全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"$#$#& #+#
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!!文章编号!$##$($)*+""#$%##$(##&(#-
构树 K$$L反应体系的优化与建立
廖声熙$! 崔!凯$!! 张!鹏$""! 王海英$! 崔永忠$! 袁首乾$""
"$,中国林业科学研究院资源昆虫研究所!云南 昆明!&-#"")% ",西南林业大学资源学院!云南 昆明!&-#"")#
收稿日期$ "#$"(#+($#
基金项目$ 国家自然科学基金(西南干热河谷野生构树种质评价与分子鉴定研究"%#*"%+%#)%中央级公益性科研院所基本科研业务
费专项资金"=.=.2
!
通讯作者$](K3DP$A3GAED:3Dh$&%VAFKV
摘要!利用正交试验对O3X酶浓度&引物浓度&J/O7?浓度&56"f浓度和模板b/<浓度 - 个因素进行优化!从而建立
了一套适宜构树的.;;=(72=反应体系 在 "#
)
Z的反应体系中!各反应物的最适宜含量为$#,# i-
)
Z
U$
O3X
b/<聚合酶&#,%-
)
KFP-Z
U$
.;;=引物&#,% KKFP-ZU$J/O7?!",# KKFP-ZU$56"f&$," C6-
)
Z
U$模板b/< 72=
扩增程序为$*) ^预变性 - KDC!*) ^变性 %# ?!)& ^退火 )- ?!" ^延伸 " KDC!)# 个循环
关键词!构树%.;;=%72=反应体系%正交试验优化
中图分类号!;$+V)& 文献标识码!<
G:%792/:+J,*%7*\6%/J/R7%/)*)4K$$LL,71%/)*$(:%,J)4
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构树"T#"2%"4$&0( G(G?#0K$#( ZV#为桑科"5F@3(
A>3>#落叶乔木!俗称谷树或壳树!我国构树资源丰
富!广泛分布于西北&华北&华南&东南和华南地区!
在中亚至印度&缅甸&老挝&泰国&马来西亚&越南&朝
鲜&日本也有分布 其树皮为制布&造纸的长纤维优
质原料!其叶可为饲料!构树的叶&枝&皮&根皮&果实
和乳液有重要的药用价值*$ U%+ %同时!由于构树的抗
逆性极强!故其在厂矿中常被利用为绿化抗污树种
进行栽植*)+
构树资源在中国分布广泛!对于一些天然分布
的构树群体!人们对其遗传背景知之甚少!这严重限
制了它的推广应用%因此!如何提高构树的资源利用
率!挖掘有价值的种质资源材料已成为当今构树发
展亟待解决的重要问题 简单序列重复区间"DC9>@(
第 $ 期 廖声熙等$构树.;;=反应体系的优化与建立
?DKQP>?>XE>CA>@>Q>39.;;=#标记是于 $**) 年创建
的一种基于微卫星"?DKQP>?>XE>CA>@>Q>39;;=#序
列发展起来的*-+ &利用 72=扩增进行检测的&十分
有效的分子标记!该种分子标记的优点是$在基因组
上!只有与锚定的核苷酸匹配的那些位点才能被靶
定!从而导致位于反向排列的间隔不太大的重复序
列间的基因组节段得到扩增!避免了引物在基因组
上的滑动!可以提高72=扩增反应的专一性 该技
术克服了=HZ7技术费用昂贵和采用同位素标记的
局限性!以及=<7b的假阳性!可以有效地应用于基
因多态性分析!是目前广泛应用的一种新型基因标
记*& U+ .;;=是基于72=的一种分子标记技术!其
扩增结果容易受 56"f&引物&J/O7?&O3X b/<聚合
酶&模板 b/<等浓度的影响 为了获得稳定可靠的
试验结果!减少实验的盲目性!需要对这些因素进行
优化 因此!本研究采用正交试验设计对以上 - 个
因素进行筛选!初步建立了一套适用于构树的 .;;=
反应体系!为构树的种质创新与分子辅助育种奠定
良好的基础
$!材料与方法
=V=>实验材料
样本来源及样本采集方式$构树叶片采集于云
南省红河州石屏县的天然群体""%[%*\$$j/!$#"[
%\$-j]#!共采集样本 %# 份 由于构树为风媒植
物!为保证样本的代表性!故采集样本的间隔距离大
于 -# K 构树嫩叶 b/<含量较高!但色素含量较
多!杂质较多!影响琼脂糖凝胶电泳效果%而老叶
b/<含量低!不易抽提基因组 b/< 因此!需采集
大小合适!色素含量较少的较成熟叶片进行试验
采集鲜叶片过后!使用无水变色硅胶装袋!干燥 $ 个
月左右再取用 72=反应所用 O3X 酶&$# aLEG>@&
J/O7等药品来源于天根生化科技"北京#有限公
司!.;;=引物由上海生工合成!实验中所用的 72=
仪为LDF=
胶成像系统为8>C>2FKQ3CIZDK9>J公司的8$ L` r
N=
=V?>基因组总Q-8提取
参照 b>P3QF@93等*++的方法!有改动!用 2O
d",#0
2O
O@D?2P"QN值 +,##&"# KKFP-
Z
U$
]bO<"QN值 +V##&$,) KFP-ZU/32P#中加入
-
U巯基乙醇!使其终体积分数达 "0!将经无水硅胶
干燥处理过的叶片!取出 #,#) 6!倒入已用无水乙醇
消毒过的研钵中!研钵中应先加入 #,#% 67p7!以去
除色素 迅速倒入液氮把叶片磨成细粉末后!加入
双蒸水 $ KZ!迅速转入到 " KZ离心管中!摇匀!使
用离心机 $# ### @-KDCU$离心 $# KDC!以洗去色素!
将水倒掉后!用搅拌的方法将沉淀打散!再马上加入
$ KZ的2O
$# KDC%用等体积的氯仿s异戊醇"")s$#抽提裂解
液!颠倒 - KDC使之充分混合!放置于 ) ^!$# ### @
-KDC
U$离心 $# KDC!取上相%再加入等体积的氯
仿s异戊醇"")s$#抽提裂解液!颠倒 - KDC 使之充分
混合!于 ) ^!$# ### @-KDCU$离心 $# KDC!取上相%
加入 " 倍体积的异丙醇!充分混匀!于 ) ^!$# ### @
-KDC
U$离心 $# KDC%用 #0乙醇洗涤沉淀 " 次!用
$##0乙醇洗涤沉淀 $ 次!于 ) ^!+ ### @-KDCU$离
心 - KDC!去上清!晾干沉淀%加入 -
)
Z的O]"QN值
+,##溶解沉淀!于U"# ^保存 b/<浓度和纯度用
紫外分光光度计测定
=VA>50L正交试验设计
采用正交设计 Z
$&
")
-
#
**+
!针对 .;;=(72=反应
体系中的 - 个因素"包括引物&J/O7?&O3X酶&56"f&
模板b/<#分别安排 ) 个水平进行筛选"表 $#!设计
方案见表 "!以构树基因组b/<为模板!引物采用加
拿大英属哥伦比亚大学报道的 "8O#
&
22 正交表
中的每个处理各 % 次重复
表 =>正交试验因素水平
因素
水平
$ " % )
引物_"
)
KFP-Z
U$
#
#V$- #V"- #V%- #V)-
J/O7?_"KKFP-Z
U$
#
#V$- #V"# #V"- #V%#
O3X酶_"i-
)
Z
U$
#
#V#- #V# #V#* #V$$
56
" f
_"KKFP-Z
U$
#
$V- "V# "V- %V#
模板b/<_"C6-
)
Z
U$
#
$V" "V) )V+ *V&
=VD>50L扩增$电泳以及凝胶成像
72=预扩增的程序设置为$*) ^ - KDC!*) ^
%# ?!)&V# ^ )- ?!" ^ " KDC!)# 个循环 扩增完
成后 ) ^保存 将72=扩增产物在用 $ aOL]配制
的 $V-0的琼脂糖凝胶中电泳分离 在 +# p的恒流
下电泳 *# KDC 电泳结束后把凝胶置于 ]L溶液中
$# KDC!最后在凝胶成像系统中观察记录扩增产物
的泳带!并保存图像
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
表 ?>K$$L!50L反应正交试验设计 I
="
"D
E
#
处理
引物_
"
)
KFP-
Z
U$
#
J/O7?_
"KKFP-
Z
U$
#
O3X酶_
"i-
)
Z
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#
56
"f
_
"KKFP-
Z
U$
#
模板b/<_
"C6-
)
Z
U$
#
$ #V$- #V$- #V#- $V- $V"
" #V$- #V"# #V# "V# "V)
% #V$- #V"- #V#* "V- )V+
) #V$- #V%# #V$$ %V# *V&
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$# #V%- #V"# #V$$ "V- $V"
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$) #V)- #V"# #V#* $V- *V&
$- #V)- #V"- #V# %V# $V"
$& #V)- #V%# #V#- "V- "V)
=VE>退火温度的优化
依据正交设计的结果!筛选出最优的反应体系!
然后在此基础上对退火温度进行梯度试验!设置
)&,#&)&,-&),-&)+,#&)+,-&)*,#&)*,- ^ 个温度
梯度 每个梯度进行 % 次重复 循环次数依据之前
的经验!设定在 )# 次
"!结果与分析
?@=>50L正交试验直观分析
参照何正文等*$#+和桂腾琴等*$$+的方法!依据
胶图条带的强弱和杂带的多少对 72=扩增结果依
次打分 对数量多&清晰的条带满分定为 $# 分!最
低分定为 $ 分 根据打分情况求出每个因素同一水
平下的试验值之和 Z0以及每一因素水平下的数据
平均值P0!并求出同一因素不同水平间平均值的极
差"表 %# 极差反映了各个因素对反应体系的
影响!极差越大!表明其对体系的影响越大 由表 %
可知$各因素不同水平的变化对构树 72=反应的影
响从大到小依次为$ 引物&56"f&O3X 酶&J/O7?和模
板b/<的浓度变化 P0值反映了每个因素不同水
平对反应体系的影响程度!该值越大标志这个水平
在该因素中最好 从而可以看出!引物的第三水平&
J/O7?的第四水平&O3X 酶的第二水平&56"f的第二
水平&模板 b/<的第一水平是各个因素中的最佳
水平
表 A>正交设计直观分析
处理
均值
引物_
"
)
KFP-
Z
U$
#
J/O7?_
"KKFP-
Z
U$
#
O3X酶_
"i-
)
Z
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#
56
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Z
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P% $"F) $#F) )F% %F- F$
P) &F% $"F %F$ )F$ &F"
*V$ )V% &V) +V$ "V"
表 D>正交设计方差分析
变异来源 平方和"//# 自由度"7!# 方差"N/# !值
引物 +$V#" % "V##
$)V#&
!!
J/O7? "V)+ % *V$&
)V
!
O3X酶 %-V& % $$V*"
&V"$
!!
56
"f
)V#* % $-V#
+V$+
!!
模板b/< "V)- % #V+" #V)%
误差 -V- % $V*"
总计 $**V-- $-
!!注$
!
表示在 #,#- 水平差异显著%
!!
表示在 #,#$ 水平差异极
显著 !
#,#-
"%!$-# d%,"*%!
#,#$
"%!$-# d-,)"
?V?>50L正交试验的方差分析
进一步对各个因素进行方差分析"表 )#!发现
引物&O3X酶和56"f % 个因素对反应体系的影响达
到极显著水平"@e#,#$#!J/O7?对反应体系的影
响达到显著水平"@e#,#-#!而模板 b/<对体系影
响不显著
?VA>E 个因素对50L反应体系的影响
从图 $< ]可以看出$引物浓度范围从 #,$-
#,)-
)
KFP-Z
U$时!扩增片段数呈单峰曲线变化!
浓度为 #,%-
)
KFP-Z
U$时!扩增片段数达到最多%
J/O7?的浓度设置在 #,$- #,%# KKFP-ZU$时!扩
增片段数呈上升趋势!浓度为 #,%# KKFP-ZU$时!扩
增片段数达到 %+ 条%O3X酶浓度为 #,#- #,$$ i-
)
Z
U$时!扩增片段数也呈现单峰曲线变化!峰值出
现在 #,# i-
)
Z
U$
%56
"f的 ) 个浓度梯度变化趋势
同O3X酶相似!其中 ",## KKFP-ZU$的效果最佳%当
模板b/<浓度设在 $," *,& C6-
)
Z
U$时!扩增条
带数随着模板浓度的升高而降低 另外!通过温度
梯度筛选!笔者发现退火温度设定在 )+,- ^时!扩
增的条带较多!而且背景比较清晰 采用优化好的
体系对红河群体 $" 个个体进行了尝试!发现效果较
好"图 "#
+
第 $ 期 廖声熙等$构树.;;=反应体系的优化与建立
图 $!不同因素水平对.;;=(72=的影响
图 "!优化体系对构树样品的扩增结果"以红河群体为例#
%!结论与讨论
引物浓度会对72=的条带数&带型产生明显的
影响!浓度过低不能扩增!浓度太高产生新的位点!
且形成引物二聚体几率增大*$"+ !同时对背景有一定
的影响*$% + 本研究中对引物浓度设置了 #,$-
#,)-
)
KFP-Z
U$
) 个浓度梯度!发现浓度为 #,%-
)
KFP-Z
U$时!扩增片段数达到最多 56"f和 J/O7?
浓度不仅影响 O3X 酶的活性!还在反应液中相互制
约!且与反应液中的模板 b/<及引物结合!影响引
物与模板的结合效率&模板与 72=产物的解链温度
以及产物的特异性和引物二聚体的形成*$) U$&+
56
"f设置为 $,- %,# KKFP-ZU$) 个浓度梯度时!
扩增片段数呈单峰曲线变化趋势!",# KKFP-ZU$浓
度为最适宜 本研究中对 J/O7?设置的 ) 个浓度梯
度当中!随着浓度增高!扩增片段数呈增加趋势
72=是 b/<的体外扩增!是通过 b/<聚合酶的催
化反应来完成!O3X 酶的浓度变化是 72=反应中的
关键因素!酶用量过高不仅增加成本!还会造成非特
异扩增!过低则会降低产物结合效率*$% + 本研究针
对O3X酶从 #,#- #,$$ i-
)
Z
U$设置了 ) 个浓度
梯度!当浓度为 #,# i-
)
Z
U$时扩增效果最好!然
后随着浓度增加扩增片段数反而下降 以上研究为
下一步构树遗传多样性分析奠定了基础
.;;=标记技术采用的是简单重复序列为引物!
通过72=扩增获得实验结果!因此!保证其扩增的
重复性非常重要!本实验采用的引物"8O#
&
22是通
过前期预实验大量筛选而确定的!对不同的处理采
用 % 个重复!重复性比较好 在前人的报道中!发现
不同物种模板 b/<浓度对体系的影响程度不同
如王瑜等*$+对紫花苜蓿"N$60)(5"%(&0E( ZV#.;;=(
72=反应体系优化过程中发现!体系对于模板浓度
非常敏感%而桂腾琴等*$$+ 对果梅 "@#242%L2L$
;D>SV>9mEAAV#!以及周凌瑜等*$%+对小苍兰"!#$$%0(
#$K#()&( 4P39V#的 .;;=(72=体系优化中发现!模板
浓度对反应体系影响不显著!这和本研究得出的结
论一致 另外!本研究是在"8O#
&
22这一条引物基
础上对整个体系进行优化!随后在后期实验中会进
一步扩大引物筛选范围!以增加该反应体系的通用
性 基于笔者之前实验操作中的经验!除了退火温
度!不同引物的最优扩增条件基本相似%因此!选用
其他引物时!应重点考虑筛选退火温度
*
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