全 文 ：第 51 卷 第 10 期
2 0 1 5 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 10
Oct．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151013
收稿日期:2014 － 08 － 11; 修回日期:2014 － 10 － 14。
基金项目:北京市自然科学基金重点项目:转 4CL-STS 融合基因枣树积累白藜芦醇改良抗病性和品质(5111001)。
* 王有年为通讯作者。
农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化
壶瓶枣的研究*
罗在柒1，2，3 郭辉力1，2 杨亚东2 杨明峰2 马兰青2 王有年1，2
(1. 北京林业大学林学院 北京 100083; 2. 北京农学院 农业部都市农业(北方)重点实验室 北京 102206;
3. 贵州省林业科学研究院 贵阳 550005)
摘 要: 【目的】白藜芦醇作为植物次生代谢产物不但能提高果树抗真菌能力，还能改善果品质量。遗传转
化芪合酶基因能够增强植物的抗真菌能力，虎杖芪合酶基因具有较高的催化合成白藜芦醇的效率，研究虎杖
芪合酶基因遗传转化壶瓶枣，以期获得具有抗真菌能力且改善枣果实品质的遗传转化新材料。【方法】通过
组织培养再生体系与目的基因转化技术，优化获得茎诱导丛生芽，构建植物表达载体，优化遗传转化体系，采
用农杆菌介导法将虎杖白藜芦醇生物合成关键酶基因 PcPKS5 遗传转化壶瓶枣。【结果】优化壶瓶枣茎段诱
导得到高分化率的丛生芽遗传转化体系，再生增植率为 11. 0，为壶瓶枣成功实现遗传转化奠定了基础。将壶
瓶枣 0. 8 ～ 1. 0 cm 含茎尖和茎段的外植体材料置于农杆菌浓度 OD600 = 0. 6 时侵染菌液中浸泡 15. 0 min，然
后置于培养基上避光共培养 3 天 ;随后转入含 Cb 300 mg·L － 1，AS 60 mg·L － 1的丛生芽诱导分化培养基中培
养 5 ～ 6 周。将分化丛生芽转接至含 4. 0 mg·L － 1 Basta 的培养基中，获遗传转化植株 173 株 ;经 Basta 筛选，
GUS 显色、gDNA PCＲ、ＲT-PCＲ 等检测证实，成功获得 3 个阳性转基因株系，荧光实时定量检测表明株系 2 表
达效率较高。经植物化学成分分析，转化植株中目的基因得以表达，生成了目标产物白藜芦醇，其含量为
0. 45 μg·g － 1 (鲜质量)。【结论】本研究成功实现虎杖芪合酶基因遗传转化壶瓶枣，获得壶瓶枣遗传转化新
材料。且 PcPKS5 在枣树中异源表达，转基因材料中能够代谢合成白藜芦醇，有望提高转 PcPKS5 基因壶瓶枣
抗枣树病原真菌病能力。白藜芦醇是否在壶瓶枣遗传转化材料果实中积累，及转基因植株果实品质的影响
仍需深入研究。
关键词: 遗传转化;虎杖芪合酶基因;枣树;农杆菌介导法;白藜芦醇
中图分类号:S687 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2015)10 － 0101 － 09
Agrobacterium-Mediated Transformation of Ｒesveratrol Synthase
Gene (PcPKS5) into Huping Jujube (Zizyphus jujuba)
Luo Zaiqi1，2，3 Guo Huili1，2 Yang Yadong2 Yang Mingfeng2 Ma Lanqin2 Wang Younian2
(1 ． College of Forestry，Beijing Forestry University Beijing 100083; 2 ． Key Laboratory of Urban Agriculture (North)
of Ministry of Agriculture Beijing University of Agriculture Beijing 102206;
3 ． Guizhou Academy of Forestry Guiyang 550005)
Abstract: 【Objective】Huping jujube is widely cultivated in northern China． A resveratrol synthase ( STS) gene，
PcPKS5，contains all functionally divergent plant specific type III PKSs and is involved in resveratrol synthesis． The
resveratrol synthase genes are expressed in many transgenic crops such as rapeseed and wheat，successfully generating
transgenic plants that have enhanced anti-fungal functions． To allow resveratrol accumulation in fruit organs and improve
resistance of jujube to fungal pathogens，the PcPKS5 was transformed into Huping jujube under the control of the CaMV
35S promoter，and the obtained transgenic plants were tested if they increased resveratrol accumulation． This study aimed
to assess the effects of heterologous overexpression of the resveratrol synthase gene ( PcPKS5 ) in Huping jujube plant
resistance and nutritional quality． 【Method】 Stems with leaves and shoot tips of Huping jujube were infected with
林 业 科 学 51 卷
agrobacterium carrying PcPKS5 and GUS， and three positive plants were identified． 【Ｒesult】 The PcPKS5 gene
previously cloned from Polygonum cuspidatum in our laboratory was amplified in the TOP10 bacterial strain and ligated to
the pMD 18-T vector． Two primers were designed based on the gene bank sequence EU647245 and synthesized by Sangon
Biotech Shanghai Co． Ltd． to clone the STS gene for plant expression plasmid construction． Agrobacterium strain EHA105
harboring the pCAMBIA3301-121 plasmid with the PcPKS5 genes controlled by the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S
promoter and termination sequences was used as the vector system for transformation． The infection lasted 15 min，a high
percentage of GUS positive leaves was observed． The optimized conditions for transformation were 15 min infection and
2 days co-culture in the dark． The control bacterial concentration was OD600 0. 6 as well，and AS was added at 60 mg·L
－ 1 ．
Experimental result showed that a total of 197 plants regenerated from nearly 20 000 buds were obtained during the
glufosinate-ammonium resistance screening． However，only three actual resistant transgenic plants were finally acquired by
rescreening after rejuvenation． Thus the genetic transformation rate was 1. 52 % ． GUS staining was positive for these three
plants，indicating that the GUS gene was integrated into Huping jujube’s genome． Also，a band corresponding to the
PcPKS5 gene was detected from both genomic DNA and cDNA from the transgenic plants，further indicating that the
PcPKS5 gene had been integrated into the genome． Transgenic plants of line 2 were selected for further studies and
successfully produced resveratrol． Ｒesveratrol showed an elution time of 16. 92 min in HPLC analysis，which was used to
identify the presence of resveratrol in transgenic plants． The resveratrol content was calculated to be 0. 45 μg·g － 1 fresh
plant material，using standard curve analysis of the peak at 16. 92 min，according to Y = 67 354X + 62 755 ( Ｒ2 =
0. 999 8) ． The m / z value of the compound collected by HPLC for this peak was 228. 9 as determined by LCMS． This is
in complete agreement with the m / z of the resveratrol reference standard． These findings demonstrated that the product
isolated from the transgenic plants was resveratrol．【Conclusion】Here，we successfully transformed the STS gene PcPKS5，
which was cloned from Polygonum cuspidatum，into Huping jujube． With a constitutive promoter，transgenic Huping
jujube plants produced resveratrol． It is noteworthy that resveratrol production was relatively low in transgenic Huping
jujube compared with other plants． One possible reason for this is that resveratrol may exist in other forms in the transgenic
plants，e． g． resveratrol glucoside． New metabolic pathways have the potential to affect disease resistance． Therefore，the
metabolic pathway of resveratrol derserves for further study． Although it takes long to obtain fruits from the transgenic
Huping jujube plants，we finally obtained a new germplasm with insect and fungal resistance，establishing a new jujube
variety． This study provides a basis for improving the quality of the jujube and adjusting resveratrol levels in the fruit．
Key words: genetic transformation system; resveratrol synthase gene (PcPKS5) from Polygonum cuspidatum; Zizyphus
jujuba; agrobacterium mediated transformation; resveratrol
枣 ( Ziziphus jujuba) 为鼠李科枣属植物 (刘孟
军，1999)，是中国最古老的果树之一，有 3 000 多
年的栽培历史。枣树具有抗逆性强、早果速丰、经济
效益和生态效益显著等特点，在我国广泛栽培，是我
国主要经济林树种之一，栽培面积 (133. 3 万 hm2 )
和年产量(246. 3 万 t)均占世界的 95% 以上，在全
球枣产品国际贸易市场中占据绝对主导地位(国家
林业局，2007)。随着枣树种植面积不断增加，枣树
栽培管理方式由粗放经营向密植集约化方向转变。
但近 10 年来，我国枣树病害面积不断增加，果实病
害危害程度逐年加重，严重制约了枣果实产量、品质
和商品价值。
20 世纪 70 年代末以来，相继报道了枣炭疽病
(Alternaria alternate)、枣铁皮病( A． alternate)、枣黑
斑病 ( Isariopsis imdica var． ziziphi)、枣轮纹病 ( A．
alternate)、冬枣烂果病 ( A． alternate)和金丝小枣浆
烂病( A． alternate)、黑疔病 ( A． alternate)、枣褐皮病
等危害枣果实的病害，病原涉及 9 个真菌属和 4 个
细菌属，病害严重阻碍了枣产业的发展(魏天军等，
2006)。
白藜芦醇 ( resveratrol)是具有抗真菌功能的植
保素。Takaoka(1939)首次从藜芦中分离得到白藜
芦醇。白藜芦醇是一种有益于人类健康的天然物
质，除了红酒外，还有茶叶、花生、开心果、花生酱和
巧克力等食品都含有白藜芦醇(Burns et al．，2002;
Tokusoglu et al．，2005; Counet et al．，2006; Hurst
et al．，2008)。
苯丙烷代谢途径分支中的芪合酶 ( resveratrol
synthase gene，STS)是白藜芦醇生物合成的关键酶，
主要是在真菌感染、机械伤害、紫外辐射等诱导因素
作用下产生的(Hart，1981)。芪合酶存在于花生
(Arachis hypogaea)、葡萄(Vitis vinifera)和松欧洲赤
201
第 10 期 罗在柒等: 农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化壶瓶枣的研究
松(Pinus sylvestris)等植物体内( Sotheeswaran et al．，
1993)。研究证明，STS 和查尔酮合酶 ( chalcone
synthase，CHS)，均能够催化 3 个 Malonyl-CoA 分子
和1 分子 CoA-tethered phenylpropanoid，分别合成白
藜芦醇和另外一种物质，即 STS 和 CHS 能够催化相
同的底物生成不同的产物 (Ｒolfs et al．，1984)。因
此，遗传转化外源 STS 基因在植物代谢途径中能够
与 CHS 竞争相同底物催化合成白藜芦醇物质，增强
植物自身抗病性和提高果品品质。虎杖根中白藜醇
含量最高，已从中分离出与白藜醇代谢相关的芪合
酶基因 (Guo et al．，2013)，并对其功能进行分析
(Ma et al．，2009a; 2009b)。
白藜芦醇在农业方面的应用主要是体现在抗真
菌活性方面 ( Jeandet et al．，1995; Adrian et al．，
2006)，由于植物叶片和浆果等遭受机械损伤或病
源入侵等胁迫反应，白藜芦醇扮演植保素的功能得
以体现( Langcake et al．，1976)。近些年来，国内外
已在多种植物上分离出 STS 基因并论证了它们的抗
真菌活性 (Giorcelli et al．，2004)，异源成功表达转
STS 基因的植物有烟草 (Nicotiana tabacum) (Hain
et al．， 1990; 1993 )、苹 果 ( Malus domestica )
( Szankowski et al．，2003)、苜蓿 (Medicago sativa)
(Hipskind et al．，2000)、木瓜 (Carica papaya) (Zhu
et al．，2004)、银白杨(Populus alba) (Giorcelli et al．，
2004)、水稻 ( Oryza sativa ) ( Stark-Lorenzen et al．，
1997)、大麦 ( Hordeum vulgare ) ( Leckband et al．，
1998)、小麦(Triticum aestivum cv． “Florida”and cv．
“Combi”) ( Serazetdinova et al．， 2005 ) 和 生 菜
(Lactuca sativa) (Liu et al．，2006)等。
目前，有关枣树遗传转化与品种改良的研究不
多且进展缓慢。何业华等(2002; 2004)首先建立了
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefactions)介导的枣树
遗传转化系统，并获得了反义 ACC 合成酶基因转化
枣树。黄建(2006)将 S6PDH 基因导入枣树，获得
遗传转化植株。Gu 等(2008)成功采用农杆菌介导
遗传转化沾化冬枣(Z． jujuba‘Dongzao’)。但是虎
杖芪合酶作为一个超家族基因，目前仅看到 Pan 等
(2012 ) 将 PcＲS ( DQ900615 ) 遗 传 转 化 拟 南 芥
(Arabidopsis thaliana)，异源表达得到反式白藜芦醇
苷并使遗传转化植株获得抗真菌活性。
壶瓶枣(Z． jujuba‘Huping’)作为山西太谷的
地理标识品种，经济价值高，产业发展前景好，但
病害发生严重。白藜芦醇在虎杖根中含量较高，
前期实验从虎杖 ( Polygonum cuspidatum Sieb． et
Zucc． ) 根 中 分 离 得 到 白 藜 芦 醇 芪 合 酶 基 因
PcPKS5 ( EU647245 )，该基因与 PcPKS1、PcPKS3
同属于含有 3 个内含子的 CHS 家族基因，具有高
效合成白藜芦醇功能 (Ma et al．，2009a，2009b;
Guo et al．，2013 )。本 研究 将 虎 杖芪 合 酶基 因
PcPKS5 遗传转化壶瓶枣，以期提高其抗病性和改
善果品品质。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
壶瓶枣无性系材料系山西农业大学王玉国教授
惠赠。受体材料的准备:壶瓶枣茎在培养基 MS + 6-
BA2. 0mg·L － 1 + IBA0. 5mg·L － 1中分化出丛生芽(图
5A)，用于制备受体材料。无性系再生体系增殖系
数平均达 11. 0，其中通过茎段顶端和底端诱导愈伤
组织分化芽为3 ～ 4个，再生体系生根率达 97. 0%以
上，根系发达(图 5B)。
培养条件为温度(25 ± 1)℃，14 h 光照 /10 h 黑
暗，光强 2 000 lx。
虎杖芪合酶基因 ( EU647245)、植物表达载体
p3301-121、农杆菌 EHA105 为本实验室保存。各种
DNA 聚合酶、内切酶、连接酶，质粒提取试剂盒、胶
回收试剂盒、植物 DNA 提取试剂盒等试剂耗材均由
Takara 公司提供，引物合成和分子测序工作由生工
生物工程(上海)有限公司完成。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 植物表达载体的构建 选择植物表达载体
上酶切位点，设计带酶切位点 XbaI、BamHI 引物，扩
增目的片段，连接得到 p3301-121-PcSTS 重组质粒，
转化到农杆菌 EHA105，并进行阳性检测和测序
验证。
引物 F1(5 to 3) ATT CTC Tag AAT ggC AgC
TTC AAC TgA AgA，F2(5 to 3)TAT Agg ATC CAA
TgA Tgg gCA CAC TTC gTA，PCＲ 反应条件: 94 ℃
起始变性 4 min; 94 ℃变性 30 s，58 ℃复性 30 s，
72 ℃延伸 1 min，35 个循环; 72 ℃ 延伸 8 min。
PCＲ 反应体积为 25 μL。
1. 2. 2 遗传转化体系条件与抗性植株筛选
选择 1. 1 节中培养 40 天的丛生芽为受体材料，
将其剪成 1. 0 cm 左右茎段;将植物表达载体的工程
菌活化培养，获 OD600值为 0. 4 ～ 0. 8 的菌液，离心后
用液体植物培养基重悬后用于侵染受体材料，与侵
染材料置于较低浓度琼脂糖的 MS 培养基中共
培养。
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林 业 科 学 51 卷
选择乙酰丁香酮 ( acetosyringone，AS)浓度、抗
生素类型及浓度、抗除草剂的抗敏实验临界浓度 3
个因子进行试验，比较各因子对丛生芽分化的影响。
各试 验 中 培 养 基 浓 度 分 别 是，羧 苄 青 霉 素
( carbenicillin，Cb)、头孢霉素 ( cefotaxine，Cef) 分别
为 200，400 和 600 mg·L － 1，乙酰丁香酮为 30，60 和
90 mg·L － 1，Basta 为 1. 0，2. 0，3. 0，4. 0，6. 0，8. 0，
10. 0 和 20. 0 mg·L － 1。每个试验分别设 3 组，每组
均接瓶苗 10 瓶，每瓶 5 株。
受体材料预培养 3 天后进行遗传转化。遗传转
化过程设定农杆菌菌液浓度梯度 OD600值为 0. 4，
0. 6，0. 8，每个梯度侵染时间分别为 5，10，15 min，
共培养时间 2，3，4 天，然后转入含 Cb 400 mg·L － 1的
丛生芽培养基中培育，每隔 1 周转入新培养基作除
菌处理。试验共设 18 个处理，每个处理 40 瓶，每瓶
接种材料 10 个。
将分化丛生芽转接入含 Cb 400 mg·L － 1、Basta
10. 0 mg·L － 1的丛生芽培养基进行筛选，培养 3 周后
将抗性植株转入含 Cb 400 mg·L － 1的丛生芽培养基中
正常培养，再培养 3 周后再次转入含 Cb 400 mg·L － 1，
Basta 10. 0 mg·L － 1的丛生芽培养基中重复筛选阳性
植株。
1. 2. 3 阳性植株的检测 取阳性植株经梯度 90%
丙酮固定，β － 糖醛酸苷酶(β-glucuroidase，GUS)染
色，37 ℃ 过夜，经梯度乙醇脱色后 FAA 固定液保
存，观测染色情况，以野生型材料作阴性对照。
gDNA 的提取采用 eZNA Plant DNA Mini Kit 试
剂盒，PCＲ 反应体系方法同 1. 2. 1。
ＲNA 的提取采用奥莱博试剂盒法:制备 20 μL
反应体系［1 μg 总 ＲNA，1 μL Anchored Oligo( dT)
18，10 μL 2 × TS Ｒeaction Mix，1 μL TransScript
Enzyme Mix，ＲNase-free 水补至20 μL］;42 ℃ 孵育
30 min，85 ℃孵育 5 min 终止反应。ＲT-PCＲ 体系及
程序:参照 TransScript First-Strand cDNA Synthesis
Supermix 试剂盒说明书制备 50 μL 反应体系(2 μL
cDNA，1 μL F Prime，1μL Ｒ Prime，5 μL 10x Buffer，
4 μL 2. 5 mmol·L － 1 dNTPs，0. 5μL Enzyme，ddH2O
补至 50 μL);94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃
30 s，72 ℃1 min，35 个循环，72 ℃延伸 10 min 终止
反应。取10 μL PCＲ 产物 1%琼脂糖电泳检测。
1. 2. 4 基因表达效率比较 从转化植株分别提取
总 ＲNA，反转录(ＲNA 浓度约 1 000 ng·μL － 1，取 1. 0
μL 制备 20. 0 μL 反转录体系，ＲNA 浓度降为约
50. 0 ng·uL － 1)获得 cDNA 模板，荧光实时定量 PCＲ
试剂为 Cat:CW0956 2 × Ultra SYBＲ Mixture( Lot:
30910K)，反应条件: 95 ℃起始变性 10 min; 95 ℃
变性 20 s，60 ℃复性、延伸 1 min，40 个循环; 溶解
曲线条件:95 ℃变性 1 min，60 ℃复性、延伸 20 s。
内参基因为 ZjH3(Ziziphus jujuba H3，GenBank 登录
号:EU916201)基因(孟玉平，2010)，ZjH3 引物 F1:
GAACAGTGGCTCTGAGG GAAAT，F2:gagggaaatcgctc
aggatt。试验分别设计负对照处理。 PcSTS F1:
ACCTCACCCACCTCAAGCA CAAAT; PcSTS F2:
aaaacccgaatatcggtgcg。
1. 2. 5 白藜芦醇的提取与 HPLC 分析 以野生型
植株作为对照，称取 1. 5 g(鲜质量)植物材料，液氮
匀浆，转入 40 mL 80% 甲醇溶液中冷浸过夜，40 ℃
超声 40 min，4 000 r·min － 1离心 10 min，上清过孔径
0. 22 μm 的有机滤膜，加入 3 倍体积的石油醚萃取
小极性化合物，用乙酸乙酯萃取有机相物质，旋转回
蒸乙酸乙酯，用 1 mL 80% 甲醇溶解，待测。HPLC
条件为分离柱类型为 Sun Fire TM C18 5 μm，
4. 6 mm × 150 mm Column。柱温设定 25. 0 ℃，检测
波长为306 nm，流动相为乙醇和水，流速为 0. 5 mL·
min － 1，增速为 10% ～ 53% 10 min，53% ～ 56%
30 min，56% ～ 70% 10 min。
转基因植物叶片中白藜芦醇的 ESI-MS 验证:
HPLC 过程中，多次收集转基因植物提取物中与标
样有相同吸收峰时段的化合物，蒸干后溶于 50%的
甲醇溶液，用电喷雾(ESI)电离源电离检测，仪器型
号为日本岛津公司的 LCMS2010 型质谱仪。
2 结果与分析
2. 1 表达载体的构建与工程菌株制备
将 TOP10 菌株在 Kan50 mg·L － 1 LB 培养基中
活化 3 次，提取质粒作为模板，对上、下游分别为
Xba I，BamH I 位点的引物进行 PCＲ 扩增，获得目标
序列(图 1a)。
将目标基因片段与植物表达载体分别进行
XbaI，BamH I 双酶切，经 T4 连接酶连接，得到环状
表达质粒(图 2)，转化到 TOP10 菌株，酶切、测序分
析验证序列正确后，将构建的质粒转化到农杆菌
EHA105 感受态，菌液 PCＲ 检测为阳性，获得侵染工
程菌株。
2. 2 遗传转化因子试验
2. 2. 1 抗生素的筛选 比较 2 种抗生素对受体材
料再生体系影响，结果如表 1 所示。显著性检验表
明 Cb 丛生芽增殖效果优于 Cef，选择 Cb 作为遗传
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第 10 期 罗在柒等: 农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化壶瓶枣的研究
转化体系抑菌的抗生素。
图 1 目标基因 PCＲ 扩增及 p3301-121 质粒电泳
Fig. 1 Electrophoretogram of the STS gene and
plant expression vector
图 2 构建植物表达载体
Fig. 2 Construction of plant expression vector of the STS gene
表 1 不同抗生素及浓度对丛生芽分化的影响①
Table 1 Effect of different antibiotic and
concentration on shoot differentiation
抗生素浓度
The concentration of
antibiotics /(mg·L － 1 )
丛生芽数量均值
The mean
number of shoots
显著性水平
Significant
level (1% )
Cef 0 7. 0 a
200 6. 0 a
400 6. 0 a
600 5. 0 a
Cb 0 9. 0 b
200 9. 0 b
400 9. 0 b
600 9. 0 b
① 不同字母表示差异显著 Different letters mean significant
difference．
2. 2. 2 AS 浓度的筛选 AS 能够促进外植体丛生
芽分化(表 2)，AS 浓度为 90 mg·L － 1时与其他浓度
效果间存在显著差异。
2. 2. 3 Basta 临界浓度的筛选 Basta 主要作用是
破坏光合系统。当外植体吸收培养基中 Basta 后，
初期主要表现在茎尖和叶尖出现褐化，随着 Basta
浓度的加大和培养时间的延长，褐化程度加深，植株
死亡。培养 3 周后可知，Basta 浓度小于 2. 0 mg·L － 1
时对植株基本没有伤害，浓度 4. 0 mg·L － 1时有 50%
致死率，浓度达到 10. 0 mg·L － 1时致死率达 100%。
因此，Basta 临界浓度为 4. 0mg·L － 1(图 3)。
表 2 不同 AS 浓度对丛生芽分化的影响
Tab. 2 Effect of different AS and concentration on
shoot differentiation
浓度
The concentration of
AS /(mg·L － 1 )
丛生芽
数量均值
The mean
number of shoots
显著性水平
Significant
level (1% )
0 9. 0 a
30 9. 0 a
60 9. 0 a
90 11. 0 b
图 3 不同 Basta 浓度的致死率
Fig. 3 Death rate under different Basta concentration
2. 3 遗传转化过程中影响因子的 GUS 活性
遗传转化过程中，随着侵染时间的推移，GUS
活性随之增加。如图 4A 所示，当时间为 15 min 时，
GUS 活性达到 97． 0%，20 min 时 GUS 活性接近
100%。所以，遗传转化过程侵染时间确定为 15 min
适宜。试验过程中取样进行 GUS 染色检测，如果如
图 5D 所示。
乙酰丁香酮在遗传转化过程中能够诱导脓杆菌
Vir 基因的活化，促进外源基因的整合，但随着乙酰
丁香酮浓度增大，其物质本身对再生体系的增殖有
抑制作用。当乙酰丁香酮浓度为 60 mg·L － 1时，GUS
活性达到 92. 0%，浓度为 90 mg·L － 1时，GUS 活性增
至 96． 0% (图 4B)。因此，遗传转化过程选用乙酰
丁香酮浓度为 60 mg·L － 1为宜。
侵染农杆菌浓度作为遗传转化过程中重要的因
子之一。随着农杆菌浓度的增大，GUS 活性随之增
强，如图 4 C 所示，细菌浓度 OD600从 0. 4 ～ 0. 6 过程
中，增幅明显，OD600值从 0. 6 ～ 0. 8 过程增幅不明
显，而且随着细菌浓度增大，即细菌数量虽然增加，
但是细菌的侵染能力减弱，综合考虑，选择农杆菌浓
度 OD600值为 0． 6。
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林 业 科 学 51 卷
图 4 遗传转化过程中不同影响因子下的 Gus 活性
Fig. 4 Gus activity under different factor in the genetic transformation
图 5 受体材料遗化转化进程
Fig. 5 Experimental progress of genetic trasformation
A:受体材料 Plant material;B:壶瓶枣生根植株 Huping jujube rooting plants;C:获得的转化植株 Plants of genetic transformation ;D:共培
养 2 天外植体 GUS 染色 Histochemistry GUS on explants in co-cultured for 2 days;E:转化苗 GUS 染色对照 Histochemistry GUS on genetic
transformed seedlings．
共培养天数是指农杆菌侵染外植体后目标基因
整合到受体材料基因的用时。试验检测共培养 2，
3，4 天时的 GUS 活性，结果呈递增趋势，如图 4 D 所
示，3 个培养时间段的 GUS 活性依次为 92． 0%，97．
0%，97． 0%，因此，本遗传转化试验选用的共培养
天数为 3 天。
2. 4 阳性植株的检测
试验共侵染外植体 7 200 个，产生丛生芽约
72 000个，经过初筛获得抗性外植体 197 株，经复壮
培养后复筛，最终得到抗性外植体 3 株(图 5C，E)，
601
第 10 期 罗在柒等: 农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化壶瓶枣的研究
遗传转化率为 1. 52%。
3 株阳性抗性苗在高浓度 Basta 中能存活，且外
形纤细。经 GUS 染色，外植体全部呈现深紫色(图
5E)，表明遗传载体的 GUS 基因已经整合到壶瓶枣
植株基因组中。从转化苗基因组 DNA 能够扩增出
目标基因(图 6)，初步证明目标基因 PcSTS5 已整合
到壶瓶枣基因组中。获得的遗传转化苗经培养复壮
后与野生型对照无明显的表型差异。
进一步通过荧光实时定量技术比较 3 个不同转
化植株中表达效率，结果为其中 1 个株系高于另外
2 个株系(图 7)。
图 6 转化苗基因组检测
Fig. 6 PCＲ analysis of target genes extracted from the genetic
transformation plant
M:Marker 250 bp;1，3，5:转化苗 Positive control;
O:野生型对照 Positive control;
P:转化质粒 Transformed plasmid ( p3301-121-PcＲS)
图 7 不同转化植株 Q-PCＲ 比较
Fig. 7 Comparison of the Q-PCＲ of different transgenic clones
2. 5 白藜芦醇的提取、分离与 HPLC、LCMS 分析
HPLC 分析发现，保留时间为 16. 438 ～ 17. 236
min，其中在 16. 920 min 出现白藜芦醇吸收峰，标准
曲线为 Y = 67 354X + 62 755 (Ｒ2 = 0. 999 8)，通过
共色谱初步确定转基因植物样品中存在白藜芦醇
(图 8)，通过标准曲线计算得到其鲜重白藜芦醇含
量为 0. 45 μg·g － 1。多次收集出峰时间内的 HPLC
物质，经 LCMS 分析得到吸收光谱的 m / z 为 228. 9，
吸收值与白藜芦醇标样一致，证实所得产物为白藜
芦醇(图 9)。而作为对照的野生型植株在相同的提
取分离条件下未检测到白藜芦醇的吸收峰(图 10)。
图 8 白藜芦醇 HPLC 分析
Fig. 8 Analysis of resveratrol by HPLC
A．白藜芦醇标品 Ｒesveratrol reference standard;B． 遗传转化植株
Transgenic plants;C．共轭结果 Conjugated of the same amount both
resveratrol reference standard and transgenic plants．
图 9 HPLC 目标产物 LCMS 分析
Fig. 9 LCMS analysis of the target product by HPLC
3 讨论
本试验通过优化壶瓶枣优良无性系，从其茎段
增殖中获得再生体系，并建立了遗传转化体系，将虎
杖芪合酶基因 PcPKS5 遗传转化壶瓶枣并对转化植
株进行了鉴定。壶瓶枣 PCPKS 5 基因遗传转化体
系的建立，为枣树遗传转化外源基因表达机制提供
了技术方法和材料。试验成功的关键是获得了茎段
高效的再生体系，能够在截口产生愈伤组织并分化
得到丛生芽，遗传转化体系中抗生素 Cb 优于 Cef，
AS 对转化效率表现不明显，Basta 致死临界浓度为
4. 0 mg·L － 1;其次是明确菌体的侵染时间和菌体浓
度以提高侵染效率，菌液浓度为 OD600 = 0. 6 时侵染
15 min效果最好，共培养时间 2 天、含 60 mg·L － 1乙
酰丁香酮的培养基效果较优。试验中遗传转化率仅
701
林 业 科 学 51 卷
图 10 转化植株与野生型植株 HPLC 目标产物对比
Fig. 10 Comparison of target product in the transgenic plants and wild-type plants by HPLC
峰值时间 Peak fime:16. 928 min;A．转化植株 Transgenic plants;B．野生型植株 Wild plants．
为 1. 52%，遗传转化效率还比较低，其原因除遗传
转化体系还需进一步优化外，还应注意初筛、复壮和
复筛环节过程复杂，导致部分外植体死亡。
值得一提的是壶瓶枣转化外源基因植株中能够
代谢产生白藜芦醇，实现了外源基因的遗传转化表
达，白藜芦醇鲜质量含量为 0. 45 μg·g － 1。另外，从
产生的白藜芦醇含量来看，相对其他研究结果含量
偏低，究其原因主要为枣树本身作为植物表达载体，
是否有其特殊的代谢路径仍需深入研究;其二是有
可能受启动子因素的影响;再次是缺乏必要的如微
生物入侵、紫外照射和机械损伤等外界刺激。理论
上由于白藜芦醇生物合成途径和步骤较多，单纯过
量表达关键酶芪合酶基因虽然对白藜芦醇的含量可
能会产生一定的促进作用，但是要想通过枣树中的
表达载体大幅提高白藜芦醇含量，今后的试验还应
探索多个基因共转化，从而实现融合基因“邻近效
应”，使枣树中积累大量的白藜芦醇代谢产物。
遗传转化 STS 基因的植物具有很强的抵抗各种
真菌感染的能力 (Giorcelli et al．，2004;Halls et al．，
2008;Delaunois et al．，2009)。在转入 STS 基因的甜
薯( Ipomoea batatas) ( Pan，2012)、生菜 ( Liu et al．，
2006)和拟南芥 ( Arabidopsis thaliana ) ( Liu et al．，
2012)等植株中均得到白藜芦醇，另外在苜蓿
(Medicago sativa ) ( Kobayashi et al．，2009 )、烟草
(Nicotiana tabacum)(Condori et al．，2009)等得到白
藜芦醇苷等衍生物，且所有的转化植株均有抗真菌
的活力。本试验还需进一步检测转化植株的抗真菌
活性及深入研究相关机制。
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(责任编辑 朱乾坤)
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