 因而 , 在超薄切片之前 , 用光学显微镜初步确定韧皮部的部
位 , 采用定位切片技术 , 对检测植物组织内是否存在 M LO 是很重要的步骤 。
图版 工一 3 一 5 、 8 分别来自 3 个25 ℃下培养 、 丛枝症状明显的组培苗样品。 有的筛管
细 胞 中 已被 MLO 完全充满 , MLQ 个体之间 已没有空隙(图 版 I 一 3 、 5 左 侧 细 胞 ), 有
的筛管中 , MLO 分布相对比较稀疏 , 可以观察到切面为长形或亚铃形的 MLO , 表明 MLO
群体仍处于分裂增殖之中 。
在一 个 样 品 的韧皮部筛管中 , 除观察到大量 ML O 之外 , 还见到很多纤丝状物质 , 一
簇簇分布 , 这种结构在正常细胞中未发现。其性质及其是否与 M LO 有关 , 尚需进一步探讨 。
本工作应用相同的技术 , 对 35 ℃处理后的 8 个无丛枝症状的组培苗韧皮部 进 行 检查 ,
均未发现 ML O 的存在, 证实: 温度 (35 ℃ )处理结合茎尖培养技术[ 名] , 培养出的泡桐组培苗 ,
是无毒苗 , 这一结果与 D A P I荧光显微镜检测一致。 说明该脱毒技术是成功的。
3 讨 论
自1 9 6 7年D oi 等川发现MLO 以来 , 已发现 30 0多种植物受害 。由于M LO最大仅为8 0 o n m ,
超出了光学显微镜的分辨率极限 , 电子显微成为 MLO 检测、 研究的关键 技术 。 但 电 子 显
微技术中 , 超薄切片经常面积很小 , 有时只包含几十个细胞。 另外 , M LO 在 大树内经常含
量低 , 在树体内分布不均匀 , 分布与季节有关。 因此 , 常出现丛枝症状明显 , 而电镜检不出
的情况 。
本文利用光学显微与电子显微技术相结合的方法 , 对温度处理脱毒泡桐组培苗进行检测 。
对 25 ℃处理 、 丛枝症状明显的样品 , 在韧皮部均发现了大量 MLO , 以同样的方法 , 对脱毒
的组培苗进行检测 , 未观察到 M LO , 这一检测结果是可信的 , 并证实泡 桐组培 、 温度处理
结合茎尖培养脱毒技术的可行性[’, “, 。
为提高电镜对 ML O 的检出率 , 人们早已发展了将 MLO 接种到其它温室植物的技术 ,
例如将 M LO 接种在长春花上[ 。l。 本文所提供的方法 , 也可推广用于其它植物丛 枝病 M LO
的检验 。 如对于患病的大树 , 可分别采集不同部位(根、 茎 、 叶 、 花 )的组织 , 在适当温度下
(如 25 ℃ )进行组织培养 , 再对表现病状的组培苗进行电子显微检测。 因此 , 本方法有一定的
普遍应用价值 。
4 72 林 业 科 学 研 究 6 卷
参 考 文 献
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研itc he s 一 br o o 阴 T is su e by E le c tr o n M ic ro s c o P夕
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A b str a et In this PaP e r the lig h t m ie r o s e o Py
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. 丛枝病定状明显 的泡桐组培苗嫩焦纵切面 ( 1 号样品)。 注意中心束外围有染 色很 深的 细 长 细 胞 , 60 x (光镜 ) , 2 . 图
版 工一 1 韧 皮部及附近区域的局 部放大 , 深色细长细胞 内含有 大量ML O , 1 20 x (光镜 ) , 3 . 韧皮部细胞中的 M LO 。 注意有
长形和哑铃形的M LO 个体 , 8 。。o x , 4 . M LO 的放大 照片 , 2 2 o o o x , 5 . 两个相邻筛管中的M LO , 右侧细胞 中的M LO
仍 处于分裂增殖之中 , 8 0 o x , 6 . 韧皮部与维管形成层 : 韧皮部细胞 内含 大量M LO , 而维管形成 层 中基 本 无M LO ,
1 70 O x , 7
. 韧皮部与皮层薄壁细胞 。 染色发黑的细胞内充满M LO , 而皮层内无M LO , 8 0 x , 8 . 在一个样品中 , 含MLO
筛管中出现纤耸状物质 , 10 0 O x ,