全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (2) : 278～282
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0220278205
油茶优良无性系 ISSR分子鉴别
张国武 1, 2 , 钟文斌 2 , 乌云塔娜 3 , 谭晓风 3 , 杜天真 13
(1. 江西农业大学园林艺术学院 ,江西 南昌　330045; 2. 中国林业科学研究院亚热带林业实验中心 ,江西 分宜　336600;
3. 中南林业科技大学经济林栽培与育种国家林业局重点实验室 ,湖南 长沙　410004)
摘要 :采用 ISSR分子标记 ,以 1个普通油茶实生苗作为对照 ,对我国南方 10个油茶优良无性系进行了遗传多样性
分析。实验从 99条引物中筛选出多态性较高的 16条 ISSR引物进行 PCR扩增 ,共扩增出 135个位点 ,其中多态性
位点数为 114个 ,多态性位点比率为 84. 44%。基因型间的平均遗传距离 ( GD)为 0. 419,其中优良无性系与对照之
间的 GD值相对较大 ,平均为 0. 58。聚类结果表明 ,油茶优良无性系与普通油茶实生苗存在较大的遗传差异 ,同时
也较准确地进行了各优良无性系的分子鉴别 ,为油茶的良种选育提供了理论依据。
关键词 : ISSR;分子标记 ;油茶 ;优良无性系
中图分类号 : S794. 4 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006206220
基金项目 : “高品质油茶有机栽培及基地建设关键技术研究”,江西省科技厅重大招标项目 (20041A0500200) ,教育部博士点基金项目
(20050410002)
作者简介 : 张国武 (1966—) ,男 ,江西新余人 ,高级工程师 ,在读博士 ,主要研究方向 :森林培育. E2mail: fyzgwu@ yahoo. com. cn3 通讯作者 :杜天真 ,教授 ,博士生导师.
Iden tif ica tion of O il Tea( C am ellia o le ife ra ) Super ior
C lones by ISSR M olecular M arker
ZHANG Guo2wu1, 2 , ZHONG W en2bin2 , W uyuntana3 , TAN X iao2feng3 , DU Tian2zhen1
(1. College of Landscape and A rt, J iangxi Agricultural University, Nanchang　330045, J iangxi, China; 2. Subtrop ical Experimental
Center of Forestry, CAF, Fengyi　336600, J iangxi, China; 3. The Key Laboratory of Non2wood Forest Product of
State Forestry Adm inistration, Central South University of Forestry and Technology, Changsha　410004, Hunan, China)
Abstract: ISSR were used to detect the genetic diversity among 10 oil2tea camellia superior clones and 1 control
samp le ( seedling). 16 p rimers out of 99 were screened out and 135 ISSR markers were amp lified from these clones
with 114 polymorphic loci. The average genetic distance between genotypes of clones was 0. 419, which was of closer
distance compared with that between superior clones and control samp le, 0. 58. The study showed that there was a
big genetic distance between them and established the molecular identification of oil tea superior clones. It means
that a sound ground was laid down for the molecular breeding of oil2tea.
Key words: ISSR; molecular marker; oil2tea camellia (Cam ellia oleifera) ; superior clones
茶油是世界上最优质的木本食用油。我国油茶
(Cam ellia oleifera Abel. )生产存在的突出问题是大
面积低产且不稳定 ,年平均产油不足 45 kg·hm - 2 ,
主要原因是由于油茶长期处于野生、半野生状态 ,自
然实生繁殖 ,后代分离大 ,且具异花授粉特性 ,种内
变异极其丰富 ,林分中品种类型复杂。20世纪 60
年代以来 ,我国研究工作者在油茶良种选育等方面
做了大量工作 [ 1～3 ]。90年代以来 ,这项工作取得了
第 2期 张国武等 :油茶优良无性系 ISSR分子鉴别
重大突破 , 选育的品系年产油量达 686. 33 ～
1 046. 9 kg·hm - 2。新世纪以来 ,分子标记技术开
始应用于油茶技术研究 [ 4～8 ]。其目的是建立油茶不
同体系的分子鉴别体系 ,并从中筛选与主要经济性
状相关的特殊基因片段 ,有利于辅助选择育种。
ISSR ( Inter2simp le Sequence Repeat Polymor2
phism )分子标记与 RAPD 原理相似 ,不同处在于
ISSR所用引物来源于简单序列区域 ,比随机扩增的
多态 DNA (RAPD )引物序列长 ,退火温度较高 ,具有
稳定性优于、敏感性低于 RAPD的特点。 ISSR操作
简单 ,成本低 ,快速灵敏 ,检测多态性能力强、所需
DNA模板的量少 [ 9 ]而倍受青睐 ,已成功地运用于居
群生物学的研究 [ 10, 11 ]、品种鉴定 [ 12, 13 ]、物种的分类
系统学比较 [ 14, 15 ] ,并作为构建遗传图谱的工具 [ 16 ]。
本实验选用我国南方 10个油茶优良无性系及 1
个普通油茶实生苗对照为材料 ,采用 ISSR分子标记
分析各材料之间的遗传差异 ,旨在探索各个基因型
之间的亲缘关系 ,为开展油茶良种选育提供较可靠
的理论依据。
1　材料和方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　供试材料 　供试材料 (见表 1)中的 10个无
性系由中国林业科学研究院亚林中心长埠林场提
供 ,实生苗来自湖南长沙普通油茶林。
表 1　用于 ISSR分析的供试材料及被认定的相关经济性状
编号 名称 原产地 球果产量 / ( kg·hm - 2 ) 成熟期 种仁含油率 /% 球果数 / (个·kg - 1 ) 干出籽率 /%
1 GLR长油 3号 江西进贤 12 039 早 35. 73 69 31. 3
2 GLR长油 4号 江西进贤 11 129 中 35. 02 82 26. 4
3 GLR长油 18号 浙江安吉 9 379 早 50. 05 72 27. 6
4 GLR长油 21号 浙江安吉 19 318 早 49. 69 91 32. 0
5 GLR长油 27号 浙江安吉 18 968 早 41. 18 67 20. 6
6 GLR长油 40号 浙江安吉 16 938 早 39. 32 90 25. 2
7 GLR长油 53号 浙江安吉 24 148 早 43. 58 40 32. 0
8 GLR长油 56号 浙江安吉 15 678 早 42. 96 56 33. 0
9 GLR长油 59号 湖南衡阳 18 758 早 39. 96 60 25. 7
10 实生苗对照 (CK) 湖南长沙 / / / / /
11 GLR长油 166号 江西进贤 13 887 早 51. 40 84 24. 0
1. 1. 2　 ISSR引物 　 ISSR引物的名称和序列 (见表
2) ,由上海英骏生物技术公司合成。
表 2　ISSR引物名称及序列
引物
名称 序列 (5’- 3’)
引物
名称 序列 (5’- 3’)
812 GAGAGAGAGAGAGAGAA 851 GAGTGTAGATGTGTGTYG
815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 852 TCTCTCTCTCTCTCTCRA
821 GTGTGTGTGTGTGTGTTT 853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT
840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 854 TCTCTCTCTCTCTCTCRG
841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 857 ACACACACACACACACYG
843 CTCTCTCTCTCTCTCTRA 860 TGTGTGTGTGTGTGTGRA
844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 899 CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA
846 CACACACACACACACART 900 ACTTCCCCACAGGTTAACACA
1. 2　实验方法
1. 2. 1　DNA的提取 　基因组 DNA的提取主要采用
中南林业科技大学经济林育种和栽培国家林业局重
点实验室改良的 CTAB法 [ 17～19 ]。试验材料为 10个
油茶优良无性系及 1个普通油茶实生苗对照苗木上
取下的叶片。采样前先对待试验的叶片进行瓶闭 ,
让其进行暗反应 ,消化叶片含糖量 ,提高基因组
DNA的纯度。
1. 2. 2　DNA纯度测定 　DNA纯度的测定采用核酸
蛋白分析仪 (DU640 )。测定的指标主要包括 , abs
(260 nm)、abs(280 nm)。
1. 2. 3　 ISSR扩增
1. 2. 3. 1　引物筛选 　用 ISSR引物对各供试材料进
行 PCR扩增 ,筛选出有稳定扩增条带且多态性较高
的引物进行 PCR扩增试验 [ 20 ]。
1. 2. 3. 2　 ISSR2PCR反应体系 　 ISSR2PCR反应总
体积是 10 μL。包括 0. 8 μL 的 2. 5 mmol·L - 1
dNTPs, 0. 8μL的 2 mmol·L - 1 MgCl2 , 1. 0μL的 10
×PCR buffer, 0. 4μL的引物 p rimer, 0. 14μL的 5 u
·μL - 1 Taq DNA p loymerase, 20 ng的 DNA temp late,
6. 26μL的 SDW ( ddH2 O )。
1. 2. 3. 3　 ISSR2PCR反应程序 　94 ℃预变性 5 m in
后 , PCR扩增 38个循环 ,每个循环 94 ℃变性 45 s,
52 ℃复性 45 s, 72 ℃延伸 1. 5 m in,最后一个循环结
束 ,然后在 72 ℃延伸 7 m in。最后 4 ℃保存。
1. 2. 4　电泳
1. 2. 4. 1　基因组 DNA 电泳 　采用的是 8. 0 g·
972
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
kg- 1的琼脂糖凝胶。
1. 2. 4. 2　 ISSR2PCR产物的电泳 　 ISSR2PCR产物
电泳采用的是 20 g·kg- 1的琼脂糖凝胶。
1. 2. 5　数据分析 　每个样品的扩增条带按有或无
记录 ,扩增条带存在赋值 1,否则赋值 0。
1. 2. 6　 ISSR数据的统计分析方法 　标准遗传距离
( Genetic D istance, GD )计算公式为 : GD = - ln [ 2N ij /
(N i + N j ) ] ,其中 N i和 N j分别为 i和 j两个供试材
料的条带数 , N ij为 i和 j共有的条带数。GD值越小 ,
表示其亲缘关系越近。GD值越大 ,表示其亲缘关系
越远。
利用 POPgene32软件进行各供试材料间 UPG2 MA ( Unweighted Pair2group Method with A rithmeticMean,算术平均加权配组法 )聚类分析。2　结果与分析2. 1　油茶无性系 ISSR扩增结果用 99条引物对各材料进行了 PCR扩增 ,选取出 16条稳定性强、重复性好、多态性丰富的引物。然后利用筛选出的 16条引物对 11个供试材料进行PCR扩增 , PCR扩增产物经电泳得到指纹图谱。结果表明 :不同基因型之间具有不同的谱带类型。这说明不同供试材料在 DNA水平上存在遗传差异。
图 1　不同引物 ISSR2PCR电泳图 (编号 1～11同表 1)
图 1为引物 899及引物 900的 ISSR谱带图 ,
由图显示出 ,引物 899的 11个材料 ISSR谱带图
共有 12个多态性位点 ,引物 900有 15个多态性
位点。说明这两条引物能够很好的区分 11个供
试材料 ,同时也说明了所选的材料之间存在明显
的遗传差异。
2. 2　D NA的多态性分析
通过对 16张图谱统计分析 ,共检测了基因组
DNA中 135个位点 ,其中多态性位点有 114个 ,占扩
增总位点数的 84. 44% (见表 3)。每个引物扩增的
带数一般在 3～12条之间 ,平均为 6条 ,检测结果
(见表 4)。
表 3　 ISSR引物特异性条带数
引物
扩增
带数
多态性
DNA条带数
% 引物
扩增
带数
多态性
DNA条带数
%
812 6 4 66. 67 851 3 3 100
815 12 9 75 852 6 5 83. 33
821 6 6 100 853 8 6 75
840 9 7 77. 78 854 9 6 66. 67
841 8 7 87. 5 857 12 12 100
843 5 4 80 860 7 7 100
844 6 6 100 899 14 12 85. 71
846 8 5 62. 5 900 16 15 93. 75
(总计 ) 135 114 84. 44
表 4　各引物对各材料的扩增带数
引物 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
812 5 3 5 5 6 4 5 3 3 4 2
815 8 8 9 12 9 6 6 9 9 8 10
821 5 2 6 1 6 2 5 2 1 0 1
840 6 5 9 4 3 6 3 4 6 4 3
841 6 2 3 8 3 2 3 3 2 3 2
843 5 5 4 4 5 4 5 4 5 4 6
844 2 4 5 6 5 4 5 5 4 5 3
846 7 8 7 7 8 5 6 5 7 7 5
851 2 2 1 1 3 2 3 1 3 2 2
852 3 2 3 3 4 6 3 3 4 3 5
853 6 6 4 6 5 7 8 6 6 4 5
854 9 5 6 7 8 4 7 6 7 8 6
857 6 8 9 10 12 7 10 10 8 0 9
860 5 7 4 0 5 5 3 4 4 3 4
899 12 8 12 9 14 9 8 6 7 8 9
900 15 10 11 9 10 8 16 8 12 10 9
由实验结果可以看出 ,扩增带数最多的为 900
号引物 ,平均 11条扩增带 ;最少的为 851,平均 2条
扩增带。多态性最好的是 857号引物 ,扩增出 12个
位点均具有多态性。在扩增出的 135个位点的条带
中 ,其中有 21条为各个基因型所共有 ,这为 11个材
料间的同源性提供了依据。此外 ,不同引物扩增的
082
第 2期 张国武等 :油茶优良无性系 ISSR分子鉴别
带数不同 ,而且同一引物不同基因型的扩增的带数
也不一样 ,这充分体现了油茶基因组 DNA 的多态
性 ,从而说明了不同供试材料之间的遗传差异性。
2. 3　遗传差异
为了确定油茶各供试材料基因之间的遗传关
系 ,利用每个材料的扩增条带按有或无记录 ,扩增条
带存在赋值 1,否则赋值 0的数据分析方法 ,建立了
11个材料的 ISSR识别卡 (见表 5)。
表 5　11个材料 ISSR鉴定识别卡 (引物 899)
编号
ISSR鉴定标记
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
识别号
1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 001000001000
2 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 010001000000
3 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 111100100011
4 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 011000101001
5 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 001010100101
6 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 000100011000
7 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 101110110100
8 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 100101011100
9 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 101110110000
10 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 000011110000
11 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 011010011001
由各材料基因型间的遗传距离 (表 6)可知 ,油
茶基因型间的平均遗传距离 ( GD )为 0. 419,基因型
之间 GD值范围为 0. 167 1～0. 773 2,其中优良无性
系与实生苗的遗传距离 GD相对较大 ,平均为 0. 58,
说明这二者存在明显差异。而无性系 3号和 18号 ,
27号和 56号 , 21号和 40号之间的 GD值较小 ,说明
他们之间的亲缘关系较近。
2. 4　聚类分析
为了确定各供试材料之间的遗传关系 ,通过
ISSR遗传距离矩阵按 UPGMA 进行了聚类分析 ,构
建各材料基因型之间的亲缘关系 (见图 2)。
聚类分析中 ,把材料基因型间的遗传距离作
为材料聚为一类的依据。由聚类图可以看出 ,取
GD = 0. 65时 ,可将 11个供试材料划分为 3大类
群。类群 Ⅰ为油茶实生苗对照 ,与所有无性系划
分在不同的类群中 ,这和实生苗与无性系苗在形
态、生理等特征方面的较大差异性相吻合 ,如实
生苗苗木分化严重 ,无性系苗普遍成熟期早等 ;
类群 Ⅱ为 GLR长油 4号一个无性系 ,这可能与表
1记录的该无性系相对其它无性系果实成熟晚、
种仁含油率低的特征相一致 , 4号无性系果实成
熟期为“中 ”,种仁含油率仅 35. 02 % ,其它 9 个
无性系成熟期均为“早 ”,种仁含油率除了 3号无
性系较 4号略高外 ,其它平均为 44. 76 % ,高出了
近 12个百分点 ;类群 Ⅲ为其它 9个无性系 ,这可
能与它们普遍成熟相对较早、种仁含油率相对较
高相关。同时 ,聚类分析也显示出各优良无性系
间存在一定的差异 ,可以从分子水平上将它们进
行鉴别。
图 2　油茶优良无性系及对照聚类分析图
(CY代表 GLR长油 : DZ代表普通油茶实生苗对照 )
表 6　 ISSR标记的 11个材料的遗传距离及相似性
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 3 3 3 3 0. 692 3 0. 923 1 0. 769 2 0. 769 2 0. 769 2 0. 846 2 0. 923 1 0. 769 2 0. 538 5 0. 769 2
2 0. 367 7 3 3 3 3 0. 615 4 0. 461 5 0. 769 2 0. 615 4 0. 692 3 0. 769 2 0. 615 4 0. 538 5 0. 615 4
3 0. 080 0 0. 485 5 3 3 3 3 0. 846 2 0. 846 2 0. 846 2 0. 923 1 0. 846 2 0. 846 2 0. 615 4 0. 846 2
4 0. 262 4 0. 773 2 0. 167 1 3 3 3 3 0. 692 3 0. 846 2 0. 769 2 0. 692 3 0. 846 2 0. 769 2 0. 846 2
5 0. 262 4 0. 262 4 0. 167 1 0. 367 7 3 3 3 3 0. 846 2 0. 769 2 0. 846 2 0. 846 2 0. 615 4 0. 846 2
6 0. 262 4 0. 485 5 0. 167 1 0. 167 1 0. 167 1 3 3 3 3 0. 769 2 0. 692 3 0. 846 2 0. 769 2 0. 846 2
7 0. 167 1 0. 367 7 0. 080 0 0. 262 4 0. 262 4 0. 262 4 3 3 3 3 0. 769 2 0. 769 2 0. 538 5 0. 769 2
8 0. 080 0 0. 262 4 0. 167 1 0. 367 7 0. 167 1 0. 367 7 0. 262 4 3 3 3 3 0. 846 2 0. 461 5 0. 692 3
9 0. 262 4 0. 485 5 0. 167 1 0. 167 1 0. 167 1 0. 167 1 0. 262 4 0. 167 1 3 3 3 3 0. 615 4 0. 692 3
10 0. 619 0 0. 619 0 0. 485 5 0. 262 4 0. 485 5 0. 262 4 0. 619 0 0. 773 2 0. 485 5 3 3 3 3 0. 769 2
11 0. 262 4 0. 485 5 0. 167 1 0. 167 1 0. 167 1 0. 167 1 0. 262 4 0. 367 7 0. 367 7 0. 262 4 3 3 3 3
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
3　小结
(1)利用 ISSR分子标记的方法 ,从 99条引物中
筛选出 16条具有多态性的引物进行扩增 ,得到 135
个位点 ,其中 114个具有多态性 ,说明油茶各供试材
料间存在较大的遗传差异。
(2)利用 16条引物对供试材料进行 ISSR分析
表明 ,油茶优良无性系与普通油茶实生苗之间 ,长油
4号无性系与其它 9个无性系之间的遗传距离大 ,
与其在生理、性状表现上的差异性分析基本一致 ,说
明了遗传本质差异对外部表型特征的对应反映。同
时 ISSR分析实现了对各供试材料的分子鉴别 ,较准
确地确立了它们之间的亲缘关系。对彼此间亲缘关
系较近的无性系 ,如长油 27号与长油 56号具有第
一分枝较高的共性 ,长油 166号为小果红色 ,类似差
异性和相似性的表型特征有待在实践中作进一步研
究探讨。
(3) ISSR分子标记可建立油茶优良无性系的分
子鉴别体系 ,进行油茶更多品种的分类鉴定和遗传
关系研究 ,并为油茶的选择育种提供理论依据。
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