全 文 ：第
卷 第
期



 年
月
林 业 科 学 研 究






























黄竹细胞悬浮培养和原生质体分离

阀国宁 诸葛强
摘要 以牡竹属黄竹

”






“
川
拼


  ‘



的竹节及无菌苗根颈为外植
体 , 培养于含有





,
一
、








和







的

培养基上诱导愈伤组织 , 然
后移至相同成份或不同浓度
,
一
的液体培养基中
进行悬浮培养 , 以建立分散性良好的悬浮细
胞系 。 利用悬浮细胞和无菌苗叶片经酶解获大量原生质体 , 其产量分别约为 每克鲜重





个
和



“个 , 活力均可达


。
关键词 黄竹 、 细胞悬浮培养 、 原生质体分离
竹类植物 以其种类繁多、 用途广泛而著称于世 。然而由于其开花难以预测和生长周期长 ,
甚至开花结实伴随着竹林的灭亡 , 为此给遗传改良工作带来了极大困难。 近年来 , 竹类组织
培养繁殖研究 已取得很大进展〔’一幻 , 许多竹种成功地从愈伤组织分化成再生植株 。 同时某些
竹种还进行细胞与原生质体分离培养研究, 也取得了显著的进展
’ , 这些都显示了生物技术
在开辟竹类植物遗传改 良新途径方面的巨大潜力 , 具有广阔的应用前景 。







年 , 以丛生竹中的优良纸浆竹种为材料 , 研究其细胞悬浮培养及原生质体分
离方法 , 以期为今后深入研究打下良好基础 。

材料与方法

。
外 植体 的制备
本试验以栽培于我所温室牡竹属黄竹刀









二



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为主要材料 ,
取其长约








含竹节的幼嫩茎段及试管培养的无菌苗的根颈切段为材料进行培 养以
诱导愈伤组织 。 用悬浮细胞及无菌苗叶片分离原生质体 。

。
方法





细胞悬浮培养 外植体经组培常规方法消毒后 , 培养于附加





,
一
、







 及






 的


,固体培养基上以诱导愈伤组织, 然后将所诱导 的愈伤 组织
经选择分别培养于
,
一
浓度为。、
、
、



, 成份与诱导愈伤组织相同的液体培养基
中, 调节

至


, 置于转速为




的摇床上 , 暗培养于
 土
℃条件下 。 每

继 代
培养
次 。





原生 质体分离 选取经


个月培养 、 继代后生 长


的悬浮细胞 , 经离心

 一

一

收稿 。
圈国宁研究员 , 诸葛强
中国林 业科学研究院亚热带林业研究所 浙江富阳





。

浙江省自然科学墓金资助项 目。

期 阔国宁等
黄竹细胞悬浮培养和原生质体分离

沉降取沉淀细胞加酶液
或选取无菌苗叶片 , 用锐刀轻轻刮下表皮 , 贴浮于酶液上 。 酶解时
将酶解物置于摇床上







 ℃下暗酶解

, 经

目滤 网过滤 除 去大细胞团及
残渣 , 再经低速离心

 


,



收集原生质体供观察。





检测 细胞和原生质体数量用血球计数器法〔” , 原生质体活力用伊文思蓝法



 产






〕。

结果与分析



愈伤组织的诱导与生长
本试验采取竹节和无菌苗根颈切段
种材料 , 接种于含 有
,
一
的 固体 培 养基 上 ,
经
个月培养后 , 一般在竹节及竹根颈周围均出现肉眼可见的白色愈伤组织 , 其中竹节的愈

恕阔琳州骊黔倾书
伤组织诱导率达

一

, 而根颈则可达




。 就累计生长量而言 , 两者生长趋势基本一致

图

。 在培养初期
约


, 据观测 , 竹 节
愈伤组织生长量小于根颈
中期
约
 一


,
竹节愈伤组织生长速度逐渐快于根 颈
到 了 后 期

约
 一


, 后者的累计生长量逐渐超过了前
者。 经过


培养 , 以竹节为外植体平均愈伤组织
鲜重为
 ! 土



以无菌苗根颈为外植体平均
愈伤组织鲜重为


士



。 说明无菌 苗根 颈
具有更旺盛的生命力。 就愈伤组织结构而言 , 同样
可分为
种类型 , 第一类为深黄色 , 质地紧密 , 具
培养天救


图
不同原 始材料 竹愈伤 组织累计生长量
瘤状结构
第二类则为乳白色 , 质地疏松 , 继代培养后增殖速度较快 , 一般
种愈伤组织混
合而生。 细胞悬浮培养时 , 需精心挑选才能获得满 意的结果 。



瓜浮细胞的培养与增长
选取属于第二类的愈伤组织约

, 分别培养于含有


不同 浓 度
,
一
的 液 体 培
养基中 , 在摇床上经

暗培养后将培养物过

目滤网滤 去残渣 , 将单细胞及细 胞 团 按

,
稀释率 , 每巧
继代培养
次 , 直至达到稳定的悬浮细胞系的建立。 与一般草本植物
相 比 , 悬浮培养中的黄竹细胞增长较慢 , 就细胞数而言 , 通常在
 一

出现对数生长期 高
峰 , 其最终增殖率可达

 倍 。 黄竹愈伤组织经悬浮培养后 , 其分散性能 良好 , 多数呈单细
胞或


 个细胞聚集的小细胞团
少数为

 个细胞 以上的细胞团
就细胞形状而言 ,
大致可分为
类
图
一



类为近圆形细胞 , 此类胞细较小 , 长宽比例相近 , 细 胞 核
大 , 细胞质浓 , 具有很强的分裂能力 ,
类为长形细胞 , 细胞长宽比例大约


, 此类细
胞仍属正常分裂与生长的细胞

类为异形化细胞 , 这类细胞多数体积很大 、 形 状 极 不 规
则 , 有的细长弯曲 , 有的大小极不均衡 , 在悬浮培养初期游离于培养液中比例较高 , 随着继
代培养次数的增加 , 其比例逐渐减少 。
培养基中的
,
一
浓度对悬浮培养的竹细胞生长与增殖影响很大
图

, 其浓度一般
在。





范围内 , 细胞的增长有随着
, 选一
浓度的增加而增加的趋势 。 就总体而言 , 悬

期 阔国宁等
黄竹细胞悬浮培养和原生质体分离

沉降取沉淀细胞加酶液
或选取无菌苗叶片 , 用锐刀轻轻刮下表皮 , 贴浮于酶液上 。 酶解时
将酶解物置于摇床上







 ℃下暗酶解

, 经

目滤 网过滤 除 去大细胞团及
残渣 , 再经低速离心

 


,



收集原生质体供观察。





检测 细胞和原生质体数量用血球计数器法〔” , 原生质体活力用伊文思蓝法



 产






〕。

结果与分析



愈伤组织的诱导与生长
本试验采取竹节和无菌苗根颈切段
种材料 , 接种于含 有
,
一
的 固体 培 养基 上 ,
经
个月培养后 , 一般在竹节及竹根颈周围均出现肉眼可见的白色愈伤组织 , 其中竹节的愈

恕阔琳州骊黔倾书
伤组织诱导率达

一

, 而根颈则可达




。 就累计生长量而言 , 两者生长趋势基本一致

图

。 在培养初期
约


, 据观测 , 竹 节
愈伤组织生长量小于根颈
中期
约
 一


,
竹节愈伤组织生长速度逐渐快于根 颈
到 了 后 期

约
 一


, 后者的累计生长量逐渐超过了前
者。 经过


培养 , 以竹节为外植体平均愈伤组织
鲜重为
 ! 土



以无菌苗根颈为外植体平均
愈伤组织鲜重为


士



。 说明无菌 苗根 颈
具有更旺盛的生命力。 就愈伤组织结构而言 , 同样
可分为
种类型 , 第一类为深黄色 , 质地紧密 , 具
培养天救


图
不同原 始材料 竹愈伤 组织累计生长量
瘤状结构
第二类则为乳白色 , 质地疏松 , 继代培养后增殖速度较快 , 一般
种愈伤组织混
合而生。 细胞悬浮培养时 , 需精心挑选才能获得满 意的结果 。



瓜浮细胞的培养与增长
选取属于第二类的愈伤组织约

, 分别培养于含有


不同 浓 度
,
一
的 液 体 培
养基中 , 在摇床上经

暗培养后将培养物过

目滤网滤 去残渣 , 将单细胞及细 胞 团 按

,
稀释率 , 每巧
继代培养
次 , 直至达到稳定的悬浮细胞系的建立。 与一般草本植物
相 比 , 悬浮培养中的黄竹细胞增长较慢 , 就细胞数而言 , 通常在 30 一 45 d 出现对数生长期 高
峰 , 其最终增殖率可达 8 ~ 10 倍 。 黄竹愈伤组织经悬浮培养后 , 其分散性能 良好 , 多数呈单细
胞或 5 ~ 10 个细胞聚集的小细胞团. 少数为50 ~ 60 个细胞 以上的细胞团 ; 就细胞形状而言 ,
大致可分为 3 类 ( 图 2 一 A ) : I 类为近圆形细胞 , 此类胞细较小 , 长宽比例相近 , 细 胞 核
大 , 细胞质浓 , 具有很强的分裂能力 , I 类为长形细胞 , 细胞长宽比例大约 3 : 1 , 此类细
胞仍属正常分裂与生长的细胞; l 类为异形化细胞 , 这类细胞多数体积很大 、 形 状 极 不 规
则 , 有的细长弯曲 , 有的大小极不均衡 , 在悬浮培养初期游离于培养液中比例较高 , 随着继
代培养次数的增加 , 其比例逐渐减少 。
培养基中的2 , 4 一 D 浓度对悬浮培养的竹细胞生长与增殖影响很大 ( 图 3 ) , 其浓度一般
在。~ 9 m g / L 范围内 , 细胞的增长有随着2 , 选一 D 浓度的增加而增加的趋势 。 就总体而言 , 悬
期 阔国宁等: 黄竹细胞悬浮培养和原生质体分离 47
圆形 、 高活力的悬浮细胞 , 特别是 以无菌苗根颈诱导的愈伤组织建立的悬浮细胞系 , 经酶解
后获得的原生质体产量较高 、 活力较强 。 然而对于各类竹种 , 如何提高悬浮细胞的原生质体
的分离率仍有待进一步深入研究。
2
.
3
.
2 无菌苗叶 片 用锐刀轻刮新鲜 、 刚展叶的无菌苗叶片表面 , 将其切成1 m m 左右细条 ,
按 1 : 10 (牙/犷 ) 置于醉混合液中 , 经40 ~ 50 印m 摇床上 28 ℃暗培养16 ~ 20 h , 所得酶解液
经200 目过滤以及离心纯化后 , 原生质体产量约为每克鲜重 5 x 10 弓个 。黄竹叶片为等 面叶,
叶肉中无栅栏与海棉组织之分 ( 图 2 一 B ) 。 经酶解后多数从切 口 的细胞开始分离成密 集 的
原生质体 , 然后逐渐游离于酶解液中(图 2 一 C 、 D ) 。 一般叶片分离的原生质体产量较悬浮细
胞高 , 但大小不均 , 其活力经检测均达到80 % 以上 。 有关原生质体培养等方面的研究工作 ,
目前正在深入进行中 。
参 考 文 献
圈国宁 , 诸葛强. 竹子愈伤组织培养与植株再生 . 竹子研究汇刊 , 19 91 , l 0( 4 ) : 7 9 ~ 8 0 .
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