全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (2) : 292～294、(封三 )
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0220292204
发根农杆菌诱导牡丹生根的初步研究
杨至德 1 , 王 　雁 23 , 刘雪梅 1 , 缪 　崑 2 , 汤巧香 1
(1. 天津城市建设学院规划与建筑系 ,天津　300384; 2. 中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091)
关键词 :发根农杆菌 ;牡丹 ;侵染 ;组织培养 ;毛状根
中图分类号 : S685. 11 文献标识码 : A
收稿日期 : 2005210219
基金项目 : 国家林业局 948项目 (200424212)的部分研究内容
作者简介 : 杨至德 (1963—) ,男 ,山东章丘人 ,副教授 ,主林从事园林植物繁殖工作.3 通讯作者 : wangyan@caf. ac. cn
Prelim inary Study on Ha iry Root O ccurrence of
Peony Induced by A grobac trium rh izogenes
YANG Zhi2de1 , WANG Yan2 , L IU Xue2m ei1 , M IAO Kun2 , TANG Q iao2xiang1
(1. Tianjin U rban Construction Institute, Tianjin　300384, China;
2. Research Institute of Forestry, CAF; Key Laboratory of Tree B reeding and Cultivation, State Forestry Adm inistration, Beijing　100091, China)
Abstract: The paper exp lored the possibility of hairy root occurrence of peony induced by A grobactrium rh izogenes.
It showed that R1000 had the highest hairy root inducement with a hairy root rate of 35% , whereas strains A4,
MSU22 and MT232 had little difference in hairy root occurrence. Infect conditions had great influence on hairy root
inducement, and the better ones are: acetosyringone concentration, 30 mg·L - 1 ; infection time, 15 m inutes; and
culturing conditions of strains, temperature 28 ℃, 28 hours shaking culture under dark environment with shaking.
Pre2experiment on tissue culture system of peony was conducted, and got better medium composition as: W P + 62BA
0. 5 mg·L - 1 + IBA 0. 1 mg·L - 1 + GA3 0. 5 mg·L - 1 for base buds, and MS + 62BA 2. 0 mg·L - 1 + IBA 0. 1
mg·L - 1 + GA3 0. 5 mg·L - 1 for stem segments.
Key words:A grobactrium rh izogenes; peony; infect; tissue culture; hairy root
长期以来 ,牡丹 ( Paeon ia suffru ticosa Andr. )以
嫁接和分株繁殖为主 [ 1, 2 ] ,周期长 ,繁殖系数低 ,不
能适应市场需求。有关牡丹组织培养无性快繁技术
的报道 [ 3, 4 ] ,大多数限于实验室阶段 ,并未真正应用
于大规模生产 ,其主要障碍是牡丹外植体生根困难 ,
发根率极低 [ 5 ] ,而且有些品种 ,采用以培养基筛选和
激素配比筛选为框架的组织培养技术 ,根本就不能
解决生根问题 [ 6, 7 ]。发根农杆菌 (Ag robactrium rh izo2
genes)能诱导植物产生毛状根 ,并且毛状根不具向
地性 ,可在无外源激素的培养基上生长发育成新的
植株 [ 8, 9 ]。人参 ( Panax g inseng C. A. Mey)、丹参
( Sa lvia m iltiorrh iza Bge. )、大黄 ( R heum offcina le
Baill. )、碧冬茄 ( Petun ia hybrida V ilm. )、葛 ( Pueraria
edu lis Pamp. )、商陆 ( Phytolacca acinosa Roxb. )和短
叶红豆杉 ( Taxus brevifolia Nutt. )等 160多种植物用
发根农杆菌诱导 ,均获得了毛状根 [ 10～14 ]。牡丹属双
子叶植物 ,用发根农杆菌诱导 ,有可能产生毛状根。
本研究用发根农杆菌诱导牡丹毛状根 ,以提高牡丹
外植体的生根率 ,探讨建立牡丹组织培养无性快繁
的新途径。
第 2期 杨至德等 :发根农杆菌诱导牡丹生根的初步研究
1　材料与方法
1. 1　侵染材料
供试牡丹品种为‘大富贵 ’( P. suffru ticosa Andr
cv. Da Fu Gui. )和‘紫二乔 ’( P. suffru ticosa Andr
cv. Zi Er Q iao)。侵染材料分 2类 :第 1类为直接侵
染材料。外植体从野外采回 ,进行消毒处理 ,直接进
行侵染接种试验 ;第 2类为继代侵染材料。首先获
得牡丹组织培养继代体系 ,然后用继代小植株叶片
和嫩茎作为侵染材料。
1. 2　牡丹组培继代体系
1. 2. 1　外植体消毒与褐化处理　消毒处理设 3种 : ①
2%的次氯酸钠 ,消毒 45 m in; ② 0. 1%的升汞 ,消毒 15
min; ③ 0. 1%升汞消毒 10 min,转入 2%次氯酸钠 +氨
苄青霉素 10 mg·L - 1 ,消毒 15 m in。褐化处理设 3个 :
①流水浸泡 24 h +活性炭 (3 g·L - 1 ) ; ②1% PVP; ③流
水浸泡 24 h + 1% PVP +活性炭 (3 g·L - 1 )。
1. 2. 2　培养基筛选　在预备试验的基础上 ,仅对激素
进行正交试验筛选。茎段以 MS为基本培养基 ,根际萌
蘖芽以 WP为基本培养基。正交设计为 L8 (27 ) ,三因
素二水平 : 62BA,分别为 0. 5、2. 0 mg·L - 1 ; IBA分别为
0. 1、0. 5 mg·L - 1 ; GA3为 0. 5、1. 0 mg·L - 1。
1. 3　发根农杆菌菌株及培养
侵染用菌株为 A4、MSU22、R1000和 MT232,由课
题组从美国 ATCC公司引进。菌株活化 :取 0～4 ℃
保存的菌株 ,转接入预先配制并消毒的液体培养基
上 , 25 ℃摇床振荡暗培养 48 h,转接到琼脂平板培养
基上备用。菌株 MSU22和 MT232采用 ATTC 1701培
养基活化 ;菌株 A4和 R1000采用 YEB培养基活化。
1. 4　药品及主要仪器
主要仪器与药品 : PVP,德国进口分装 ;乙酰丁
香酮 ,美国进口分装 ; HP1500GS智能人工气候箱 ,
HZ200LB恒温摇床。
1. 5　培养时间与菌株侵染活力试验
设 24、28、32、36 h 4个不同培养时间 ,在 28 ℃、
120 r·m in - 1下振荡培养。
1. 6　侵染诱导
1. 6. 1　直接侵染材料 　首先按组织培养程序 ,对外
植体进行消毒处理 ,然后将消过毒的外植体进行创
伤处理 (茎段穿刺、叶片打孔 ) ,并用浸蘸法进行发
根农杆菌侵染。置 28 ℃黑暗人工气候箱中 ,共培养
48 h后 ,转入光照下继续培养 ,观察记载菌株和外植
体生长情况。培养 3～4 d后 ,取出外植体 ,无菌水
冲洗数次 ,转入新鲜培养基中作继代培养 ,转接 4～
5次。12～15 d毛状根长出 ,约 1 cm长时转入含头
孢霉素 300 mg·L - 1培养基上杀菌 ,转接 3 ～ 4次。
1. 6. 2　继代侵染材料 　取继代小植株叶片和嫩茎 ,
超净工作台上打孔、穿刺。叶片长 4～11 cm,嫩茎长
3～6 cm。小于 5 cm的叶片 ,打孔 2个 ;大于 5 cm的
叶片 ,打孔 4个。嫩茎穿刺 4 ～5次 ,两端剪口平
滑。侵染、培养及观察同直接侵染材料。
1. 6. 3　卡那霉素抗性鉴定 　剪下毛状根 ,长 2～3
cm,分别植入含有卡那霉素的 W P和 MS培养基以
及不含卡那霉素的 W P0和 MS0培养基上培养。卡那
霉素含量为 20、40 mg·L - 1。观察毛状根生长情况。
2　结果与分析
2. 1　供试品种外植体培养体系的建立
2. 1. 1　不同消毒方式对外植体成活率的影响　从表 1
中看出 ,根际萌蘖芽用③号消毒方法 ,成活率可以达到
3% ,而用①号消毒方法 ,成活率为 1. 5%。与茎段相
比 ,根际萌蘖芽成活率高 ,但是 ,总的来说 ,牡丹外植体
消毒成活率很低。其原因 :一是外植体表面带菌量高 ,
表面消毒困难。根段长期与土壤接触 ,茎段长期暴露
于空气中 ,自然就感染了大量的病菌 ;二是牡丹内部带
菌问题。‘过消毒’(有意加大消毒剂浓度和消毒时间 )
试验中 , 4%次氯酸钠消毒 45 m in + 0. 1%升汞消毒
45 m in,接种 10～15 d后外植体变黑死亡 ,但外植体上
仍会长出白色的真菌菌丝体来。作者认为 ,长期以来
牡丹的繁殖靠嫁接和分株 ,潜伏于牡丹体内的病菌就
会因嫁接和分株一代代向下传 ,导致内部带菌 ,仅作表
面消毒处理不能杀死外植体内部的病原菌。
表 1　大富贵外植体不同消毒处理对接种成活率的影响
外植体类型 消毒方式 接种 /瓶 污染 /瓶 成活 /瓶 成活率 / %
茎段 ① 200 199 1 0. 5
② 200 199 0 0. 0
③ 200 198 2 1. 0
根际萌蘖芽 ① 200 197 3 1. 5
② 200 197 3 1. 5
③ 200 194 6 3. 0
　　注 : ① 2%的次氯酸钠 ,消毒 45 m in; ② 0. 1%的升汞 ,消毒 15
m in; ③0. 1%升汞 10 m in,转入 2%次氯酸钠 +氨苄青霉素 10 mg·
L - 1 ,消毒 15 m in。
2. 1. 2　培养基筛选结果　外植体培养以 WP和 MS为
基本培养基。WP用于根际萌蘖芽的培养 ,MS用于茎
段培养。通过正交试验对激素种类和激素配比进行筛
选后发现 ,用于根际萌芽和茎段的培养基分别以 WP +
62BA 0. 5 mg·L - 1 + IBA 0. 1 mg·L - 1 + GA3 0. 5 mg·
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
L - 1和 MS + 62BA 2. 0 mg·L - 1 + IBA 0. 1 mg·L - 1 +
GA3 0. 5 mg·L - 1为最好。GA3对促进外植体萌发伸长
生长的效果特别明显 ,加入 GA3的根际萌蘖芽外植体 ,
接种 30 d后 ,芽伸长生长可达 10～15 cm。
2. 1. 3　不同处理对褐化程度的影响 　牡丹外植体
酚类物质含量高 , 仅丹皮酚的含量就可达到
19 g·kg- 1 ,此外 ,还有牡丹酚苷、芍药苷等。这些
化学物质极易引起外植体的褐化 ,影响牡丹组织培
养无性繁殖体系的建立。在减轻褐化所采取的 3种
处理当中 , ①号和 ③号处理效果较好 ,而 ②号处理效
果不明显 (表 2)。
表 2　接种后不同时段的褐化程度
处理
时段 / h
6 24 48 144
① 轻 轻 中 中
② 轻 中 中 重
③ 轻 轻 轻 中
　　注 : ①为流水浸泡 24 h +活性炭 (3 g·L - 1 ) ; ②为 1% PVP; ③
为流水浸泡 24 h + 1% PVP +活性炭 (3 g·L - 1 )。轻度褐化 :外植体
周围培养基浅黄色 ,散射分布 ,不连续 ,范围不超过 1 mm;中度褐化 :
外植体周围培养基黄褐色 ,沿外植体形成 1圈 ,直径 1～2 mm;重度
褐化 :外植体周围培养基褐色 ,以外植体为中心成环状 ,直径大于 2
mm,外植体切口变黑。
2. 2　发根农杆菌侵染和毛状根诱导
菌株培养时间对菌株侵染活力的影响试验表
明 ,培养 28 h时菌株侵染力最强 , 32 h后菌液混浊、
变黄 ,侵染力减弱。
在培养基类型、菌株培养时间、叶片打孔数目
和茎穿刺数目都相同的情况下 (表 3 ) , R1000菌
株的毛状根诱导率最高 ,叶片外植体诱导率达到
35 %。外植体均为继代培养幼小植株的茎和叶
片 ,直接接种外植体成活率低 ,侵染成活率也低。
卜学贤 [ 15 ]等报道用 R1000侵染毛白杨 ( Popu lus
tom en tosa Carr. ) ,叶片切段毛状根发生率可以达
到 59 %。本试验用相同类型的 R1000菌株 ,但毛
状根诱导率较低 ,可能是由于牡丹本身生根率较
低所致。在该试验中 , M SU 22 和 A4 诱导毛状根
产生的效果不明显 , M T232未见其明显促进毛状
根发生的效果 ,但 Strobel[ 16 ]用萝卜圆盘所做的试
验表明 ,其诱导萝卜的发根量比 TR105高 1倍。
本试验中 M T232的毛状根诱导率低 ,可能是由于
牡丹体内含有大量的酚类物质 ,造成生根困难
所致。
表 3　不同发根农杆菌菌株对‘大富贵 ’毛状根诱导的影响
菌株 外植体
接种数 /
瓶
产生毛状根
外植体数
发根率 /
%
培养基
类型
菌株培养
温度 /℃ 时间 /m in
侵染时间 /m in
A4 茎段 60 0 0 1 /2 MS +AS 28 28 15
叶片 60 4 7 MS +AS 28 28 15
MSU22 茎段 60 3 5 1 /2 MS +AS 28 28 15
叶片 60 6 10 MS +AS 28 28 15
R1000 茎段 60 17 28 1 /2 MS +AS 28 28 15
叶片 60 21 35 MS +AS 28 28 15
MT232 茎段 60 2 3 1 /2 MS +AS 28 28 15
叶片 60 0 0 MS +AS 28 28 15
　　接种在含有 40 mg·L - 1卡那霉素的 W P培养基
上的诱导毛状根 , 6～7 d后有少量死亡 ,平均存活率
达到 69% ,而牡丹正常根接种在同样培养基上 , 12
～14 d后全部死亡。卡那霉素用量为 20 mg·L - 1
时 ,对正常根的杀死所需时间较长 (18～21 d) ,作用
不明显。
乙酰丁香酮对毛状根的发生有一定影响 (表
4)。当用 R1000 菌株诱导时 , 在培养基中加入
30 mg·L - 1乙酰丁香酮 ,叶片毛状根诱导率可以达
到 35% ,而不加乙酰丁香酮诱导率仅为 15% ;但对
于菌株 A4、MSU22和 MT232,用同样浓度和相同方 法诱导时 ,乙酰丁香酮的作用不明显。表 4　不同浓度乙酰丁香酮 ( A s)对毛状根诱导的影响浸蘸时间 /m in A s浓度 /(mg·L - 1 ) 外植体数 /个 产生毛状根外植体数 /个 发根率 /%15 60 60 7 1230 60 21 350 60 9 15从表 5看出 ,浸蘸 15 m in最好 ,浸蘸 30 m in时 ,外植体本身所含的酚类物质从切口处外渗增多 ,使菌液变混浊 ,严重影响菌株的侵染能力。
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第 2期 杨至德等 :发根农杆菌诱导牡丹生根的初步研究
表 5　不同外植体浸蘸时间对‘紫二乔 ’
毛状根诱导的影响
浸蘸时间 /m in 外植体数 /个 产生毛状根外植体数 /个 发根率 /%
3 30 5 17
15 30 9 30
30 30 2 7
　　注 :菌株为 R1000,培养基中加入浓度为 30 mg·L - 1乙酰丁香酮
另外 ,外植体刺伤处理时 ,叶片打孔或茎段穿刺
太多 ,严重影响外植体的活力 ,有时会造成外植体死
亡 ,不利于发根农杆菌的侵染。叶片打孔时 ,要将圆
孔打在叶脉处 ,此处含有中柱鞘 ,是发根农杆菌侵染
的主要途径。不含中柱鞘的部位 ,发根农杆菌基本
不能侵入。叶柄切口处比叶片圆孔处产生的毛状根
多。诱导毛状根成功的外植体 , 65%的毛状根都生
长自叶柄切口处。茎段两端切口处毛状根发生率也
高于中间穿刺点 ,但上下切口之间毛状根的数量和
生长状况无明显差别 ,说明根的生长已失去了极性
现象。
3　小结
用发根农杆菌诱导牡丹外植体产生毛状根 ,毛
状根诱导率随菌株不同而有所变化。R1000菌株的
侵染力最强 ,侵染发根率最高可以达到 35%。毛状
根诱导率受浸蘸时间、菌株培养时间、外植体刺伤处
理情况和某些化学物质的影响。本研究所得到的较
好的发根条件是 :培养基中乙酰丁香酮的加入量为
30 mg·L - 1 ,外植体浸蘸时间为 15 m in,菌株培养时
间为 28 ℃振荡暗培养 28 h。
牡丹外植体表面消毒后直接用发根农杆菌侵
染 ,成功率极低。一方面是因为外植体消毒困难 ,成
活率低 ;另一方面是因为发根农杆菌的侵染成功率
也不高。牡丹外植体组织培养体系的建立 ,是发根
农杆菌诱导毛状根发生的基础。牡丹外植体接活成
功率虽然很低 ,最高只有 3. 0% ,但只要有数瓶成
活 ,再用发根农杆菌诱导毛状根就容易成功。牡丹
根际萌蘖芽和茎段的较好培养基分别为 : W P + 62
BA 0. 5 mg·L - 1 + IBA 0. 1 mg·L - 1 + GA3 0. 5 mg
·L - 1和 MS + 62BA 2. 0 mg·L - 1 + IBA 0. 1 mg·
L - 1 + GA3 0. 5 mg·L - 1。
用发根农杆菌诱导牡丹外植体产生毛状根 ,是
牡丹通过组织培养技术实现工厂化生产的重要途径
之一。另外 ,牡丹毛状根诱导后 ,由毛状根再产生的
植株 ,株型明显缩小。这有利于矮化牡丹品种的培
育 ,牡丹盆栽的前景广阔。
参考文献 :
[ 1 ] 李艳敏 ,罗晓芳. 牡丹离体培养与快速繁殖研究进展 [ J ]. 西南林
学院学报 , 2004, 24 (1) : 70～73
[ 2 ] 郭绍霞 ,张玉刚 ,任茹. 中国牡丹研究进展 [ J ]. 莱阳农学院学报 ,
2003, 20 (2) : 116～121
[ 3 ] 李玉龙 ,黄守印. 牡丹试管苗繁殖技术的研究 [ J ]. 科学通报 ,
1984 (8) : 500～502
[ 4 ] 孔详生 ,张妙霞. 牡丹离体快繁技术研究 [ J ]. 西北园艺 , 1998 ( 3 /
4) : 87～89
[ 5 ] Kunnemen B P, A lbersM R. Tissue culture of peony is not yet p ro2
ducing p lants [ J ]. B loem Bollencultuur 1989, 100 (23) : 16～17
[ 6 ] Bouza L, JacquesM,M iginiac E. Requirements for in vitro rooting of
P. suffruticosa Andr. cv. ’Mme de vatry’[ J ]. Scientia Horticulture,
1994, 58 (3) : 223～233
[ 7 ] Harris R A, Mantel S H. Effects of stage ( II) subculture durations
on the multip lication rate and rooting capacity of m icrop rogated shoots
of tree peony ( P. suffru ticosa ) [ J ]. Journal of Horticultural sci2
ence, 1991, 66 (1) : 95～100
[ 8 ] 戴均贵 ,朱蔚华. 发根培养技术在植物次生代谢物生产中的应用
[ J ]. 植物生理学通讯 , 1999, 35 (1) : 69～76
[ 9 ] 刘传飞 ,于树宏 ,李玲 ,等. 发根土壤杆菌对葛属药用植物的遗传
转化 [ J ]. 植物学报 , 2000, 42 (9) : 936～939
[ 10 ] 张汉明 ,许铁峰 ,丁如贤 ,等. 发根农杆菌 R i T2DNA对墨旱莲的
遗传转化 [ J ]. 中草药 , 2001, 32 (10) : 924～926
[ 11 ] 徐子勤 ,贾敬芬 ,胡之德. 发根农杆菌 A4菌株转化苜蓿悬浮培
养物 [ J ]. 生物工程学报 , 1997, 13 (1) : 53～57
[ 12 ] Park SANG2UN, Facchini P J. Agrobacterium rhizogenes2mediated
transformation of op ium poppy, Papaver som niferum L. , and Cali2
fornia poppy, Eschscholzia californica Cham. , root cultures [ J ].
Journal of Experimental Botany, 2000, 51 (3) : 1005～1016
[ 13 ] 胡忠 ,杨军 ,郭光沁 ,等. 宁夏枸杞发根农杆菌转化系的建立及
影响转化因素的研究 [ J ]. 西北植物学报 , 2000, 20 ( 5 ) : 766
～771
[ 14 ] 李玲 ,谢文军 ,于树宏 ,等. 发根农杆菌对烯茉莉插条不定根发
生的影响 [ J ]. 华南师范大学学报 (自然科学版 ) , 2001 ( 3) : 23
～25
[ 15 ] 卜学贤 ,林忠平 ,陈维伦. 农杆菌对毛白杨的转化及完整转化植
株的获得 [ J ]. 植物学报 , 1991, 33 (3) : 206～213
[ 16 ] USPTO patent full text and image database [M ]. United States Pa2
tent, 1986: 4, 588, 693
592