全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 3) : 319 ～ 325
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 03-0319-07
毛竹木质素合成相关基因 C4H 的克隆及组织表达分析
金顺玉1, 卢孟柱1, 2 * , 高 健1
( 1 . 国际竹藤网络中心 , 国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 , 北京 100102;
2. 中国林业科学研究院林业研究所 , 国家林业局森林培育重点实验室 , 北京 100091)
摘要: 采用 RT-PCR 和 RACE 技术, 从毛竹中克隆了 C4H基因 cDNA 全长序列。该基因包含 1 506 bp 开放读码框,
编码 502 个氨基酸。与 NCBI核酸和蛋白数据库中序列进行比对, 结果表明该基因与单子叶植物高粱、水稻和玉米
中的 C4H基因同源性较高, 分别达到 88% 、88%和 87% 。经过荧光定量 PCR 分析, 该基因在毛竹不同发育时期和
不同组织中表达丰度不同, 在冬笋中表达量最高, 其次为春笋顶部、中部、叶、3 年生茎、根、叶鞘、2 年生茎、春笋、1
年生茎, 而在春笋基部中表达最低。在笋顶部、中部的高水平表达表明本文克隆的 C4H基因与发育时期维管组织
的细胞壁加厚相关, 可以作为调控木质素合成的目标基因用于竹子基因工程改良。
关键词: 毛竹; 木质素; C4H; 荧光定量 PCR
中图分类号: S795 文献标识码: A
收稿日期 : 2009-07-08
基金项目 : 十一五国家科技支撑项目 2006BAD19B0203 和 863 项目 2006AA100109
作者简介 : 金顺玉 ( 1980— ) , 女 , 朝鲜族 , 博士生 , 主要研究方向 : 竹子生物技术 , E-mail: jinshunyu@ icbr. ac . cn
* 通讯作者 : 卢孟柱 , 研究员 , 博士生导师 , 分子生物学方向 , E-mail: lumz@ caf. ac. cn
Cloning and Expression Analysis of the C4H Gene Involved in the
Lignin Biosynthesis in Phyllostachys edulis
JIN Shun-yu1, LU Meng-zhu1, 2, GAO jian1
( 1. International Center of Bamboo and Rattan; Key Open Laboratory on Bamboo and Rattan Science and Technology, State Forestry Administration,
Beijing 100102, China; 2. Institute of Forestry Research, Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation,
State Forestry Adeministration, Beijing 100091, China)
Abstract: The full-length cDNA encoding C4H gene was cloned from1-year-old moso bamboo seedings cDNAs using
RT-PCR and RACE methods. The whole open reading frame C4H gene was 1 506 bp encoding 502 amino acids.
The amino acid sequence shared high similarity with the corresponding genes in monocots Sorghum vulgare, Oryza
sativa and Zea mays at 88% , 88% and 87% level, respectively. Real time quantitative PCR showed that
expression of C4H was the highest in winter-shoot, moderate in top-spring shoot, mid-spring shoot, leaf, 3-year-old
stem, root, leaf sheath, 2-year-old stem, whole spring shoot and 1-year-old stem, the lowest in base-shoot. This
indicated that the cloned C4H was involved in the cell wall deposition during the development of vascular tissues,
thus could be used in modulation of bamboo lignin biosynthesis through genetic engineering.
Key word: Phyllostachys edulis; C4H; lignin; Real-time quantitative PCR
毛竹( Phyllostachys edulis ( Carr. ) H. de Lehaie)
在中国竹林中分布范围最广, 经济价值最高[ 1] , 它从
出笋到成竹只需两个月左右, 其纤维含量达 30% ～
35% , 纤维长度达 2 000 μm[ 2] 。目前, 对竹子木质素
的化学结构及合成途径研究积累的数据较少。尽管
竹子在亚热带地区被广泛用作造纸原材料, 但由于无
法有效的去除木质素, 不仅降低了竹纤维素在造纸中
的利用率 [ 3] , 还影响纸浆的品质。采用基因工程方法
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
可以有效地对木质素含量加以改良, 但分离木质素合
成过程中的关键酶的编码基因是首要前提。
肉桂酸 4-羟基 化酶 ( cinnamate-4-hydroxylase,
C4H) 与细胞色素 P45 0单氧化酶相关, 属于 CYP73 亚
家族, 是木质素单体合成的苯丙烷类代谢途径中的
催化第二步反应的关键酶, 其反应生成对-羟基香豆
酸, 与咖啡酸、阿魏酸、5-羟基阿魏酸和芥子酸以及 3
种木质素单体的合成及类型密切相关 [ 4 - 9 ] 。目前已
报道从杨树( Populus sp. ) 、亚洲棉( Goss. pium arbore-
tum Linn. ) 、羽衣甘蓝( Brassica oleracea L. var. aceph-
ala f. tricolor Hort. ) 等植物中克隆了 C4H 基因。通
过调控 C4H基因的表达, 发现其受抑制后转基因植
物的木质素含量、单体数量均显著减少, 并对植物
的正常生长、抗倒伏、抗病没有显著影响, 是改良造
纸植物制浆材性的有效途径 [ 10 - 1 5] 。
本研究以毛竹为材料, 克隆了 C4H全长基因, 并
通过荧光定量 PCR 技术研究了不同发育时期、不同
组织该基因的表达情况, 为将来通过抑制竹材中 C4H
基因的表达, 减少竹材中木质素的含量, 造纸工业的
高效生产, 减少环境污染和能量消耗奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料和试剂
1. 1. 1 材料 克隆基因所用实验材料取自国际竹藤
网络温室 1 年生毛竹实生苗; 研究基因在不同竹子组
织表达毛竹叶片、叶鞘、茎、根的样品取自国际竹藤网
络中心温室 1 年生实生苗, 2 年和 3 年生茎段、春笋、
冬笋取自中国林业科学研究院温室毛竹实生苗。
1. 1. 2 试剂 RNATrizol reagent 提取试剂购自 In-
vitrogen 公司; AMV 酶反转录试剂盒购自 Promega 公
司; SMARTTM RACE 试 剂 盒 购 自 Clontech 公 司;
TaKaRa LA-Taq 酶购自 TaKaRa 公司; DNA 片段快速
纯化 /回收试剂盒购自北京鼎国生物公司; pGEM-T
Easy载体快速连接试剂盒购自 Promega 公司; Roche
SYB GreenⅠ荧光定量 PCR 试剂盒购自罗氏公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 RNA 提取与 cDNA 合成 采用 Trizol rea-
gent试剂盒提取毛竹实生苗的总 RNA, 用 AMV 酶反
转录试剂盒合成 cDNA。采用 SMARTTM RACE 试剂
盒合成 5’和 3’末端 cDNA 片段。操作步骤按试剂
盒说明书进行。
1. 2. 2 基因的克隆与测序 通过 NCBI 数据库获得
玉米 ( Zea mays L. ) 、水稻 ( Oryza sativa L. ) 、高粱
( Sorghum vulgare Pers. ) 等禾本科 ( Gramineae) 单子
叶植物的 C4H基因序列, 根据该基因的保守序列设
计 PCR 引物( 表 1) 。
表 1 实验中设计的引物
引物名称 引物碱基序列 ( 5?- 3?)
PCR 上游引物 CCGGGAAGGGGCAGGACATGGT
PCR 下游引物 GGCGTCGATGGGCTTGCAGACG
5?RACE GSP1 引物 CCGACGCATCTTGCGCCAGTGGTCGCCG
5?RACE GSP2 引物 CGAACACCACGTTGCGGGTGCGGGAGCC
3?RACE GSP1 引物 CTCGCCGGCTACGACATCCCCGCCGAGT
3?RACE GSP2 引物 AGCAGTGGGTGCGCCCCGACGAGTTCCG
Real-Time 上游引物 GCGCCGGCTGCAGCTGATGATGT
Real-Time 下游引物 AGGGGGCGGAGGACGGGGATGA
以毛竹实生苗 cDNA 为模板, 采用 PCR 上游和
下游引物配对进行扩增。PCR 反应体系 20 μL:
MQW 3. 6 μL, 2 ×GC-Buffer Ⅰ10 μL, dNTP Mixture
( 各 2. 5 mmol·L - 1 ) 3. 2 μL, cDNA 1 μL, Forward
Primer( 10 μmol·L - 1 ) 1 μL, Reverse Primer( 10 μmol
·L - 1 ) 1 μL, TaKaRa LA Taq( 5U·μL) 0. 2 μL 。反
应条件为: 94 ℃, 5 min; 94 ℃ 2 min, 56 ℃ 1 min, 72
℃ 3min, 30 个循环, 最后 72 ℃延伸 10 min。
5’和 3’RACE 的反应体系和反应程序相同。初
次 PCR 反应体系 20 μL: 超纯水 3. 2 μL, 2 ×GC-
BufferⅠ 10 μL, dNTP Mixture( 各 2. 5 mmol·L - 1 )
3. 2 μL, cDNA 1. 4 μL, 5’ /3’RACE GSP1( 10 mmol
·L - 1 ) 1 μL, UPM( 10 mmol·L - 1 ) 1 μL, TaKaRa LA
Taq( 5U·μL) 0. 2 μL。反应条件为: 94 ℃, 30 s, 72
℃ 3 min, 5 个循环。接着 94 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 72
℃ 3 min, 5 个循环。然后 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72
℃ 3 min, 25 个循环, 最后 72 ℃延伸 10 min; 第二次
PCR 反应体系为 50 μL: 超纯水 11. 5 μL, 2 ×GC-
BufferⅠ25 μL, dNTP Mixture( 各 2. 5 mmol·L - 1 ) 8
μL, 1 次 PCR 产物 1 μL, 5’/ 3’GSP2( 10 μmol·
L
- 1
) 2 μL, NPM( 10 μmol·L - 1 ) 2 μL, TaKaRa LA
Taq( 5U·μL) 0. 5 μL。反应条件为: 94 ℃, 30 s; 72
℃ 3 min, 5 个循环; 94 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 72 ℃ 3
min, 5 个循环; 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 25
个循环, 最后 72 ℃延伸 10 min。
PCR 产物电泳分析后经 DNA 片段快速纯化 /回
收试剂盒回收, 按照 pGEM-T Easy 载体快速连接试
剂盒操作流程, 将回收的 DNA 片段连接到 T 载体
上, 转化到大肠杆菌( Esherichia coli ( Migula) Castel-
lani and Chelmers) DH5α菌株。经蓝白斑筛选, 提取
阳性克隆质粒并酶切分析后, 进行单克隆测序。
023
第 3 期 金顺玉等: 毛竹木质素合成相关基因 C4H的克隆及组织表达分析
1. 2. 3 荧光定量 PCR 选取 β-actin 管家基因为内
参, 分别以毛竹 1 年生实生苗的根、茎、叶、叶鞘、2
年生茎、3 年生茎、春笋、冬笋的 cDNA 为模板, 采用
罗氏荧光定量 PCR 试剂盒并按照说明书中的 PCR
体系和程序在 LightCycler480 仪器中进行 PCR 扩
增。定量 PCR 的反应体系 18 μL, 为: 超纯水 4 μL,
cDNA 1 μL, Real-Time 上游引物 ( 2. 5 μmol·L - 1 )
2 μL, Real-Time 下游引物 ( 2. 5 μmol· L - 1 ) 2 μL,
Mixer 9 μL。反应条件为: 95 ℃, 5 min; 95 ℃ 30 s,
69 ℃ 30 s, 72℃ 30 s, 10 个循环; 94 ℃ 30 s, 69 ℃
60 s, 45 个循环; 最后 65 ℃延伸 10 min。
1. 3 序列的生物信息学分析
利用 DNASTAR、SMART 等生物信息学软件分
析 cDNA 序列及其编码蛋白质序列的结构特点, 并
与核酸和蛋白质数据库联网进行 blast分析。
2 结果与分析
2. 1 基因保守区片段的克隆与分析
用合成的 cDNA 作模板, 采用设计的 C4H 基因
特异引物扩增保守片段。将 PCR 产物在 1% 的琼脂
糖凝胶中电泳后 EB 染色。结果如图 1 所示, PCR
产物在 1 000 bp 以上处有一条亮带, 与预测的基因
片段相符, 初步确定为目的基因片段。
1, 2: PCR 产物 ; M: 200 bp DNA Ladder Marker
图 1 PCR 扩增产物电泳检测
用胶回收试剂盒回收 PCR 产物, 并与 pGEM-T
Easy载体连接, 转化后得到阳性克隆进行测序, 结果
表明插入片段为 1 089 bp。应用 DNASTAR 软件和
Blast在线软件, 对该序列在 NCBI 数据库中与已经
报道的基因序列进行同源性比较, 表明与 C4H 基因
家族有着较高的同源性, 确定该基因为毛竹 C4H基
因片段。
2.2 5’-RACE 和 3’-RACE 扩增基因全长
利用 5’-RACE 和 3’-RACE 扩增来获得包括基
因全长的 cDNA。根据测序克隆片段的序列设计了
该序列上游 5’和下游 3’RACE 引物( 表 1) , 分别与
SMART
TM 试 剂 盒 通 用 引 物 ( UPM) 和 巢 式 引 物
( NPM) 配对进行扩增。5’RACE 引物和 UPM 的
PCR 产物在 500 bp 位置有一条亮带 ( 图 2) 。将该
PCR 产物回收并与载体连接后转化, 经蓝白斑筛选,
挑单克隆摇菌后测序, 得到 464 bp 的插入片断。与
NCBI 数据库中 C4H基因序列比对结果表明是该基
因序列的一部分, 并含有起始密码子。3’RACE 引
物和 UPM 的 PCR 产物在 800 bp 位置有一条亮带
( 图 3) , 将 PCR 产物回收并与载体连接后转化, 经蓝
白斑筛选, 挑单克隆摇菌后测序。插入片断为 907
bp, 与 NCBI 数据库中 C4H基因序列 Blast 亦表明是
C4H基因序列的一部分, 并含有终止密码子。
1, 2: PCR 产物 ; M: 200 bp DNA Ladder Marker
图 2 通用引物和 5’RACE 引物 PCR 产物电泳检测
1, 2: PCR 产物 ; M: 200 bp DNA Ladder Marker
图 3 通用引物和 3’RACE引物 PCR 产物电泳检测
2.3 C4H 基因的核苷酸序列分析
将 C4H 基 因 的 核 酸 和氨 基 酸 序 列 输 入 到
MatchCode 软件中, 得到该基因的核酸和编码氨基
酸的对应关系( 图 4) 。毛竹 C4H 基因 cDNA 序列
全长 1 746 bp, 从第 71 bp 开始有一个开放读码框,
第 1 577 bp 处 有终止 密码子 , 共编码 了 502 个
氨基酸。
123
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
图 4 毛竹 C4H 基因的序列
将本文克隆的毛竹 C4H基因核酸序列与 NCBI
核酸数据库中的其他物种的 C4H 基因核酸序列进
行比 对, 结 果 表 明 与 高 粱 中 C4H 基 因 ( bj |
AK251894. 1 |) 序列一致性最高, 为 88% ; 其次是水
稻 ( bj |AB207105. 1 |) , 为 88% ; 再次是玉米 ( b |
EU962294. 1 |) , 序列一致性为 87% ; 与大豆 ( Glycine
max ( Linn. ) Merr. ) ( mb |X92437. 1 |GMCYP73) 序
列一致性为 74% 。
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第 3 期 金顺玉等: 毛竹木质素合成相关基因 C4H的克隆及组织表达分析
阴影部分为氨基酸保守区域 , 白色部分为差异区
图 5 毛竹 C4H 基因编码的氨基酸与其他植物 C4H 编码的氨基酸序列的比较
2.4 C4H 基因氨基酸的序列分析
将该基因的蛋白序列通过在 SMART 网站进行
分析, 表明该基因属于细胞色素 p450 酶, CYP73 亚
家族中一员。通过 DNAStar 软件将 NCBI 蛋白数据
库中拟南芥( Arabidopsis thaliana ( L. ) Heynh. ) 、大
豆、水稻、毛白杨( Populus tomentosa Carr. ) 、玉米、高
粱的 C4H氨基酸序列与本实验所得到的毛竹 C4H
氨基酸序列进行比对 ( 图 5) , 得到该基因与其他物
种的氨基酸序列一致性比较得分在 438 ～ 904 之
间, 得分最高的是高粱( b |AAK54447. 1 |) , 与毛竹
基 因 序 列 一 致 性 为 87% ; 其 次 是 水 稻 ( b |
AAV44089. 1 |) 和玉米( b |ACG34412. 1 |) , 序列一
致性均为 87% ; 再次是大豆( mb |CAA63172. 1 |) 序
列一致性为 78. 4% ; 而与毛白杨( b |EEE95897. 1 |)
的一致性为 77% ; 与拟南芥( mb |CAP08828. 1 |) 一
致性为 76% ; 与烟草 ( Nicotiana tabacum L. ) ( b |
323
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
AAK62344. 1 |) 的序列一致性为 65% 。从构建的不
同物种 C4H基因的系统进化树( 图 6) 可看出与毛竹
C4H基因亲缘最近的是单子叶同科的水稻, 其次是
高粱和玉米; 与模式植物拟南芥、双子叶的大豆、木
本的杨树还是有较大的差异。这与核酸比对的结果
基本一致( 图 6) 。图中显示虽然单、双子叶物种该
基因序列有很大的不同, 但在单子叶植物中竹子与
水稻等单子叶植物有很高的同源性。
系统树每一分支由上至下顺序是 : 毛果杨 ×美洲黑杨 ; 毛白杨 ; 大
豆 ; 拟南芥 ; 高粱 ; 玉米 ; 水稻 ; 毛竹
图 6 基于不同植物 C4H 基因编码氨基酸序列构建的系统树
2.5 毛竹 C4H 基因组织特异表达分析
根据已知序列设计并合成荧光定量 PCR 反应
所需引物, 配对进行 PCR 扩增, 获得 PCR 产物约为
200 bp( 图 7) 。将 PCR 产物回收并与载体连接后转
化, 经蓝白斑筛选, 挑单克隆测序, 得到 177 bp 的插
入片断, 与 NCBI 数据库中 C4H基因序列 Blast分析
结果表明, 是该基因的一部分序列。
1 , 2, 3, 4: PCR 产物 ; M: 100 bp DNA Ladder Marker
图 7 RT-PCR 引物扩增产物电泳检测
分别取国际竹藤网络中心温室前两年盆栽毛竹
实生苗的叶片、叶鞘、茎、根, 以及同盆前年毛竹实生
苗的茎和同盆当年毛竹实生苗的茎段、当年的冬笋、
当年的春笋作为样品。进行荧光定量 PCR 检测
C4H基因的表达。上样时每个样品重复 3 次以增加
数据的准确性。数据经仪器自带软件进行分析, 得
到了不同时期、不同组织的相对表达量 ( 图 8) 。扩
增峰值单一, 产物的解链温度值均一, 为 93. 43 ℃,
说明产物扩增具有特异性。
图 8 C4 H基因 RT-PCR 相对定量分析
定量分析结果表明, 1 年生组织中 C4H 基因在
笋中表达量最高, 其次是叶片、叶鞘和根, 表达量最
少的是茎; 随着竹龄的增加, 茎中 C4H 的表达有所
增加。在笋的不同部位 C4H也有所不同, 顶端和中
部表达量较高, 但基部的表达要比前两者低很多( 图
8) 。C4H的表达量相差最大的是冬笋和春笋的基
部, 前者为后者的 1 000 倍 ( 图 8) , 这可能是在温室
中采集的冬笋实际上仍处于旺盛生长期。上述结果
表明在笋处于高速生长时期 C4H基因出现高表达。
3 讨论
无论是核酸还是氨基酸序列的比对结果都显
示, 与毛竹 C4H基因相似性最高的均是单子叶禾本
科的高粱、水稻、玉米中的 C4H 基因, 而与双子叶及
木本等植物亲缘关系较远。可见禾本科内该基因比
较保守, 同源性可达到 87% 以上。由此为利用禾本
科特别是水稻的基因组序列数据库来分离竹子基因
提供了理论和技术途径, 即先采用禾本科植物基因
423
第 3 期 金顺玉等: 毛竹木质素合成相关基因 C4H的克隆及组织表达分析
的保守区设计引物, 扩增保守片段, 再利用 RACE 方
法获得全长序列。虽然在禾本科内很保守, 但在不
同科之间, 该基因的保守性并不高, 同源性只有
50% 左右。这为利用该同源基因的进化来推断不同
科属进化关系提供了依据。
木质素和纤维素是植物细胞壁的重要组成成
分, 植物木质化是木质素在植物细胞壁中积累的结
果 [ 16 - 1 7] 。竹笋处于竹子生命活动初期阶段, 是快速
生长中的茎。其居间分生组织经过细胞分裂、分化、
伸长和木质化, 实现竹笋的快速节间生长和加粗, 短
时间内完成竹的早期生长。紧随着笋下部细胞的增
殖和伸长停止, 细胞转为以细胞壁的沉积为主, 而处
于下部的细胞木质化减弱。在本实验中, C4H 基因
在竹笋的上部与中部表达量相似而明显高于竹笋基
部的表达量与竹笋顶部细胞壁加厚过程中伴随着木
质素和纤维素的大量合成相一致。实验中还发现在
1 年生竹叶、叶鞘、根中的表达量高于茎, 推测后者
木质素合成较少。
木质素单体甲基化程度不同, 产生不同类型木
质素单体, 拥有不同类型的连接键, 使得在制浆造纸
处理中断裂的难易程度不同, 从而影响制浆造纸的
脱木质素 [ 18] 。紫丁香基木质素( S) 与愈创木基木质
素( G) 单体数目的比值越高越有利于木质素与纤维
素分离 [ 19] 。有研究认为 C4H 可能与其它的酶形成
多酶复合体来控制 S 型木质素的生成 [ 11 - 12 ] 。因此,
本研究采用 PCR 扩增结合 RACE 方法从竹子中分
离了 C4H基因, 为应用基因工程技术, 培育出木质
素含量低、S/ G 高, 适于制浆造纸的新型竹种奠定了
基础。
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