全 文 ：第 4 卷 第 6 期
1 , 9 1 年1 2月
林 业科 学研 究
FO R E S T R E S E A R C H
V o l
。
4
,
N o
。
6
D e e
. ,
1 9 9 1
两株木麻黄内生菌培养条件
和培养特征的比较研究 ‘
康 丽 华
(中国林业科学研究院热带林业研究所 )
关. 祠 木麻黄 , 弗兰克氏菌 , 培养条件
自 19 7 8年 Ca lla ha m 等人首次从香蔗木 (C o二p to , ia p o r e g ri, a )根 瘤 中成 功地分离出
F r a n k ia 内生菌纯培养后 [’] , 许多学者己从赤杨属(A ln u s )、 胡颓子属 (E la e a g 。: s) 、沙 棘属
(H ip p o pha e )
、 杨梅属 (M 梦r ie a ) 和木麻黄属 (C a s : a : fn a )等非豆科固氮树木根瘤中分离得到
F r a n k ia 内生菌〔2一 ‘1。 但这些内生菌生长极其缓慢 , 这给大面积的田 间应用带来许多困难。
因此 , 作为 Fr a n ki a 菌应用研究的前提 , 需要更多地了解体外培养条件及其最适生条件 。 目
前国内外已进行了很多这方面的研究 [卜 ‘。〕。 从已分离的内生菌株形态看 , 它 们 是 极其相似
的 , 都具有 Fr a n k ia 的典型特征 , 从培养条件看 , 也表现出许多共 同 性 , 但 又 有 一 些差
异汇‘。J。 本文报道了两株木麻黄内生菌培养条件和培养特征的比较结果 , 为 Fr a n k ia 内生菌
应用于生产提供科学依据。
1 材料和方法
1
.
1 菌株来源
F r a n ki a 8 6 0 0 1
、
8 6 0 0 2两菌株分别从福建东山赤湖林场和海南省岛东林场的普通木麻黄
(C a s u a : io a eq‘ise公ifo lia )根瘤中分离获得 [。I。
1
.
2 培养方法
试验全部采用液体培养 , 以便于接种和收集菌体。
1
.
2
.
1 菌悬液制备 接种液经离心收集菌体 , 用无菌蒸馏水洗涤 3 次后研磨制 成 菌悬液 ,
以 0 . 2 m l的接种量接入盛有 7 m l不同培养液的16 c m x l . s c m 试管中 , 每组 3 次重复 , 在28
~ 30 ℃下静止培养一个月后 , 用双缩脉法测定菌体蛋白质 。
1
.
2
.
2 培养墓 以 B a p 〔川为基础培养基。 在碳源试验中 , 去掉基础培养基的碳源丙酸纳 ,
分别加入浓度为 1 % 的试验碳源 , 经紫外线灭菌 l h 后加入已灭菌的培养基中。 在氮源试验
中 , 去掉基础培养基的氮源 N H 4CI , 分别加入浓度为。。 5 %试验氮源。 p H 试验用 B a p 培养
基 , 分别将 PH 值调至5 . 5 、 6 . 5 、 了. 5 、 5 . 5 。 N aC I试验用 B a P 培养基 , 分别 加 入 0 . 5 % 、
0
。
7 %和 0 . 8 % 的 N a C I。
本文于 1 9 9 0年 6 月 1 日收到 。
* 本研究是法国资助 的 FA O 项 目“固抓木本树木改 良’ 的一部分。 参加工作 的还有姚玉华同志 , 广东省徽生物研 究 所
莫小英 同志指导蔺体蛋白质含t 的侧定 , 本文经本所 弓明钦副研究员审阅 , 在此一并致谢 ,
6 期 康丽华 : 两株木麻黄内生菌培养条件和培养特征的比较研究 697
2 结果和讨论
2
.
1 菌株在不同培养基中的生长情况比较
Fr a n k ia 8 6 0 0 1 和 8 6 0 0 2 菌株在 B a p 、 B a p 一N [‘, l、 Ja n B l帅[ ‘, , 、 Qm od [ “1 、 B/ Z I。, 、
S [ ‘
“l、 S + T 工‘“1 、 葡萄糖天门冬素(G u A ) I‘6 1和蔗糖硝酸盐 (Y c Z )仁‘e ]液体培养基中的生 长 情
况见表 1 。 表 1 菌株在不同培养液中的生长情况
菌 株 B a P B a p 一N Ja n B lo m Qm o d B / 2 S + T G u A Y e Z
+++朴十份+十十什份 份8 6 0 0 1
8 6 00 2
注 : 带表示生长 极明显 , 升表示生长明显, + 表示稍有生长 , 一 表示不生长 。
从表 1 中可见 , 8 6 0 0 1和 8 6 0 0 2菌株在多数培养基上生长情况基本一致 , 在 B a p 和 B a p -
N 培养液中生长极好 , 在 Ja n B lo m 、 Qm od 、 S 、 S + T 上生长次之 。 5 6 0 0 1菌株在 G u A 和
Y c Z 培养液中不生长 , 而 8 6 0 0 2菌株在上述培养液中均可生长 。
这两株菌在不同培养液中的培养特征也基本一致。 在 B a p 和 B a p 一N 培养液中, 菌落呈
圆球形颗拉状沉淀 , 直径约为O。 5 ~ 2 m m , 呈荔 肉白色 ; 在显微镜下观察 , 可见到菌体形成
很多形态各异的抱子囊 , 多呈圆形、 椭圆形、 草幕形、 棒状形和穗形等 , 或呈不规则形状 。
在无氮的 B a p 培养液中菌体形成很多泡囊(V es icl es ) , 多呈球形和卵圆形 , 表面 光 滑 , 多
着生在菌丝体一侧的细小分枝上 , 其直径为 2 一 3 卜m 。
2
.
2 不同碳源对 Fr a n kia 菌株生长的影晌
Fr a n k ia 8 6 0 0 1和5 6 0 0 2菌株对不同碳源利用情况见表 2 。
表 2 碳派对菌体生长的影晌及其培养特征
86 0 0 1 菌 株 8 6 0 0 2 菌 株
碳 源 菌体蛋 白量
(m g / 7 m l)
菌体颜色 菌体蛋 自量
(m g / 7 m l)
形 态 菌体颜色
吐 温 8 0 0 . ZD
丙 酸 钠
丙酸钠 + 葡萄搪 0 。 5 7
蔗 糖 N . D
絮状沉淀, 菌丝粗短
顺粒状沉淀 ,菌丝粗长
颐粒状 沉滚,菌丝细长
顺粒状沉淀
荔肉白 0 . 1 3 絮状沉淀 荔 肉 白
荔肉白 0 . 2 3
荔肉白 0 . 1 2
荔肉白 0 . 10
颐粒状沉淀,
菌丝细长
顺粒状 沉淀 ,菌丝 细长
絮状 沉淀 , 菌
丝较短, 分枝
多
荔 肉 白
荔 肉 白
落英淡粉
麦 芽 糖 N . D 未观察 未观察 架状祝淀 , 菌
丝较短, 分枝
多
金 叶 黄
葡 萄 糖
珑拍酸钠
N
.
D
N
.
D
顺粒状沉淀
未观察
荔肉白
未观察
絮状沉淀
絮状沉淀 , 菌丝细长
208
无 碳 源
抹: N · D 表示蛋白质含量极微, 一表示不生长 ,
林 业 科 学 研 究 4 卷
从表 2 中可见 , 8 6 0 0 1和8 6 0 0 2菌株在以丙酸钠为碳源时生长最好 , 菌体生长量分别是其
它碳源的 1 . 15 ~ 2 . 9倍 。 据报道 , 从不同属宿主植物中分离的 F r a n ki a 菌株对碳源的利用能
力差异很大 。 从木麻黄根瘤中分离的 F r a n k ia 菌株对丙酸和丙酸钠的利用很好 , 而 从 胡颓
子、 赤杨 、 香蔗木根瘤中分离的 F r a n k ia 菌株对丙酸和丙酸钠 的利用能力却很差 , 但它们都
能很好地利用其它碳源如唬拍酸钠 等〔‘。, ’7 , ‘日3 。 从表 2 中也可见 , 8 6 0 01 和 8 6 0 0 2 菌株 在 糖 类
的利用上存在着明显的差异 : 8 6 0 01 菌株对蔗糖 、 麦芽糖和葡萄糖利用甚微 , 但 8 6 0 0 2菌株却
能利用这些糖类 , 而且菌体颜色在不同的糖类中也发生变化 。
2
.
3 氮谏对菌休生长的形晌
F r a n k ia 8 6 0 0 1和 8 6 0 0 2菌株对不 [tr] 氮源利用情况见表 3 。
裹 3 菌株利用氮派情况及其培养特征
8 6 0 0 2 菌 株
氮 源 菌体蛋 白蛾
(m g / 7m l)
8 6 0 0 1 菌 株
形 态 菌体颜色 苗体蛋 白最
(m 义/ 7 m l) 形 态
絮状沉淀 , 菌
性 细 长
苗体颜色
酩蛋 白水解物 絮状沉淀 , 菌
丝 粗 长
絮状沉淀 , 菌
丝粗长
顾粒状沉淀 ,菌丝 中部多膨
大
虫卜肉自 任汁黄
牛 肉 青 荔肉自 絮状沉淀 ,
性 细 长
絮 状沉淀 ,
丝细长
蚌 肉白
尿 素 荔肉白 荔肉白
K N O : 掀粒状沉淀 ,
菌丝粗 长 , 多
抱子 囊
荔肉白 颖粒状 沉淀 ,
菌丝 细 l之
荔肉白
天 门冬素 城粒状 沉淀 ,
菌丝 粗长 , 多
抱子囊
荔肉自 絮状沉淀 , 菌
丝细长
蚌肉亡1
蛋 白 膝
补 氮 酸
N
.
D
N H
一
C I
N
.
D
0
.
4 2
未观 贫
未观 察
顺粒状沉淀 ,
菌丝粗长
顺粒状沉淀 ,
菌丝粗长
末观察
未观察
荔 肉自
N
.
D
N
.
D
未观 察
未观 察
荔肉自
无 氮 源 荔 肉自
未观察
未观察
顺较状沉淀 ,
菌丝细长
顺较状沉淀 ,
菌丝细长
荔肉白
从表 3 中可见 , 8 6 0 0 1和8 6 0 0 2菌株能利用多种有机 、 无机氮源 。 8 6 0 0 1 菌株在酪蛋 白水
解物和 N H ‘Cl为唯一氮源的培养液中生 一民最好 , 其菌体蛋白质含量为其它氮源的1 . 28 ~ 2 . 1
倍 , 在天门冬素 、硝酸钾 、尿素、 牛肉膏培养液中生 一长次之 , 8 6 0 0 2菌株在以酪蛋白水解物 、 牛
肉膏为唯一氮源的培养液中生长最好 , 其菌体蛋 白量为其它氮源的 1 . 05 一 1 . 65 倍 , 在天门冬
素 、 N H . CI、 K N O : 培养液中次之 。 8 6 0 01 和8 6 。。2菌株在蛋白陈和谷氨酸为氮源的培养液中
生长都极差 , 而在无氮源的培养液中生长 良好 , 说明此基础培养液是 良好的诱导固氮酶 。
2
.
4 pH 值对 Fr a n k la 菌生长的影晌
F r a n k ia 8 6 0 0 1和8 6 0 0 2菌株在不同的 pH 值条件下其生长结果见图 1 。 从图 1 看出这两
株菌生长所能适应的 p H 值范围较宽。 当 p H 值5 . 5 ~ 8 . 5时 , 菌株均能正常生 长 ; 当 p H 值
7
,
5时 , 菌株生长最好 , 这与大多数的 Fra n ki a 菌相一致 [ 7 ] ,
6 期 康丽华 : 两株木麻黄内生菌培养条件和培养特征的比较研究 云身亏
0
。
3 0
O 一 2 0
8 6 0 0 1
8 60 02
0
一
10
公e如、.旧),亚晰派祖
5
。
5 侣一5 7 。 5 侣。 5
PH
图 1 p H 值对 Fra n k ia 菌生长 的影响
2
.
5 N ac l 浓度对菌株生长的影晌
在 BaP 培养基中加入不 同浓度的 N acl , 菌体生长
结果见表 4 。
从表 4 中可见 , 在培养基中 加 入 N acl , 对 8 6 0 0 1
菌株生长效应是十分显著的 , 当培养基浓度为 0 . 8 %时 ,
其菌体生长量可提高 50 % , 而同样的浓度 8 6 002 菌株只
提高 7 % 。 可见 , 这两株菌 对 N acl 的反应有明显的差
异 。 在培养基中添加 N a cl 能有效地提高木麻黄内生菌
F ra n ki a 的菌体生长量 , 菌株的这种特性可 能 与宿 主
植物木麻黄耐盐碱 , 生长在海边沙滩上的生 活 属 性 有
关 。
表 4 N a c l浓度对 Fr a n k ia菌生长的影响 (单位: rn g / 7 m l)
菌 株
0
.
5 %
N a CI
0
.
7 %
浓 度
0
.
8 % 对 照
人“Žn8 60 0 1
8 60 Q2
{:;
0
.
5 5
0
.
2 0
0 7 5
0
.
3 3
0
。
4 2
0
.
2 3
3 小 结
Fr a n ki a 8 6 0 0 1和8 6 0 02 菌株最适合的碳源为丙酸纳 , 最适合的 pH 值为 7 . 5 。 在培养基
添加 N acl , 能有效地提高其菌体生长量 。 8 6 0 0 1菌株最适合的氮源为酪蛋白水解物和 N H 4CI ;
8 6 0 0 2菌株最适合的氮源为酪蛋白水解物和牛肉膏。
参 考 文 献
〔z 〕 Ca lla h a m , D . e t a l. , 1 9 7 5 , I s o la t io n a n d e u l t i v a t i o n i n v i tr o o f t he a e t i n o m y e e t e e a u s ln g r o o t
n o d u la t io n i n e o m Pt o n ia , S c i e n e e
,
1 9 9
:
8 9。~ 9 0 2 .
〔2 3 D ie m , H . D . e t a l . , 1 08 2 , I s o la t i o n o f Fr a n k i a f r o m n o d u le o o至 C a : “a r ‘。a 0 9 “‘s e t‘f o li a , C a ” .
J
.
M i
e r o b i o l
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25
: 5 2 6 ~ 5 3 0
.
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r o g e n a s e a e t i v i ty i n tw o Fr
a n k i a i s o la t e s , C a o
.
J
.
M i c r o b i o l
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3 2
:
3 5 3 一3 5 8 .
仁1飞3 S h ip t o n , W . A . e t a l . , 1 9 a2 , A e o m Pa r i so n o 至t h e r e q u ir e m e n t s fo r v a r i o u s e a r b o n a n d n i t -
r o g e n s o u r e e s a n d y 三ta m i n s i n s o m e Fr a n k i a i s o la te s , P la n t a ” d 5 0 了1 . , 6 , : 1 4 9一1 6 1 .
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亏0 0 林 业 科 学 研 究 4 卷
A r I3 g r o w n in b a te h e u lt u r e
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,
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,
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by G o rd o n
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O re g o n St a te U n iv e rs ity Pr e ss
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〔1 5〕L e e he v a l正e r , M . P . e t a l , z ga3 , Ph v s io lo g y , e h e m is t r y , s e r o lo g y a n d in fe e tiv ity o f tll e tw o
F ra n k ia iso la te s fr o m A
.
f o c a 陀a s P . r u g o s a , C 。邝
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C p li a n d A C N l a g
,
C a o J
.
B o t
.
,
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〔18 〕Z h a n g e t a l . , 1 0 5 6 , C u lt u r e e o n d itio n s in flu e n c in g g r o w th a n d n itr o g e n fix a tio n in Fr a n k ia
s p
.
H FP C c ls iso la te d fr o m C a s u a r in a
,
P l。 ”t o n d 5 0 11
.
, 9 1 : 3 ~ 1 5
.
C o o Pa r a tio e S tu d ie s o f C u lto r a l C o n d itio n s
a n d C ha r a c te r istic s o f E
n d o Ph少te
fr o m N o d u le s o f C
a su a rio a
K a n g Lih u a
(T 几。 R e se a r e h I o s t‘tu *e o f T r o p ‘c a l F o r e : rr g C A F )
A 阮tr a et T w o s t ra in s o f Fr a n k ia 8 6 0 0 1 a n d 8 6 0 0 2 , w e re is o la t e d fr o m
Ca
s u a rin a e至。i: 。tijo lia . T h e ir o Ptim um
e u ltu r a l e o n d ; t】o n s fo r g ro w t h w e r e
t e st e d
.
T he r e s u lts sho w e d th a t th e o Pt im u m m e d iu m fo r F r a n k ia 8 6 0 0 1 a n d
5 6 0 0 2 w a s B a P : th e o Pt im u m e a r be n s o u r e e so d iu m Pr o Pio n a te : t h e o Pt im u m
n itr og e n s o u r e e e a s a m in o a e ids a n d N H
一
C I fo r F r a n k ia 5 6 0 0 1 w hile fo r
Fr a n k ia 8 6 0 0 2 it w a s e a sa m in o a e id s a n d b e e f e x t r a e t
.
T h e PH r a n g e w a s
5 im ila r fo r bo th t w o Fr a n k ia s tr a in s
.
T h e m e d ia e o n ta in in g N a C I e a n p ro
-
m o te g r o w t h o f Fr a n k ia 8 6 0 0 1 a n d Fr a n k ia 8 6 0 0 2
.
K ey w o rd s C a s ua , i: a ; Fr a n k ia : e u ltu r a l e o n d it io n