全 文 ：　　* 本文为国家自然科学基金项目( 1996～1998年)“反义 ACC 合成酶和 ACC 氧化酶基因对杨树生长发育的影响”(编
号 39500119)的部分成果。王贵禧副研究员在乙烯释放量测定过程中提供了实验条件和热情的指导,特致谢意。
1998-08-18收稿。
ACC氧化酶 cDNA 克隆及其对美洲黑杨
体内乙烯产生的反义抑制*
李明亮1)　韩一凡1)　李　玲1)　田颖川2)　李　凝3)　王世绩 1)
( 1)中国林业科学研究院林业研究所, 100091,北京; 2)中国科学院微生物研究所, 100080,北京;
3)香港科技大学生物学系,香港;第一作者 41岁,男,副教授)
　　摘要　利用 RT-PCR技术克隆了番茄 ACC 氧化酶基因 LEET HYBR 编码区 0. 9 kb 的 cDNA
片段, 经酶切图谱分析和序列分析鉴定后, 反向插入到植物表达载体 pBin438中, 构建了表达 ACC
氧化酶反义 RNA 的二元载体。用农杆菌侵染美洲黑杨叶片,在含卡那霉素的M S 培养基上选择转
化子和植株再生, 通过 PCR 检测筛选到 16株转基因杨树植株, Southern blot 分析初步确证了外源
基因是以单拷贝插入到杨树基因组中; 对杨树幼苗乙烯释放量的测定结果表明转基因杨树的乙烯
释放量为对照植株的 28%。
关键词　ACC( 1-aminocyclopr opane-1-carboxylate)氧化酶; 基因; 反义 RNA; 美洲黑杨
分类号　S718. 43
　　乙烯是 5大类植物激素之一,在植物的成熟、衰老和器官脱落过程中起着十分重要的调节
作用[ 1～5]。80年代初 Yang 等[ 6]阐明了乙烯生物合成途径,认为催化 SAM ( S-腺苷-L-蛋氨酸)
向 ACC 转化的 ACC 合成酶和催化 ACC 氧化生成乙烯的 ACC 氧化酶是植物体内乙烯合成
的 2个关键酶。至今已有许多学者从不同植物中克隆得到了ACC 氧化酶 cDNA [ 7～10]。由于乙
烯对植物的成熟、衰老和器官的脱落有重要的调节作用, 因而通过控制乙烯合成或其信号传递
途径来延缓植物衰老、果实成熟和器官脱落,这一直是植物生理学家的研究课题之一。近年来
发展起来的反义 RNA 技术给这项研究带来了希望。耐贮藏转反义基因番茄植株的培育成
功[ 11 ] ,标志着利用反义 RNA 技术控制乙烯的生物合成是一条切实可行而且快速有效的育种
途径。在国内, 也有将ACC 合酶反义基因导入番茄获得了转基因植株并成功地抑制了番茄果
实成熟的报道[ 12]。但迄今为止,尚未见到转 ACC氧化酶反义基因木本植物以及对其生长发育
影响的报道。杨树是我国的主要造林树种之一,具有早期速生、实用性强、分布广、容易改良遗
传性和容易进行无性繁殖, 适用于集约栽培,并且基因组较小, 是研究树木生理和利用基因工
程方法进行遗传性状改良的理想的木本模式植物 [ 13, 14]。作者根据 Holdsw o rth 等 [ 15]报道的
ACC氧化酶基因序列,利用 RT -PCR技术克隆了 1个番茄ACC氧化酶基因,并通过农杆菌途
径转化美洲黑杨外植体获得了表达 ACC氧化酶反义 RNA 的转基因植株, 进而获得了抑制乙
林业科学研究　1999, 12( 3) : 223～228
For est R esear ch 　　 　　
烯生物合成的转反义基因杨树。
1　材料与方法
1. 1　材料
美洲黑杨( Populus del toides Bart r. )组培苗来自中国林业科学研究院林业研究所分子遗
传实验室。T -载体 pGEM○R-T 为 Promega 公司产品。pBin438由中国科学院微生物研究所田
颖川研究员提供。限制性内切酶及各种修饰酶为 Parkin Elma、Promega、Boehringer
M annheim 公司的产品。cDNA 合成试剂盒、随机引物 DNA、标记试剂盒购自 Boehringer
M annheim 公司。T 7 DNA Sequencing Kit 购自 Pharmacia 公司。Taq DNA 聚合酶购自上海
生物工程公司。同位素
-35S-dAT P、
-32P-dCT P 为美国 NET 公司的产品。Zeta-pr obe 杂交膜
购自 Bio-Rad公司。无 RNase 的 DNase 购自 Promega 公司。所用引物系根据 Holdsw or th
等[ 15 ]已报道的 ACC 氧化酶基因序列在基因的 5′和 3′区分别设计 2个特异引物, 它们分别是:
正链引物 ACO 1( P 1) : 5′—TACT CT AGAATGGATAT CTT CCCAAT TA TCAACTT GG;
负链引物 ACO 2( P 2) : 5′—ACT GGAT CCAGCACTT GCAATT TGAT CAA CT AAT TC。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　ACC 氧化酶 cDNA 的克隆　用伤害和外源乙烯(王贵禧副研究员提供)处理番茄
( Ly cop ersicon esculentum L. )果实, 参照 Sambrook 等方法[ 1 6]从番茄果实心皮组织中提取总
RNA ,根据 cDNA 合成试剂盒推荐的条件在 20
L 反应体系中合成 cDNA 第 1条链,从中取
2
L 加到 50
L PCR 反应体系中以 P1和 P 2为引物进行扩增,反应条件为: ( 1) 94 ℃预变性 3
min; ( 2) 94 ℃变性 30 s, 60 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min,共进行 30个循环; ( 3) 72 ℃补平 5
min。PCR产物经 0. 8%琼脂糖凝胶电泳、回收片段后,直接连到 T -载体 pGEM○R-T 上获得
pGACO,然后对 pGACO 进行酶谱分析,再用双脱氧法测定所克隆的 DNA 序列。
1. 2. 2　表达 ACC 氧化酶反义RNA 的二元载体的构建　将 pGACO 用 BamH1和 XbaI完全
酶切,电泳后回收 0. 9 kb的片段,然后与用 BamH1和XbaI 酶切的 pBin438连接,获得反向插
入质粒 pBin438 的 pBACO 后转化大肠杆菌 ( Escherichia coli ( M igula ) Castellani and
Chalmer s) DH5
, 得到 pBACO 克隆。转化土壤农杆菌( A grobacter ium sp. ) LBA4404获得了
pBACO的农杆菌转化子 pBACO/ LBA 4404。
1. 2. 3　美洲黑杨的转化和植株的再生　采用叶盘法将 pBACO/ LBA 4404 转化美洲黑杨叶
片,在含卡那霉素的 MS 培养基上选择转化子并培养再生植株 [ 17]。
1. 2. 4　转反义基因杨树植株的 PCR 检测及 Southern blot 分析　PCR 检测:用 CT AB法 [ 18]
提取再生美洲黑杨植株叶片 DNA, 并以此为模板( 100 ng DNA )在 20
L 反应体系中进行
PCR反应; Southern blot 分析: 10
g 美洲黑杨叶片 DNA 经酶切后在 0. 8%琼脂糖凝胶上电
泳分离, 用 Hybaid公司的真空转膜装置将 DNA 转到 Zeta-probe 膜上, 然后与
-32P 标记的
ACO基因探针( 0. 9 kb) 65℃杂交过夜。
1. 2. 5　ACC 氧化酶反义 RNA 表达的检测　用化铯密度梯度离心法提取转基因美洲黑杨植
株叶片总 RNA,经无 RNase 的 DNase 处理除去 DNA, 按 Gibco BRL 公司 SuperScript TM
cDNA 合成试剂盒推荐的条件以 P 1为引物,在 20
L 反应体系中合成 cDNA 第 1条链, 经
RNase H 处理后取 2
L 在 50
L 反应体系中以 P 1和 P 2为引物进行 PCR 扩增,反应条件同
224 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　第 12卷
方法 1. 2. 1节所述。RT-PCR 产物经琼脂糖电泳、染色后观察结果。
1. 2. 6　转反义基因美洲黑杨乙烯释放量的测定　各取 5 g 美洲黑杨幼苗地上部放入三角烧
瓶中,以橡皮塞密封瓶口,置于 25 ℃下培育 2 d后用注射器从瓶内取 1 mL 气体注入 103型气
相色谱仪(上海分析仪器厂) ,检测乙烯含量并与标准乙烯对比计算其幼苗的乙烯释放量, 以

L·g- 1·h- 1表示。
2　结果与分析
2. 1　ACC氧化酶 cDNA的鉴定
按方法 1. 2. 1节中所述合成了番茄的 cDNA ,以此 cDNA 为模板用上述ACC 氧化酶基因
特异引物( P1 和 P2 )通过 PCR 扩增得到了 0. 9 kb 左右的 DNA 片段, 将此片段插入 T -载体
pGEM
○R-T 获得了重组质粒 pGACO(图 1)。经 DNA 序列分析读出的该 DNA 片段全序列与
Holdsw orth 等[ 15]发表的序列相应部分完全一致(资料略)。
图 1　ACC氧化酶基因的克隆及其反义基因
植物表达载体 pBACO 的构建
2. 2　pBACO植物表达载体的鉴定
用 BamH1 和 XbaI 完全酶切 pGACO 分离到
0. 9 kb 的ACO 片段后与经BamH1 和XbaI 完全酶
切的二元载体 pBin438连接,即得到表达 ACC 氧化
酶反义 RNA 的二元载体 pBACO, 用 HindIII 和
BamH1 酶切 pBACO 质粒, 得到了预期的片段, 证
明 ACC 氧化酶基因已插入到二元载体 pBin438中,
并且与 35S 启动子的方向是相反的。将 pBACO 质
粒转化农杆菌 LBA4404 获得了 pBACO 的农杆菌
转化子 pBACO/ LBA4404, 再提取 pBACO 质粒经
酶切后在琼脂糖凝胶上电泳, 确证该质粒正确无误。
2. 3　ACC氧化酶反义基因转基因杨树植株的鉴定
通过农杆菌介导转化美洲黑杨叶片获得再生植
株后,利用 PCR快速检测获得 16株有外源ACC 氧
化酶反义基因插入的转基因植株。而对照植株未扩
增出任何片段(图 2)。初步证明这些植株中有外源
ACC 氧化酶反义基因插入;为了最终证实 ACC 氧
化酶反义基因在杨树基因组 DNA 中的整合, 对植
株的基因组 DNA 进行了 Southern blot 分析,结果
(图3)表明转基因植株DNA的 HindIII 酶切产物与
ACC 氧化酶基因探针可产生 4. 5 kb和 5. 5 kb 的 2
条杂交带,而非转基因植株只有 1条5. 5 kb的杂交带出现。说明 4. 5 kb这条杂交带为插入的
外源A CC 氧化酶反义基因片段。这一结果不但说明外源 ACC 氧化酶反义基因已整合到杨树
基因组 DNA 中,而且初步表明只有 1个拷贝的插入。
2. 4　ACC氧化酶反义 RNA在转基因杨树植株中的表达
为了证实 ACC 氧化酶反义基因在转基因杨树中的转录, 对转基因植株的 RNA 进行了
225第 3 期　　　李明亮等: ACC 氧化酶 cDNA 克隆及其对美洲黑杨体内乙烯产生的反义抑制
图 2　部分转化再生杨树植株 PCR检测电泳图谱
图 3　转 ACC氧化酶反义基因杨树植株的 S outhern blot
分析
图 4　转基因杨树叶片总 RNA 的RT -PCR分析
RT -PCR分析。引物 P1是外源 ACC氧化酶反
义基因的负链引物,只有 ACC 氧化酶反义基
因转录产生的负链 RNA 才可以与之结合, 经
反转录产生负链 cDNA。由此可以排除内源和
外源 ACC氧化酶 mRNA 的干扰, 确证其反义
RNA 在转基因杨树中的表达。RT -PCR 结果
(图 4)证实了这一点, 即只有转基因杨树的反
义RNA 才能经RT -PCR扩增出预期的0. 9 kb
基因片段,对照植株则不能,说明对照植株中不
存在这种反义 RNA。
图 5　转ACC 氧化酶反义基因杨树乙烯的释放水平
RNA 样品均经无 RNase 的 DNase 处理
除去了可能存在的 DNA 污染; 未加反转录酶
的 RT-PCR 的分析结果(图 4) , 证明 RNA 样
品中没有DNA 污染。
2. 5　ACC氧化酶反义基因对美洲黑杨体内乙
烯产生的抑制作用
对美洲黑杨地上部进行的乙烯测定结果表
明,转基因植株乙烯生产量仅为非转基因植株
的 28%。经 500 mg·kg - 1乙烯利和伤害处理
2 d后转基因植株的乙烯释放量也仅为非转基
因植株的 30% (图 5)。这些结果表明转基因杨
树体内乙烯的产生受到 ACC 氧化酶反义基因
转录物的明显抑制。
226 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　第 12卷
3　结论与讨论
　　本研究利用 RT -PCR克隆了番茄 ACC 氧化酶基因0. 9 kb的 DNA片段, 构建了ACC 氧
化酶反义基因植物表达载体,首次将该反义基因转化美洲黑杨获得了转基因植株。对转反义基
因杨树植株进行 Southern blot 分析初步证明该基因是以单拷贝插入杨树基因组中。对反义
RNA 和内源乙烯释放量的分析结果表明: ACC 氧化酶反义基因不仅在美洲黑杨中能够表达
相应的反义 RNA ,而且能够抑制美洲黑杨内源乙烯的释放。用外源乙烯处理植株也不能解除
这种反义抑制作用。这些实验结果与 John等 [ 19]在番茄中的实验结果完全一致。这可能是由于
ACC氧化酶反义 RNA 的表达抑制了 ACC 氧化酶 mRNA 的正常转录, 进而抑制了其蛋白质
的合成。由于 ACC氧化酶是乙烯生物合成过程中的 2个关键酶之一,其蛋白质的合成受到抑
制,因此转反义基因杨树植株的乙烯释放量降低。关于 ACC 氧化酶反义RNA 抑制 ACC氧化
酶 mRNA 正常转录的详细机理尚待进一步研究。
参　考　文　献
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in Transgenic Populus deltoides
L i Mingliang
1)　H an Yif an1)　 L i L ing 1)
T ian Yingchuan
2)　L i N ing3)　 Wang Shij i 1)
( 1 ) The Research Inst itute of Fores try , CAF, 100091, Beijing , China; 2) T he In st itute of M icrobiology,
T he Ch ines e Academy of Sciences, 100080, Beijing, Chin a; 3) Th e Depar tm ent of Biology, H on g Kong
University of Science an d T echnology, Hong Kong, Ch ina)
　　Abstract　A 0. 9 kb fragment o f ACC ox idase cDNA fragment prepared f rom total
tomato RNA was amplified by polymerase chain react ion ( PCR) and cloned into pGEM
○R-T
vector . T he cloned A CC ox idase gene was further inserted into a binar y vector , pBin438, in an
inverted orientat ion betw een the CaMV 35S pr omoter and Nos 3′termination sequence
( pBACO ) . Transgenic poplar plants w ere obtained by regenerat ion o f agr obacterium-
mediated t ransformed leaves. PCR and Southern blot analy ses conf irmed the integ rat ion of a
single ant isense ACC ox idase gene in t ransfo rmed poplar g enome. The results from RT -PCR
of RNAs isolated f rom transgenic poplar leaves confirmed that the ant isense RNA o f A CC
ox idase presented in these t ransgenic plants. T he amount of ethylene released fr om
transgenic poplars w as reduced signif icant ly to about 28% o f that released f rom non-
transfo rmed controls.
　　Key words　ACC ( 1-aminocyclopropane-1-carboxylate) ox idase; gene; antisense RNA;
Pop ulus del toides
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