全 文 ：林业 科学研 究 ,
木麻黄根瘤中分离的三株弗兰克氏菌
生长与培养方法的研究 ‘
康丽华
摘要 比较了从不同来源的木麻黄根瘤中分离得到 的三株弗兰 克氏菌 在两种浓度
不同碳源培养基中的生长差异 , 结果表明 供试菌株在 以丙酮酸钠为唯一碳源时生长最好 , 其生长
量为其它碳源的 倍 最适合的碳源浓度为 在三种不 同的 菌培养方
式中 , 通入无菌空气及发酵培养较静置培养能显著地提高弗兰克氏菌的生长量 同时还探讨了弗兰
克氏菌的发酵条件 。
关健词 弗兰克氏菌生长量 、 碳源 、 通气培养 、 发酵培养
自 ! 年 等〔’〕首次从香蔗木根瘤中分离出弗兰克氏菌 ’ 并成功地进行
了离体培养 , 年 等 从木麻黄根瘤中分离出弗兰克氏菌获得成功以来 , 现已从多种
木麻黄根瘤中分离出许多弗兰克氏菌〔卜 〕。 从已分离的木麻黄弗兰克氏菌菌体看 , 它们是极其
相似的 , 都具有 菌的典型特征 从生长特性看 , 表现出许多共同性 , 但也存在着一些差
异 。 迄今分离得到的这些弗兰克氏菌菌株都属于慢生长型 , 培养菌体所需要的周期长 , 所能收
集到的菌体量非常少 。 等曾对分离 自 属 种植物根瘤的 株弗兰克 氏菌进行
过测定 , 每毫升培养液收集到的湿菌体为 , 大约相当于链霉菌的 , 从胡颓子科
的 种植物根瘤中所分离的 余株弗兰克氏菌 , 每毫升培养液也只能收集到大约
湿菌体 。 因此如何在短时间内收集到大量菌体 , 以满足应用研究的需要 , 这是将 菌
尽早应用于生产实践首先应解决的问题 。
弗兰克氏菌由共生状态改变为在人工培养基上生长 , 其生态条件和营养条件都发生了较
大改变 。 尽管对其机理 目前所知甚少 , 但条件的改变及遗传的因素应是菌体生长缓慢的主要原
因 。 因此研究弗兰克氏菌人工培养的最适生长条件 , 增加菌体的收集量 , 逐步满足基础研究和
应用研究对大量菌体的需要 , 这是非常重要的 。 目前国内外对弗兰克氏菌最适生长条件的研究
多集中在碳氮源 、 、 温度等 , 但对培养方式研究得较少 。 本文 比较了三株不同来源的木麻黄
弗兰克氏菌在两种浓度的不同碳源培养基上的生长特性 研究了通气培养 、发酵培养对提高弗
兰克 氏菌生长量的效果 , 同时对发酵条件进行了初步的探讨 。
一 一 收稿 。
康丽华助理研究员 中国林业科学研究院热带林业研究所 广州 澳大利亚 昆士 兰农业大
学 澳大利亚联邦科学与工业研究组织土壤研究所 。
, 本项研究为中澳合作项 目 和中国林科院基金项 目“木麻黄根瘤菌—弗兰 克氏菌的应用生态学研究 ”的部分 内容 。
林 业 科 学 研 究 卷
材料与方法
弗兰克氏菌菌株来源
供试菌株 从澳大利亚细枝木麻黄 ‘ 根瘤中分离获
得 从美国的细枝木麻黄根瘤中分离获得 ’ 从澳大利亚的普通木麻黄中分离
获得 , 〕。
培养基
采用 和 盯 仁〕的基本培养基 磷酸缓冲液和 ! 分别灭菌后加入培养
基内 , 碳源为丙酮酸钠 、 吐温 、蔗糖 、葡萄糖 、唬拍酸钠 、 山梨醇 、丙酸钠 、 柠檬酸钠 、 苹果酸钠 。培
养基碳源加入量以碳源含碳量计算 , 低浓度的碳源为 。 , 高浓度的碳源为 ,
碳源均经 拜 过滤灭菌后分别加入基本培养基 。
培养方法
碳源试验 取 经过 静置 一 周的菌悬液接种于 含有上述碳源的
培养基中 , 静置培养 后 , 测定菌体蛋白质含量 。
通 气培养 三角瓶装入 以丙酸钠为碳源的 培养液 , 菌株用
, 通入无菌空气 , 接种量为 写 , ’ 培养 后测定菌体蛋白质含量 。
静置培养 培养液及培养条 件同通气培养 , 但不通入无菌空气 。
发酵培养 发酵罐装入 以丙酸钠为碳源的 培养液阁 , 菌株用 , 接
种量为 , 温度控制 ℃ , 搅拌速度为 。 发酵时间一周 , 每隔一定时间取发酵液
测菌体干重 。
菌体蛋 白质测定方法
菌悬液经 离心 , 菌体用无菌蒸馏水洗 次 , 最后定容为 , 加入
的 , 于 ℃水浴中 , 蛋白质测定根据 和 方
法〔” , 用牛血清蛋白做对照 。
菌体干重测定方法
取不同时间发酵液经过装有 拌 滤纸的 过滤 , 于 ’烘干至恒重后
称重 , 每个样品重复 次 , 取平均数 。
结果
弗兰克氏菌在两种浓度的不同碳源培养基中的生长特性
三株供试菌株在低浓度的碳源培养基中 , 在不同程度上都可以利用丙酮酸钠 、 吐温 、蔗
糖 、 葡萄糖 、唬拍酸钠 、 山梨醇 、丙酸钠 、 柠檬酸钠 、 苹果酸钠 表 。 但在以丙酮酸钠为唯一碳
源的培养基中生长最好 , 其生长量为其它碳源的 倍 , 其次为丙酸钠 。 在其余 种碳
源培养基中均生长不好 。
在高浓度碳源培养基中的三株供试菌株均比在低浓度的碳源中生长差 。 和
菌株在以丙酸钠为唯一碳源的培养基中生长最好 , 其生长量为其它碳源的 倍 , 其次
为丙酮酸钠 。 菌株在以丙酮酸钠为唯一碳源的培养基中生长最好 , 其生长量为其它碳
源的 一 倍 。 这三株菌在其余 种碳源上生长不好或不生长 。
期 康丽华等 木麻黄根瘤中分离的三株弗兰克氏菌生长与培养方法的研究
表 三株 菌株碳源利用的比较 单位 拌
!
低浓度碳源
丙酸钠
丙酮酸钠
吐温
柠檬酸钠
苹果酸钠
珑拍酸钠
山梨醇
葡萄搪
蔗搪
接种量
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1. 5 (0 . 1 4 )
1 .6 (0 . 1 3 )
4 . 2 (0 . 1 3 )
1 .2 (0 . 1 4 )
0 .8 (0 . 2 3 )
1 . 1 (0 . 0 8 )
0 .8
高浓度碳源
丙酸钠 20.0(0.9) 27.0 (2.4 ) 11.0(0.96 )
丙酮酸钠 1 1.0(2.6) 21.0 (0.98 ) 28.0(6.2 )
吐温 80 5.4 (0.3) 7. 2(1.2 ) 9.5(0.33)
柠檬酸钠 0.7 (0.2) 2. 9(0.5 ) 2.1(0.15)
苹果酸钠 0.5 (0.09) 0. 73 (0 .12) 0.1(0.01)
唬拍酸钠 0 , 5 ( 0 . 0 2 ) 0 . 8 5 ( 0 . 2 2 ) 0 . 4 7 ( 0 . 1 2 )
ilJ 梨酸 0.4 (0.05) 5.1(0.42) 2.3(0.35)
葡萄搪 0.4(0. 1) N D 2.3(0.12)
蔗糖 0.5(0.08) N D 1.7(0.16)
接种量 0.3 0.2 0.2
注 :括号内的数字为标准误差 , N D 表示蛋白质含量极微 。
以上的试验结果与 Shipton 、 B u r g g r a a f [ ‘。]和 zh ang [‘’]等人的结果相一致 。 L o p e z [ ” ]等报道
了从恺木根瘤中分离得到的 F ra nk l’a 菌株在以唬拍酸钠为碳源的培养基中生长好 , 其生长量
为丙酸钠的 4 倍 , 丙酮酸钠 的 9 倍 , 这与从木麻黄根瘤中分离的 F ra n kia 菌株在利用唬拍 酸
钠 、 丙酸钠能力差别很大 。 说明了不同属植物来源的 F ra nk la 菌株在碳源利用上存在差异 。
2
.
2 弗兰克氏菌的生长曲线
根据上述试验结果 , 选择丙酸钠作为唯一碳源 , 测定 JC T 287 菌株的生长曲线 。 结果见图
403加1八曰已\的3喇如唱仍阴耸佃
1 。 从图 l 生长曲线可看出 , 卢’ra n k i a J C T 2 8 7 的
延迟期为 2 d 、 2 d 后进 入对 数生 长期 , 26 一
3 3 d 为稳定期 , 生长至 30 d 时菌体达到最大生
长量 。 对数期的倍增时间为 72 h 。
2
.
3 弗兰克氏菌生长与培养方式
2.3.1 弗兰克氏菌生 长与通 气培养 通气培
养与静置培养对 F ra 诚ia JC T 28 7 菌 株生长的
影响见表 2 。 表 2 表明 , 通气培养的 F ra nkl’a 菌
体生长量为初始浓度的 88.80 倍 , 而静置培养
为 1 .41 倍 , 通气培 养的 F ra n ki a 菌体生长量
是静置培养的 7.78 倍 。 与表 1 丙酸钠为碳源
26 29 33 36
图 1 尸ra , 。乏ia JC T Z s 7 菌株生长曲线
林 业 科 学 研 究 9 卷
的菌体生长量相 比 , 也提高了 1.26 倍 。 结果
说明 , 采用通入无菌空气的培养方式可以提
高 F ra nki a 生长量 。 F ra n k t’a 菌属兼性庆氧
菌 , 当静置培养 时 , F ra nk l’a 菌只生长在容器
底部和容器壁 , 菌落呈细小颗粒状 , 直径为
表 2 菌体生长与通气培养的关系
处理 菌体蛋白浓度年g /m l ) 增加倍数
通气培养
静置培养
初始浓度
49.73
6.39
0.56
88.80
11.41
0 . 5 ~ 2 m m ; 通气培养时 , F ra nk ia 菌落絮状 、 松散 , 均匀分布在容器中 。
静置培养的菌体生长量(6 .39 拼g / m L )与表 1丙酸钠为碳源的菌体生长量(2 .0 拌g / m L )
相差很大 , 其原 因可能与培养规模有关系 , 静置培养的体积为 2 00 m L , 而表 1 的试验仅为 50
m L , 说明在大量培养中要提高菌体生长量 , 就必须要通入无菌空气 。
2
.
3
.
2 弗兰克氏菌的发酵培养 在通气培养的基础上扩大到发酵培养 , F ra nk 心 菌发酵培养
的溶解氧与菌体生长的关 系见图 2 。 从图 2 中可看出 , 发酵开始 Z d , 溶解氧降低很少 , 说明氧
利用不多 , 菌体增加也不多 , Z d 后 , 溶解氧下降 , 耗氧量增加 , F ra nk t’a 菌体生长量上升 。
3 结 语 120
10 次侧妊琪胜处
8064
200
l 2 3 4
时问(d)
5 6
0‘4.山000
曰‘、州十翅址.翻事耸洲佃( l) 三 株 从 木 麻 黄 根 瘤 中 分 离 的
F rankla 菌 JC T 2 87 、 K B S 和 H F P C 13 最适
碳源为丙酮酸钠 ;这三 株菌最合适的培养
基含碳量为 0. 23 g C /L 。
( 2) 在 F ra nk ia 大量培 养中通入无菌
空气能显著地提高菌体生长量 , 发酵培养
在短时间内能大 量收 集到 F ra nk ia 菌体 ,
这两种培养方式进行 F ra nk l’a 菌的大量培
养是可行的 。 通气培养具有设备简单 、 方法
简便的优点 , 发酵培养需要发酵罐的设备 。
图 2 F ra ” k ia 菌 发酵培养的溶解氧与菌体生长的关系
a.尸ra , : k ; a 菌生长 ; b.溶解氧
参 考 文 献
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