全 文 ：收稿日期 : 2003202217
基金项目 : 2001 年浙江省丽水市科技局“牛肝菌菌根成因及仿生栽培技术研究”(编号 :2001003)
作者简介 : 应国华 (1963 —) ,男 ,浙江缙云人 ,高级工程师 ,在读硕士研究生.
林业科学研究　2004 ,17 (1) :66 ～ 71
Forest Research
　　文章编号 :100121498 (2004) 0120066206
褐环粘盖牛肝菌菌种分离研究
应国华1 , 吕明亮1 , 陈连庆2
(11 浙江省丽水市林业科学研究所 ,浙江 丽水　323000 ;
21 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400)
摘要 :以影响褐环粘盖牛肝菌菌种分离成活率、初始菌丝萌发速度、菌丝生长状况为参照标准 ,通过对
培养基、分离材料、分离环境、培养方法 4 个方面 10 种因素研究表明 ,培养基以制作到分离时间 10 d
的 MMN 配方为好 ,材料以阴、晴天采集的中、幼子实体的菌肉、菌管最好 ,分离环境可以野外就地、可
以室内接种箱 ,培养方法以分离后试管斜放效果最好。
关键词 :褐环粘盖牛肝菌 ;培养基 ;分离材料 ;分离环境 ;培养方法
中图分类号 :S64613 　　　文献标识码 :A
牛肝菌是野生食用菌的重要组成类群 ,据报道 ,我国已发现牛肝菌目 (Boletales) 的种类达
390 种以上 ,可食的 199 种[1 ] 。许多种是与松科 (Pinaceae)植物共生的菌根食用菌 ,其中美味牛
肝菌 ( Boletus edulis Bull1 :Fr) 、褐环粘盖牛肝菌 ( Suillus luteus (L. : Fr) Gray) 、点柄粘盖牛肝菌
( Suillus granulatus (L. :Fr) O1Kuntce) 等[2 ,3 ]在浙江丽水市均有分布 ,具有很高的研究开发价
值。为进一步开发丽水市的特色资源 ,2001 年作者承担了丽水市科技局设立的重大科技攻关
项目 ———牛肝菌菌根成因及仿生栽培技术研究 ,对丽水市两种重要牛肝菌 ———褐环粘盖牛肝
菌、缘盖牛肝菌 ( Boletus appendiculatus (Schaeff1 : Fr) Secretan) (系美味牛肝菌的变种升格而成)
开展研究 ,现将褐环粘盖牛肝菌菌种分离结果初报如下。
1 　材料与方法
111 　分离材料
牛肝菌子实体、菌丝束、菌塘组织。供分离子实体除野外就地分离外均小心采集完整后用
纸包好 ,菌丝束、菌塘组织连带部分菌柄用纸包好带回室内。
112 　分离培养基配方
MMN 配方[4 ] 、PDA 配方[5 ] 。
113 　试验方案
根据腐生食用菌菌种分离及褐环粘盖牛肝菌特点 ,对分离材料、培养基、分离环境等影响
分离成功率的因子设计了试验处理。
11311 　不同培养基配方的分离　试验选用 MMN 配方和 PDA 配方。
11312 　不同分离材料的分离　分离材料设子实体、菌丝束、菌塘组织 ,子实体又分孢子、菌肉、
菌管、菌柄。
11313 　不同成熟度子实体的分离　成熟度分为成熟 (菌盖边缘伸直) 、中熟 (菌盖边缘内卷较
多) 、幼菇 (菇较大但尚未开伞) 。
11314 　不同天气采集子实体的分离　试验天气分晴天、阴天、小雨天。
11315 　子实体采后到分离时间不同的分离　试验设 4、24、48 h 共 3 种时间处理 ,24、48 h 的子
实体放置于室内通风处。
11316 　分离前子实体表面处理与否的分离　试验设 75 %酒精药棉擦洗 + 无菌水冲洗 + 无菌
药棉擦干 ,不处理两种。
11317 　不同的分离环境的分离　分离环境设野外就地、室内开放、接种箱 3 种。子实体表面
均不作杀菌剂处理 ,接种箱空间消毒采用气雾消毒剂熏蒸。
11318 　培养基中抑菌剂添加[5 ]与否的分离 　设添加与不添加两种处理。抑菌剂为庆大霉素
(质量分数为 10 mg·kg - 1) 。
11319 　试管培养基制作到分离不同时间的分离　试验时间设 2、10、30 d 3 种处理。
113110 　分离后试管排放方法不同的分离　试验设平放和斜放 (倾斜度为 30 ～ 60°)两种处理。
除配方试验外 ,其余试验培养基均采用 MMN 配方 ;除分离材料、成熟度试验外 ,子实体均
采中熟程度 ,分离采用组织分离法 ,组织取自菌肉。每种试验每个处理为 10 支试管 ,分离后置
25 ℃生化培养箱培养。不定时观测、检查结果。
2 　结果与分析
211 　不同培养基配方的分离效果
　　两种培养基配方对褐环粘盖牛
肝菌的分离效果差异很大 ,无论从
成活率、初始菌丝萌发速度、初始菌
丝密度、生长势等方面 MMN 配方
都显著地优于 PDA 配方 ,MMN 配
方长满试管斜面的时间为 25 ～ 30
d ,而 PDA 配方在萌发长入斜面后 ,
生长趋缓 ,7 d 后停止生长 ,菌丝逐
渐变黄、老化。原因是PDA配方无
表 1 　不同培养基配方的分离效果
项目 MMN PDA
成活数/ 支 成活①9 不活 1 成活 3 不活 7
成活率/ % 90 30
初始菌丝萌发速度 快 慢
菌丝状况② + + + + 25 ～ 30 d 满管 + + 7 d 后停止生长
　　注 : ①成活指分离材料能萌发出新的菌丝可以转管 ;不成活包括不萌
发和杂菌污染。②菌丝状况 : + + + + + 表示菌丝密度高、生长势好 , +
+ + + 表示菌丝密度较高、生长势较好 , + + + , + + ,依次趋弱 (后表相
同) 。
法满足褐环粘盖牛肝菌菌丝生长的营养需求 (表 1) 。
212 　不同分离材料的分离效果
不同的分离材料其分离效果差异很大 ,从分离成活率来看 :菌管、菌肉分离效果最好 ,成活
率达到 90 %以上 ;菌柄分离成活率较菌管、菌肉低 ,为 40 % ;菌丝束、孢子、菌塘的分离成活率
仅分别为 20 %、0 %、0 %。其原因可能菌肉和菌管分离时无须药剂处理、切取方便 ,虫害少 ,易
成活 ;菌柄因其直径较小、易受虫危害 ,污染较多 ;菌丝束分离不仅成活率较低、污染率也高 ,原
76第 1 期 应国华等 :褐环粘盖牛肝菌菌种分离研究
因有褐环粘盖牛肝菌的菌丝束外形与双孢蘑菇 (Agaricus bisporus (Large) Sing. ) 相似 ,不象蜜环
菌的 ( Armillariella mellea (Vahl . ∶Fr. ) Karst . )菌丝束外面有一层鞘 ,容易受消毒药剂的影响 ,或
杀菌太过、无菌水冲洗导致组织块含水太高不萌发 ,或杀菌不够或无菌水冲洗不够而导致污
染 ;孢子分离没有成活其原因可能是培养基不适宜 ;菌塘组织分离失败均为杂菌污染。从菌丝
生长状况看 :菌管分离的菌丝萌发最快 ,初始菌丝密度高、色度白 ,生长势强 ;菌肉分离的初始
菌丝萌发较快 ,生长势较强 ,初始萌发的菌丝较稀 ;菌丝束和孢子分离的初始菌丝萌发不仅慢 ,
且菌丝较稀。经转管培养后菌丝密度、生长势趋于一致 (表 2) 。
表 2 　不同分离材料的分离效果比较
项目 孢子 菌肉 菌管 菌柄 菌丝束 菌塘组织
成活数/ 支 成活 0 不活 10 成活 9 不活 1 成活 9 不活 1 成活 4 不活 6 成活 2 不活 8 成活 0 不活 10
成活率/ % 0 90 90 40 20 0
初始菌丝萌发速度 快 最快 较快 慢
菌丝状况 + + + + + + + + + + + + + + +
213 　不同成熟度子实体的分离效果
子实体成熟度对分离的成活率有一定的影响 ,幼菇成活率达 100 % ,中熟菇可达 90 % ,成
熟菇为 40 %。可见子实体成熟度低的效果好 ,随着成熟度的提高 ,分离成活率呈下降趋势 ,原
因是随着成熟度的提高 ,初始菌丝萌发趋慢、杂菌污染增多。从菌丝状况看 ,子实体成熟度低
的萌发快、长势好 ,成熟度高的菌丝长势稍差 (表 3) 。
214 　不同天气采集子实体的分离效果
不同天气采集的子实体对分离的菌
丝长势没有影响 ,对分离成活率影响较
大 ,晴天、阴天分离成活率高 ,可以达到
90 %以上 ;雨天采集的分离成活率低 ,仅
10 % ,其原因是雨天采集的子实体水分
含量高 ,分离的组织块不易萌发 ,细菌污
染率高 ,影响分离成活率 (表 4) 。
215 　子实体采后到分离不同间隔时间
的分离效果
　　子实体采后到分离间隔时间不同分
离效果有差异 ,主要表现在成活率方面 ,
对菌丝生长势没有影响。成活率随着放
置时间的延长而呈下降趋势 ,4 h 试验的
成活率达 100 % ,24 h 的成活率也高达
80 % ,效果相当理想 ,48 h 的成活率比较
低 ,为 50 %。原因是随着放置时间的延
长组织块的萌发率下降 (表 5) 。
表 3 　不同成熟度子实体的分离效果比较
项目 幼菇 中熟菇 成熟菇
成活数/ 支 成活 10 不活 0 成活 9 不活 1 成活 4 不活 6
成活率/ % 100 90 40
初始菌丝萌发速度 快 快 慢
菌丝状况 + + + + + + + + + + +
表 4 　不同天气采集子实体的分离效果比较
　
项目 晴天 阴天 雨天
成活数/ 支 成活 9 不活 1 成活 10 不活 0 成活 1 不活 9
成活率/ % 90 100 10
初始菌丝萌发速度 快 快 慢
菌丝状况 + + + + + + + + + + + +
表 5 　子实体采后到分离间隔时间不同的分离效果比较
项目 4 h 24 h 48 h
成活数/ 支 成活 10 不活 0 成活 8 不活 2 成活 5 不活 5
成活率/ % 100 80 50
初始菌丝萌发速度 快 快 慢
菌丝状况 + + + + + + + + + + + +
86 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 17 卷
216 　分离前子实体表面处理与否的分离效果
分离前子实体表面以不处理为好 ,成活
率高 ,达 80 % ;而采用 75 %酒精 + 无菌
水处理的成活率反而低 ,为 50 % ,主要
是萌发率低 ,细菌污染多。试验观察发
现 ,子实体较小的 ,这种情况特别明显
(表 6) 。
表 6 　分离前子实体表面处理与否的分离效果比较
项目 75 %酒精 + 无菌水 不处理
成活数/ 支 成活 3 不活 7 成活 8 不活 2
成活率/ % 50 80
初始菌丝萌发速度 略慢 快
菌丝状况 + + + + + + + +
217 　不同的分离环境的分离效果
不同的分离环境只影响分离的成活
率 ,而对初始菌丝的萌发速度、菌丝生长
势没有影响。从成活率看 ,野外就地分
离和在接种箱内分离效果好 ,分别达到
70 %、90 % ,尤其是野外就地分离能够达
到 70 % ,这对其他野生菌菌种分离具有
借鉴意义 (表 7) 。
表 7 　不同的分离环境的分离效果比较
项目 野外就地 室内开放 接种箱
成活数/ 支 成活 7 不活 3 成活 1 不活 9 成活 9 不活 1
成活率/ % 70 10 90
初始菌丝萌发速度 快 快 快
菌丝状况 + + + + + + + + + + + +
注 :3 种分离环境所用材料 ,采集到分离时间差距不到 1 h。
218 　培养基中抑菌剂添加与否的分离效果
培养基中抑菌剂 (庆大霉素 10 mg·kg - 1)加与否对菌肉的组织分离效果 ,无论是成活率、初
始菌丝萌发速度、还是菌丝生长势 ,均没有明显差异 ;但对以菌丝束为材料的分离抑菌剂的添
加其效果差异很大。添加抑菌剂的成活率达 30 % ,而没有添加抑菌剂其成活率为 0 % ,其原因
可能为添加抑菌剂浓度没有掌握准确 ,没有能完全抑制住杂菌 ,同时与菌丝束这种分离材料有
关 (表 8) 。
表 8 　培养基中抑菌剂添加与否的分离效果比较
项目
添加抑菌剂
菌肉 菌丝束
不添加
菌肉 菌丝束
成活数/ 支 成活 9 　不活 1 成活 3 　不活 7 成活 9 　不活 1 成活 0 　不活 10
成活率/ % 90 30 90 0
初始菌丝萌发速度 快 较慢 快 —
菌丝状况 + + + + + + + + + + + —
219 　试管培养基制作到分离间隔时间不同的分离效果
　　试管培养基制作到分离的间隔时间
不同对分离效果影响很大 ,从成活率来
看 ,试管培养基制作到分离时间 10 d 的
效果最好 ,达到 90 % ,而 2、30 d 的成活
率仅为 20 %、30 % ,原因是 2 d 的培养基
表面尚有许多冷凝水 ,影响初始菌丝的
萌发 ,而30 d的培养基表面失水 ,影响初
表 9 　试管培养基制作到分离间隔时间不同的分离效果比较
　
项目 间隔 2 d 间隔 10 d 间隔 30 d
成活数/ 支 成活 2 不活 8 成活 9 不活 1 成活 3 不活 7
成活率/ % 20 90 30
初始菌丝萌发速度 较慢 快 慢
菌丝状况 + + + + + + + + + +
始菌丝的萌发和扩展 ,导致成活率太低。从初始菌丝的萌发速度、菌丝生长势看也以 10 d 的
为好 (表 9) 。
96第 1 期 应国华等 :褐环粘盖牛肝菌菌种分离研究
2110 　分离后试管不同排放方法的分离效果
分离后试管排放方法对分离效果影响非常明显 ,主要表现在成活率、初始菌丝萌发速度方
面 ,斜放明显优于平放 ,特别对培养基制作到分离时间为 2 d 的尤其显著 ,成活率由 20 %提高
到 70 % ,这是提高分离成活率的有效措施。分离后试管排放方法对菌丝生长势没有影响
(表 10) 。
表 10 　分离后试管排放方法不同的分离效果比较
项目
平放
2 d ① 10 d
斜放
2 d 10 d
成活数/ 支 成活 2 　不活 8 成活 7 　不活 3 成活 7 　不活 3 成活 10 　不活 0
成活率/ % 20 70 70 100
初始菌丝萌发速度 较慢 较快 较快 快
菌丝状况 + + + + + + + + + + + + + + + +
　　注 : ①指培养基制作到进行分离的间隔时间。
3 　小结与讨论
(1)影响褐环粘盖牛肝菌分离的因素有培养基、分离材料、分离环境、培养方法 4 个方面。
培养基因素包括配方组成、是否添加抑菌剂、培养基制作到分离时间。其中配方组成、培养基
制作到分离时间是主要的 ,本试验结果配方以 MMN ,培养基制作到分离时间 10 d 最好。作为
腐生食用菌常用的分离、培养配方 PDA 不适于褐环粘盖牛肝菌的分离培养。
(2)分离材料因素包括分离材料类别、子实体采后到分离时间、不同天气采集子实体、不同
成熟度子实体。以阴天、晴天采集的幼、中熟子实体的菌肉、菌管效果最好 ,采后到分离时间不
宜超过 24 h。
(3)分离环境以野外就地、室内接种箱最好。原因是野外林地人为活动少 ,空气新鲜 ,分离
主要污染菌木霉 ( Trichoderma spp . ) 、青霉 ( Penicillium spp . ) 在空气中含量少 ,接种箱的空气经
过消毒 ,成功率高。而室内空间人活动多 ,木霉、青霉类等杂菌孢子含量高 ,因而效果差。
(4)培养方法以分离后试管斜放效果最好。主要原因是制作的斜面培养基表面往往有一
些冷凝水 ,会抑制菇体组织块萌发菌丝。如果采用增加琼脂降低冷凝水 ,其培养基往往较硬 ,
也不利于菇体组织块萌发菌丝。
该方法对其他菌根食用菌菌种分离有较好的借鉴意义。
参考文献 :
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07 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 17 卷
A Preliminary Study on the Isolating of Suillus luteus
YING Guo2hua1 , LU Ming2liang1 , CHEN Lian2qing2
(1. The Forestry Research Institute of Lishui City ,Zhejiang Province ,Lishui 　323000 ,Zhejiang ,China ;
2. Research Institute of Subtropicai Forestry ,CAF ,Fuyang 　311400 ,Zhejiang ,China)
Abstract :Taking the survival rate of the isolation of strain ,the speed of germination of the first hypha and the
state of hypha’growth as the standard ,ten factors concerning the culture medium ,the isolating material , the iso2
lating environment and the culture method were studied. It showed that the medium should be ten days old from
making to isolating ,the best contents was BOH ,the best materials were pileus and tubuli of the middle and young
fructification that were collected in sunny or cloudy days. The isolating environment might be the open air or the
transfer box in room. The best isolating method was to put the test tube slantways after isolating.
Key words :Suillus luteus ;culture medium;isolating material ;isolating environment ;culture method
17第 1 期 应国华等 :褐环粘盖牛肝菌菌种分离研究