全 文 ：第 1 卷 第 2 期
1 9 8 8 年 4 月
林 业 科 学 研 究
FO R E S T R E S E A R CH
幸0 1. 1 , No . 之
A Pr
。 , 1 9 8 8
杨尺镬核多角体病毒的研究
W
. 病毒多角体的回收试验
王贵成 王志贤. 崔士英 .
(中国林业 科学研究院林业 研究所 )
摘 要
本文 .优杨尺硬核 多角休 病毒的儿种 回收方法进行 了比较 。 回收 试验表明 , 以 丙
酮一矛L糖 (7 . 4一 8 . 4 % )共沉 法回收 A e iN PV 的 多角休 (P IB )是可行 的 。 制备 物 的
最终含量为 4 . 9 6 x lo ‘“PIB / g , 回收率平均达 80 . 5 % 。 生物活性浏定证明 , 回收的
新鲜制备物 , 对 3 龄初 幼 虫的致病力是很好 的 。 其 LC。。 及其 95 % 的五信限分别为
2
.
8 4 x 1 0 3PIB / m l和 1 . 7 0 汉 2 0 3一4 。9 6 x 10 “PIB / m l。
使用该程序 , 可省去昂责的离心设备 , 在实验 室一般设备的情况下 , 一次上样
15 0 0一30 0 9 病死虫 , 仅需 3 小时即 可获得最终产品 。 配制的病毒制剂 , 可 用于防
治 杨尺坡 3 0一 6 5 h a 。 大批量生产证明 , 该流程操作简便 , 石工省时 , 一次上样量较
大 , 完全可 以 替代 离心 法 , 回收的成本也很便宜 。
关锐词 杨尺坡 , 核 多角体病毒 ; 回收方法 ; 工艺流程
杨尺镬(A p o c几。im a ‘i, : e , a r iu s )核多角体病毒 (简称A c i N P V ) 的分 离鉴定、了占性侧定及林
间防治试验证明 , 该病毒对杨尺镬幼虫的毒力较强 , 防治效果甚好 孟‘一 3J。 对影响病毒增 殖的
主要因素及室内外复制技术 , 已进行过较 为详细的研究t’1 。 但有关该病毒多角体 的 回 收 程
序 , 国内外未见有任何报道【“一 ‘“] 。 因此 , 为尽快给生产部门提供一套经济有效、 操作简便、
适合于大规模生产的回收程序 , 我们根据杨尺镬核多角体病毒的病原 特性 , 将 D ul m a g e 等
回收 Fl fcho pl。厅a 。1 N PV 的方法略加改进 I” J , 就 A e iN PV 的几种回收程序进 行 了 比 较。
现将 1 9 8 2一 1 9 83 年所得结果报道如下 。
一 、 材 料 与方 法
(一) A e iN p V 病死虫的生产
A ci N PV 病死虫的生产 , 按已确定的方法进行 [ ‘] 。 回收试验所用的大量病毒 , 主要来源
于内蒙古锡盟镶黄旗林场应用坝上毒株在林间复制的病死虫 , 平均含量为 1 . 7 4 x l o ’。PI B / go
本文丁 1 9 8 7 年1 2 )1 20 日收至11。
, 仅乡加 了 l叱 2年的吸附试验及第 4 程序的部分试脸。 一f 八村、 、 吴燕卜d志参 一与部分工 f} 。
2 期 王贵成等 : 杨尺镬核多角体病毒的研究
(二 ) 多角体的回收方法
、 多角体的回收方法主要有 以下 3 种 : 离心一吸附法 、 离心与丙酮一乳糖共沉法、 丙酮一
乳糖共沉法。 其多角体回收工艺流程见图 1 。
图 1 A ci N P V 多角休回收程序示意图
根据回收方法的不同 , 每次各取 1 0 0 9 病死虫 , 加适量蒸馏水稀释 , 搅拌混合后 , 经 12 1目尼
龙纱过滤 , 除去组织碎片及其他杂质 。 所得滤液再充分搅拌后 , 取 o . sm 咖无菌水稀释计数 , 然
后按图 1 所列程序回收多角体 , 并计算其回收率及制备物中多角体含量 , 以比较其经济效益 。
(三) 回收制备物的生物测定
多角体制备物的生物活性测定 , 仍按作者等已确定的方法进行 I“〕。 试验前 , 将多角体制
备物稀释成2 . 5 x 1 0 , 、 2 . 5 X lo 6 、 2 . 5 X l o6 、 2 . 5 x l o今、 2 . s x i o , 、 2 . s x z o , PIB / m l 6 种浓
16 4 林 业 科 学 研 究 1 卷
度 , 以浸叶法感染 3 龄初杨尺蟆幼 虫 , 每一浓度重复 3 次 , 并设有同样数量的未处理对照 。
当幼虫取食48 小时后 , 更换新鲜食料 , 每 日记载死亡数 , 10 天全部结束 , 按常规数理统计方
法计算LC。 。一 LC。。 及其 9 5 夕石置信限 。
二 、 结果 与分 析
(一 ) 多角体病套的生产
在人工饲料尚未成功的洁况下 , 作 为 A ci N P V 的生产 , 目前还只能以天然食料饲 养 幼
虫 , 在室内外进行接毒感染增殖病毒 〔毛l 。 室内试验证明 , 接 毒 浓 度 以 1 . 1 又 1 护PI B / m l或
1
.
l x l07 PIB / m l为好 , 接毒 虫龄以 4 龄初为最好 (表 1 ) , 平均含量为 2 . 6 4 x i O. PIB /幼虫 。
林间使用浓度以 2 。 5 火 10 . PIB / m l为好 , 虫龄以 2 一 3 龄幼虫占8 5 %左 右 为宜 ; 3 一 4 龄占
8 5 %左右时 , 应加大用量 1 倍 [sj , 但将有部分老熟幼虫下地化蛹 。 回收的病死虫 , 平均含量为
一 7 4 ;、 1 0 ’。PIB / g (表 2 ) 。
表 1 接毒浓度 、 虫龄与A ci N P v 多角休产 t 的关系 (10 8 2 二 1 北 ; ;( )
毒 浓
(P113/ m l)
1
.
l x 1 0 5
1
.
1 又 1 0 。
1
.
I K I勺 -
接 毒 虫 叶 与 多 角 体 含 t (P IB / 幼虫 )
1
.
3 又 1 0 7
.
8 减 1 0 .
2
.
2 8 减 1 0 9
2
.
4 2 洲 1 0 9
2
.
6 4 x 1 0 ,
表 2 林间回收A ci N P V 多角体含 t 浦定 . ( 犬 10 ’ l, P IB / g )
红l 中 位 (X ) ( F )
1
.
0 1一 1 . 10
1
.
1 1一 1 . 20
1
.
2 1一 1 . 3 0
1
.
3 1一 1 . 4 0
1
.
4 1一 1 . 50
1
.
5 1一 1 . 6 0
1
.
6 1一 1 . 7 0
1
.
7 1一 1 . 8 0
1
.
8 1一 1 . 9 0
1
.
9 1一 2 . 0 0
2
.
0 1一 2 . 10
2
.
1 1一 2 . 2 0
2
.
2 1一 2 . 3 0
2
.
3 1一 2 . 约
2
. 该1一 2 . 5 0
2
.
5 1一 2 . 60
2
.
61一 2 . 刊
2
.
7 1一 2 . 8 0
1 0 5
1
.
1 5
1
. 公5
1 3 5
l
。
4 5
1
.
5 5
1
. 石5
1
.
7 5
1
. 习5
1
,
0 5
2
.
0 5
2
.
1 5
2
.
25
2
.
3 5
2
.
4 5
口. 55
2
. 石5
2
. 了5
; :;
3
.
7 5
5
.
4 0
8 70
1 2 40
1 4
.
8 5
1 4
。
00
1 1
,
10
1 3
.
65
8
. 公0
4
.
30
2
‘
2 5
4
、
7 0
4
.
9 0
2
.
5 5
0
‘
00
2
.
7 5
气 .
X 二 艺X F/ 艺F 二 1 . 7 ‘
1
2
3
4
6
8
9
8
6
7
4
2
1
. )
-
2
1
0
1
6 7
⋯
⋯
⋯ 1 1 6 . 85
关 每次以 1 0 0 9 装 , 加 灭菌水过渔稀释计数 . 所得 结果 。
2 期 王贵成等: 杨尺镬核多角体病毒的研究 1 6 5
(二 ) 多角体回收方法的比较
1
. 离心一吸附法 从 1 9 8 2年开始 , 首先按图 1 内的第 l 程序从杨尺镬病死 虫中回 收 多
角体病毒 。 回收前按 1 9 湿重加水 40 m l稀释过滤 , 反复离心两次 [“] , 弃上清 液 , 沉 淀 物 加
适量无菌水计数 。 根据沉淀物计数所得结果 , 仍按 l : 40 稀释 , 加适量活性 炭 和 粉煤 灰 吸
附 , 使最终产品 含量为2 。 0 x 1 0 ’OP IB / g 。 尽管所配制剂防治效果良好〔“〕, 但这种回收程序较
复杂 , 一次 上 样量 较 少 (仅 40 9 病死虫 ) , 干燥时间较长 (10 天左右 ) , 产品成本较高 , 不能
满足大规模生产的需要 。 因此 , 从 1 9 8 2年底开始 , 又按图 1 的第 2 一 3 回收程序 , 进行了多
次比较试验 。 试验前按病死虫湿重 1 : 3 , 加蒸馏水搅拌过滤 , 就两种程序所得产品进 行 比
较 。
2
. 离心与丙 酮一扎糖共沉法 此方法的程序是以国产 L X J一 亚型离心机 (上海医用分 析
仪器厂出品)4 0 0 转离心30 分钟 , 弃上清液 。 沉淀物重新悬浮于 15 %的乳糖液中 , 搅拌 30 分
钟 , 边搅拌边加入6 0 m l工业丙酮 , 搅拌 30 分钟 , 停10 分钟抽滤 。 于沉淀物中再加少量 工 业
丙酮 , 搅拌 10 分钟抽滤 , 接着重复一次 , 得干粉26 . 8 9 , 含量为4 . o x 10 ‘OP IB / g , 回收 率 为
61
.
1 %
。 但每次的回收率均不稳定 , 平均含量较低。
3
. 丙 酮一乳糖共沉法 该方法的程序是将 28 一32 克乳糖直接加 入 3 80 m l滤 液 内 , 以
D 90 一 2型电动搅拌机 (杭州仪表 电机厂出品) 搅拌30 分 , 加 3 倍体积的工业丙酮 1 1 4 0m l , 搅
拌 30 分钟抽滤 。 于制备物中再加少量工业丙酮 , 搅拌 10 分钟抽滤 。 接着以同样方 法 重 复 一
次 , 过夜干燥 , 得干粉制备物 35 9 左右 , 平均 含量 为 4 . 96 X 10 10 PI B / g (表 3 ) , 回 收 率 达
80
.
5 % (表 4 )。 虽然第 3 程序 回收的多角体制备物是一种低纯度的产品 , 但省去了离心步骤 ,
可以节约很多时间 。 而且这一程序设备比较简单 , 便于大规模生产 。 在实验室条件下 , 一次
上样量高达1 5 0 0一3 0 0 0 9 病死虫 , 3 小时回收干粉5 0 一 1 0 0 9 , 可用于防治杨尺蝮 30 一6 0h a ,
表 3 丙酮一乳糖共沉法回收A ci N P v
制备物多角休含量浏定 ( 义 10 1 oPI B/ g)
n幻n几甘nU八曰
份卜”一、†介0UO门‘J任ƒ卜n舀
组 距 ⋯组中值 ( X , }项数‘F ,⋯ x F
2
·
5‘一3 ·。。
1
2
·
7 5
{
‘ ⋯ 2 · , 5
3
·
0 1一3 · 50 { 3
·
2 5 ⋯ “ } , · 了5
3
·
5 1一 4 · 。。 { “
·
7 5 ⋯ 5 {
4
·
0 1一 4 · 5。 { 4
·
2 5 ⋯ “ ⋯ 8 · 5 。
4
·
5 1一5 ·0 0 { 4
·
7 5
}
“
{
“ 3 · 7 5
5
·
0 1一5 · 5。 } 5
·
2 5 ⋯ “ ⋯
5
·
5 1一6 · o。 } 5
·
7 5 ⋯ 1 4 5 · 7 5
6
·
0 1一 6 · 5。 } “
·
2 5 ⋯ ” } 1 8 · 7 5
6
·
5 1一7 · 0 0 } “
·
7 5 1 2 { 1 3
·
5 。
7
·
0 1一7 · 5 0 } 了· “5 { 3 {
: 2 5 】
X = 艺X F / 艺F = 4 . 9 6
而且所用丙酮还可回收70 %左右。 因此 , 后
来用于野外大面积地面喷洒或空中飞机喷洒
的制剂产品 , 都是以第 3 流程回收的多角体
制备物配制的 , 防治效果达85 %以上。
表 4 丙酮一乳健共沉法回收A ci N Pv
多角休的收率浦定
组 距 一组中值 ( X ) { 项数 ( F )
5 , 一“。 1
“5 { ”
6 1一 70 ⋯ “5 { 4
7 ,一吕o ⋯ 7 5 一 “
8 ‘一 , 0 { ”5 ⋯
9 1一 1 0 0 ! ”5 } 4
“ ⋯ 2 2
X = 艺X F/ 艺F = 80 . 5
(三 ) 多角体制备物的活性测定
丙酮一乳糖共沉多角体制备物的活性测定结果列入表 5 。 根据表 5 计算所得直线回归方
16 6 林 业 科 学 研 究 1卷
程及其函数图象如图 2 所示 , 可见观察值与计算值较为接近 。 其 LC 。。 为 2 . 84 x l护PI B / m l,
表 S 回收A c iN PV 制备物
的活性洲定结果
(内蒙古 19 8 3 . 5 )
感染浓度
(PIB / m l)
2
.
5 火 1 0 6
2
.
5 又 10 5
2
.
5 x 10 4
2
.
5 X 10 3
2
.
5 x 10 2
。、 试 一感染死亡 , :
幼虫数 一 (, .
校正死亡率 机 ’仁位
(% ) (Y )
9 5 %置信限在1 . 7 0 x lo 3一 4 . 9 6 只 i o 3P IB / m l
之间(表 6 ) , 比提纯离心样品个体生测结果
要高 [ Zj。 使用第 3 流程回收的多角体配制的
各种制剂 , 经 3 年的贮藏试验和多年的林间
试验表明 , 防效均在85 % 以上(表 7 ) 。 与提
纯离心制剂相比 , 防治效果相差不大 〔“J。
1 0 0
.
0
56
.
8
6 7
.
5
50
.
9
2 4
.
8
6
.
8 8
5
.
4 1
4
。
9 7
4
.
2 3
(I
’
l:亏/ m i)
2
.
3
、
1IF 2
.
5 入 10 , 2 . 二汉 l了 2 . 5 , 1护 2 . 5 尺 l沪
几“叮‘-介舀
.⋯n””卜b6曰八†n曰Žh月组目.工
洲黔2 2
.
0
,人., .几n一七户nl口巴J”
冲阵棍…目一阶70油
裹 6 感染3龄初幼虫死亡 30 一 , O%
所铸浓度及其95 % t 信限
9 5萝‘ 皿 信 限
、沙/尽荃庄
黝Ir’
死亡率
( % )
璐染浓度
( l
)
11三/ m l )
6
.
8 1 减 1 0 2
2
.
8
‘
1 x 10 )
1
.
19 x 1 0 4
9
.
57 x 1 0 4
卜 限 上 限 / /
3
.
8 3 x 10 2
1
.
7 0 x 1O J
7
.
2 8 又 10 3
4 5 7 X 10 .
1
.
2 0 X 1 0 )
4
.
9 6 x 1 0 3
1
.
93 x l o .
2
.
0 0 拭 1 0 5
;
{夕
/
忍
图 2
浓度( 1. , g )
感染浓度与死亡率回归直线
几“0on佗Qrdt‘O口
衰 7 应用A ci N P v 杀虫荆防治杨尺 . 效果
标准枝虫 LJ 密度
前 ’ 防 后 下降
( ,百
辛;防一 223
一
试验 地点 制刘 名称 .吹洒 方式
喷酒浓度
( I
, 1 1; / m l)
喷酒剂爪
( P1 13/亩 )
防治面积
( 亩 )
由专 期
一I ·o v一 8 2 , }
内 艾 古
饮黄旗林场
『
f O V 一 8 3 1
BW V 一 8 3 1
13、V 、厂一8 3 2
超低容皿全喷
超低容皿全喷
商容盆隔带喷
商容皿附带喷
1
.
2 1 K 1 0 .
1
.
6 7 x 1 0 8
2
.
5 0 X 1 0 6
2
.
5 0 K 1 0 6
1
.
3 5 x 10 1 o
2
.
5 0 x 10 1 0
1
.
8 3 x 10 ‘0
2
.
5 0 减 10 1 0
3 3
2 8
2 0 5
1 6 0
2一 3
Z to 3
3一 4
3一 4
1
·
3 ⋯
0
。
7
0
.
9
{
内 蒙 古
商 都 共
八股地林场
廿 庸 省 武
成地区石洋
河林业总场
13\V V 一 8 3 1
I玉W V 一 8 3 2
BW V 一 83 3
高容见满带喷
商容址陇带喷
商容盘隔带咬
2
.
50 又 1 0 ‘
2
,
50 又 1 0 6
2
.
50 X 10 ‘
2
.
5 0 x 10 1 o
2
.
5 0 又 10 1 0
2
.
SO x 10 l o
3一 4
3一 4
3一 4
2 1
.
6
4
.
6
1 8
.
0
2 7
.
3
2 7
.
9
3
.
0
0
.
8
2
.
0
2
.
5
1
.
9
8 6
。
5
8 5
。
0
8 3
。
3
I3W V 一 8 3 1
1;W V 一 8 3 3
低 容址全喷
低 容皿全喷
2
.
5 0 x 1 0 6
2
.
5 0 K 1 0 6
2
.
5 O x 1 0 , o
2
.
5 0 x 1 0 1 0
1 5 0
1 5 0
3一 乞
3一 4
9 0
.
8
93
。
2
三 、 结 语 与讨 论
通 i
心设备 ,
就地加 _
止几种回收工 艺流程的 L匕较 , 我们认为丙酮一乳糖共沉法较好 。 因其不需要复杂的离
操作简使 , 省工省时 , 适合大规模生产的需要 , 便于各级森林病虫防治站就地取材 ,
l几), (; ) 户二 .}1[. 。 ’了I) u lllza g e 等回收了’ ; ic ho p l。: ia , , 1 N PV )- 法比较【川 , 减少了丙酮 !!J墩 ,
2 期 王贵成等 : 杨尺镬核多角体病毒的研究 1 6 7
节约费用 1 / 选 , 因此降低了 A d N PV 杀 虫剂的生产成本 。 所得病毒 干 粉体 积 小 , 便 于 贮
存 , 可根据需要随时配成各种剂型 。 特别是解决了油剂配制问题 , 其意义更为重大 。
回收的多角体制备物及其所配制剂 , 经贮藏试验和多年林间防治试验证明 , 防治效果甚
好 , 而且是低成本的。 尽管丙酮一乳糖共沉多角体制备物与新鲜样品比较 , 在贮藏过程中会
丧失一些活性 , 但这是微不足道的 。 只要掌握好防治适期 , 并不影响整体防治效果 , 只是潜
伏期延长 1 夭左右 (有关材料另文报道 ) 。 所以我们认为 , 这种回收流程还是可取的 , 是比较
适合我国目前生产水平的。
参 考 文 献
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A ST U D Y ON T H E NUCLE AR POLYHE D R O SIS
V IR U S OF TH E POPLAR LOOPE R (刀PO CH E IM A
C IN E R A R IU 困) F . R E COV E R Y T E S T S OF V IR U S
W a n g G u ie h e n g W a n g Z h议ia n C u i Sh iyin g
(T ho R e se o r c 石 I o stf t o t e o f F o r e st心 C 月F )
A b st了a e t
S e v e ra l m eth o d s fo r r e e o v e ry Pr o e e d u r e o f th e po lyh e d ra l in e lu s io n bo d ie s
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16 8 林 业 科 李 研 究 1 卷
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r e e o v e r y Pro e ed u re
AB T 生根粉全国推广 、 总结 、
表彭大会在北京召开
A B T 生根粉全 国推广 、 总结、表彰大会于 1 9 8 7年 10 月29 日至1 月 1 日在北京召开。 参加会
议的有18 个省、市 、区的代表共40 人 , 其中专业户 6 人 。会议期间 , 中国林科院副院长陈统爱 、
北京市人民政府计划委员会副主任曹学坤、 北京林业大学教授孙时轩 , 国家科委农村技术开
发中心 、 林业部科技司 、 北京市林业局 、 北京市农林科学院派员参加会议并讲了话 。 有关新
闻单位也出席了会议。
会议听取了林研所副研究员王涛同志关于三年来 A B T生根粉推广总结报告 。 她肯定了生
根粉是一种广谱、 高效生根促进剂 , 它不仅能补充植物所需要的外流生根素 , 还能促进插穗
内流生长素的合成 。 因而能加速插穗下切 口愈合 , 缩短生根时间。 A B T 生根粉 1 9 8 4年底进入
科技市场后 , 受到各方欢迎 。 目前 , 巳在全国26 个省 、 市 、 区或。。0个单位进行了推广试验工
作 , 建立了全国性的推广、 试验 、 销售技术和咨询服务四位一休的协作网 。 试验植物由几种
推广到 2 8 9种 , 根据 2 个省 , 98 1个点 , 84 8 . 6万株扦插苗的调查 , 应用生根粉能促进植 物插
条生根 , 平均生根率为94 % 。 其中花卉 85 种 , 平均生根率为92 % ; 果树及特种经济树 种1 14
种 , 平均生根率为9 6 % , 树木90 种 , 生根率为97 % 。 对难生根的柿树 、 荔枝 、 板栗等的扦插
育苗 , 取得重大进展。 还突破了红松 、 鱼鳞松、 山杨扦插生根难的大关。 近几年来 , 用于水
稻 、玉米 、马铃薯、西红柿 以及人参等品种上 , 生根率提高 10 一30 % 。 由于 A B T 生根粉能显著
提高生根幸 , 因此推广应用生根粉巳取得明显经济效益 , 三年来为国家创纯 收 益 7 0 多万元 。
会议期间 , 有3 个单位交流了经验 , 山东省寿光县振兴萄葡园艺场张本敬介绍了利用生
根粉培育各种葡萄苗 , 已取得百万元的经济效益 , 还为全国20 个省、 市培训 了 6 万 多 人 次
的致富人才‘ ; 吉林省汪清县林业局郑麟模介绍了人参和水稻利用生根粉 , 获得大幅度增产的
经验 。 这些 , 都博得与会同志的赞赏 。
会议经过充分讨论 , 制定了1 9 8 8年生根粉推广 、试验计划 。会上对39 名推广生根粉的先进
工作者颁发了荣誉证书及奖品 。 还宣布成立植物扦插研究会 、 植物扦插繁殖科技通讯编辑部
和植物工厂化育苗综合技术研究推广协作组 。
(林茂 )